新型的非甲非乙型肝炎病毒抗原多肽及诊断方法

专利名称：新型的非甲非乙型肝炎病毒抗原多肽及诊断方法
技术领域：
本发明涉及一种新颖的非甲非乙型肝炎病毒抗原及编码该抗原的多核苷酸。具体地说，本发明涉及一种对与已知的HCV抗原不发生反应的非甲非乙型肝炎患者血清显示出特异的抗原抗体反应的抗原多肽，及编码该抗原多肽的多核苷酸，及使用上述多肽、多核苷酸的非甲非乙型肝炎的诊断方法。
所谓非甲非乙型肝炎，被认为是由增长性的病毒引起的病毒性肝炎中从病毒学上、血清学上除去了实质上已明确的甲型肝炎病毒(HAV)，乙型肝炎病毒(HBV)，丁型肝炎病毒(HDV)，或感染上肝细胞呈现症状的巨细胞包涵体病毒(CMV)，Epstain-Barr病毒(EBV)腺病毒等为其病因的肝炎。根据流行病学的证据，非甲非乙型肝炎有下述三种即，在发展中国家流行的水传染型，输血后(或注射针事故)型，以及在发达国家所见到的散发性(集体获得)型。水传染型被认为起因于与其它二种类型不同的病毒，而近年来，其主要病原病毒(戊型肝炎病毒)的基因断片，由Genelabs公司(美国)和美国CDC的研究组分离到[国际公开第89/12462，89/12641号手册(1990)，Reyes，G.R.，et，al.Science247，1335(1990)]。在本说明书中，如不事先特别说明，则“非甲非乙型肝炎”不包括这个水传染型，而指由其余的输血后型及散发性型产生的肝炎。
据厚生省的推测(1988年)，输血后急性肝炎的九成以上，又散发性急性肝炎的约五成为非甲非乙型肝炎。但由此产生的肝炎其约半数转为慢性肝炎，10-20%进为肝硬变。而且，在其再向肝癌转化的过程中，也可认为，非甲非乙型肝炎病毒的持续感染及/或伴之而来的慢性炎症与之有关系。因此，对非甲非乙型肝炎病毒的预防及确立其治疗法，已成为医疗上的紧迫的需要。
对这种非甲非乙型肝炎病毒所作的鉴定，尽管已经多年的努力，仍极为困难，但进入1989年后，有二个研究组报导了对非甲非乙型肝炎特异抗原基因的分离。其一由カイロン公司(美国)研究组所作[Choo，Q-L.，et，al，Science244，359(1989)，Kuo，G.，et，al，Science244，362(1989)，特表平2-500880号公报，欧洲专利申请公开第318216号说明书(1989)，同上的欧洲专利申请公开第388232号说明书(1990)]，其另一报导由冈山大学(现鹿儿岛大学)的有马等人的小组所作[Arima，T.，et，al，Gastroentero-logiaJaponica24，685(1989)，Arima，T.，et，al，Gastroentero-logiaJaponica25，218(1990)，欧洲专利申请公开第363025号说明书(1990)]。这些基因编码的抗原(C100抗原，克隆14抗原)皆与输血后非甲非乙型慢性肝炎患者血清及散发性非甲非乙型慢性肝炎患者血清的6-8成发生特异性反应，显示出可用于非甲非乙型慢性肝炎患者的诊断。カィロン公司的小组将编码上述基因的病毒命名为丙(C)型肝炎病毒(HCV)。然而，至今尚未作过感染性病毒粒子和感染性病毒基因组的分离，尚未达到可证明作为非甲非乙型肝炎病毒的病原性。
其后，HCV核心抗原[下运野邦忠，第35届日本病毒学会，第112演讲主题]、含其表位的肽断片CP9，CP10[Okamoto，H.，etal，JapanJ.Exp.Med，60，223(1990)]及来自细胞基因的非甲非乙型肝炎相关抗原GOR[赤羽贤浩等，基础与临床24，7021(1990)]等被应用于诊断，但这些场合在非甲非乙型慢性肝炎患者血清中的测得率为7-8成，并已知道，存在着以已有的抗原无法检测到的非甲非乙型肝炎。另外，这种非甲非乙型肝炎病毒的存在也启示出，以已有的抗原是无法完全捕捉健康人HCV携带者。实际上，认为，使用已有的抗原的这种供血筛选，只能减少输血后非甲非乙型慢性肝炎的发病率50%左右[片山透，化学与生物28，217(1990)，Esteban，J.I，etal.，NEnglJMed.，323，1107(1990)]。
以这些已知的抗原无法测定的非甲非乙型肝炎之所以存在的原因是否在于(1)来源于HCV的变异性(虽然已知HCV为变异性极高的病毒[Enomoto，N.，etal.，BBRC.170，1021(1990)，金子周一等，肝脏31 Suppl.213(1990)，加藤宣之等，肝脏31Suppl.214(1990)]，但尚不确定，所有这些病毒是否具有共同的表位(抗原决定簇)。);
(2)是否存在引起同样症状的其它病毒;
(3)因检查方法不正确而引起。
关于这些，尚不十分清楚。
关于如上所述有关抗原(即对开发对应于非甲非乙型肝炎的、可靠性高的诊断法及治疗手段上有用的抗原)鉴定的研究，现在尚未充分完成。本发明者们为开发对非甲非乙型肝炎的百分之百的确切诊断方法及预防法，发现能诊断以已知的抗原无法检测的非甲非乙型肝炎患者的新型抗原而作了刻苦研究。其结果，由日本人的人血浆取得了新型的非甲非乙型肝炎病毒抗原的基因。在决定其基因的碱基序列时，发现它是来自具有与已报导的HCV的碱基序列(公报，欧洲专利申请公开第388232号说明书(1990)

图17上所示的碱基序列第5725号到第6239号)为同源(系、种)的新型的非甲非乙型肝炎病毒的抗原，而完成了本发明。
本申请中所用的多核苷酸即指具任意长度的核苷酸(核糖核苷或脱氧核糖核苷)的多聚物。又，该用语中包含其单链和双链的两种形态。
“表位”(エピト一プ)这一用语意指多肽的抗原决定簇。表位也可由位于在表位上特有的构象内的3个氨基酸形成，但一般至少由5-10个氨基酸构成。
所谓“非甲非乙型肝炎相关抗原”，即指可诊断除本发明的抗原以外的非甲非乙型肝炎的抗原，其包含来自病毒基因组及细胞基因的两方面的抗原(例如，Y19抗原，Y22抗原，C100抗原，核心抗原，克隆14抗原，GOR抗原等)。
所谓“非甲非乙型肝炎病毒抗原”指，在与非甲非乙型肝炎相关的抗原中来自该病毒基因组的抗原。
在本发明的实施中，如无特别指明，即采用在该领域内公知的分子生物学、微生物学、遗传工程学、及免疫学的已知方法。这些方法可参照下述的实验书实验书1Sambrook.J.，Fritsch，E.F.及Maniatis，T.MolecularCloning2ndEd;ColdSpringHarbor(1989)实验书2DNAcloning1卷(Glover，D.M.编)IRLPress.(1985)实验书3DNACloning3卷(Glover，D.M.编)IRLPress.(1987)实验书4Handbookofexperimentalimmunology，4thed.Ⅰ-Ⅳ卷(Weir，D.M.编)，Black-well(1986)实验书5CurrentProtocolsinMolecularBiology(Ausubel，F.M.etal.，编)JohnWiley&Sons(1988)实验书6MethodinEnzymelogy185卷(Goedd-el，D.V.编)AcademicPress(1990)(1)病毒RNA的制备a)来自患者血清的RNA的制备将显示乙肝表面抗原(HBS)阴性，乙肝病毒DNA阴性，高谷丙转氨酶(ALT，GPT)活性值(＞351μ/l)的人血浆或非甲非乙型肝炎患者血清混合，作为用于制备病毒RNA的起始材料。病毒粒子由聚乙二醇沉淀法取得沉淀物加以浓缩回收，从沉淀物中提取RNA是用硫氰酸胍(グァニジン·チオシァネ一ト)等方法[Chom-czynski，P.ardSacchi，N.AnalyticalBiochemistry162，159(1987)]进行。
此外，也可不用人血浆或血清而使用感染了非甲非乙型肝炎病毒的黑猩猩血清，但由于一般将病毒在异种动物上传代时，在病毒基因上会发生变异，或有时其病原性发生变化，所以在对该抗原作克隆化的场合，最好用人血浆或血清作为起始材料。
b)来自患者肝组织的RNA的制备从被认为过去感染过非甲非乙型肝炎的肝癌患者身上切除肝组织，由此切除的肝组织，可由常法[实验书1，7章]制备RNA。
(2)cDNA库的构筑将所得RNA作为模板，ラングムヘキサマ一作为引物，用Gubler-Hoffman法[Gene，25，263(1983)]合成双链cDNA。由常法将该cDNA插入λgtll噬菌体。
λgtll是为分离对应于特定抗体的抗原的基因而开发出来的载体，是已知的[Young.，R.A.andDavis，R.W.，Proc，Natl.A-cad.Sci.USA 80，1194(1983)，实验书2，P49-78]。又，除λgtll之外，也可使用λZAP，λZAPⅡ，pUC19，pUEXI等载体。
(3)从患者血清所作cDNA库的免疫筛选使重组子λgtll感染宿主大肠杆菌(例如Y1090株)，在一定的条件下，该重组子随噬菌体的增殖机理而增殖，先前组合的cDNA也随之增大。增殖的噬菌体在一定的条件下溶蚀宿主大肠杆菌，形成肉眼可识别的噬菌斑。由于插入λgtll噬菌体的cDNA是作为与β-半乳糖苷酶(β-gal)的融合多肽而被发现，如用对于特定的抗原产生的特异的抗血清筛选重组子λgtll，则可以用免疫化学方法鉴定编码特定的抗原多肽的cDNA。在本发明中，最好用各种非甲非乙型肝炎患者的血清或其混合血清筛选在上述(2)中所制的cDNA库(ライブリ一)。具体地说，将从形成噬菌斑的培养皿等中发现的融合抗原蛋白转移至硝酸纤维膜上，用上述的患者血清作为第一抗体反应，使过氧化物酶标记的山羊抗(人IgG)IgG等作为第二抗体与之反应，分离显色反应为阳性的空斑。
(4)cDNA序列的决定如此所得的本发明的抗原基因的碱基序列，可在重组子λgtllDNA上，及在再克隆(サフクロニ一ンダ)后的质粒载体DNA上，使用应用了Sanger法[Sanger，F.，etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，74，5463(1977)，实验书1，13章]的市售的シ一クエンス试剂盒来确定。
(5)利用抗原基因的碱基序列检测患者血清中的该病毒基因组的检测法由来自于本发明的非甲非乙型肝炎病毒多核苷酸的互补链的连续的8个碱基或8个以上的长度组成的多核苷酸与本发明的病毒基因组杂交，可用作测定血清及组织中的该病毒的探针。这些多核苷酸可用磷酰胺酶法[Hunkapiller，M.et.al.Nature310，105-111(1984)]等的合成法，或市售的DNA合成机(例如，スプライドベイオシスラムズ(ABI)，380A型DNA合成机等)合成。另外，也可以将本发明的非甲非乙型肝炎病毒多核苷酸作为模板，进行ニツクトランスレ一ショソ法，ラソダムプライマ一ラペリンダ法合成。在将该多核苷酸用于诊断时，可由通常方法作为放射性探针，生物素(ピオ一チン)荧光探针，以及化学发光探针等的标记探针加以使用，但上述的杂交法，标记法及信号的放大、检测方法皆为公知的方法，可参照高桥丰三，DNA，探针Ⅱ，羧甲基纤维素(CMC)(1990)实施。
迄今为止，已知非甲非乙型肝炎病毒只以极微量存在于患者血清中(为乙型肝炎病毒存在场合的1/105程度)。在这种场合，利用本发明的碱基序列的一部分，合成1对或2对以上的多聚酶链反应(PCR)用引物对，进行逆转录-PCR法[Kawasaki，E.S.et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，56 98(1988)，Garson，J.A.et al.，Lancet，335，1419(1990)，Enomoto，N，et al，BBR C，170，1021(1990)，Okamoto，H，et，al.，Japan J.Exp.Med.，60，215(1990)]，从而也可放大后检测出靶病毒基因组。
(6)非甲非乙型肝炎病毒抗原多肽及融合抗原多肽的制备。
a)应用基因重组技术的重组抗原多肽及重组融合抗原多肽的发现构成该抗原多肽及其表位的多肽与包含这些多肽的融合抗原多肽可用公知的表达载体表达出来。例如，在大肠杆菌上的表达可参考实验书1的第17章、实验书3，P59-88、实验书6，P11-128，Tabor，S.andRichardson，C.C.，P.N.A.S.82，1074(1985)等而进行。在表达大肠杆菌上本发明的多肽时，在N末端添加上从启动子来的甲硫氨酸(Met)。而在构筑表达载体时，根据所用的限制酶部位，有时从载体来的氨基酸会添加在该多肽的N末端(例如MetAla)。上述两种情况中任一种，只要对伴随着添加的非甲非乙型肝炎患者抗体的反应性不变，就可包含在本发明的非甲非乙型肝炎病毒抗原中。在酵母上的表达可参考实验书3，P141-161、实验书6，P231-484，在以哺乳动物细胞作宿主时的表达方法，可参考实验书1的第16章、实验书3，P163-212、实验书6，P485-598等进行实施。表达的重组抗原多肽可利用本领域中公知的蛋白精制方法(超滤、离心分离、透析、离子交换色谱法、疏水色谱法、凝胶过滤、电泳、亲和色谱法、HPLC等，例如参照MethodsinEnzymology182卷(Deutscher，M.P.编)，AcademicPress(1990)等)，从溶解的细胞或培养基中进行精制。融合抗原多肽的简便表达方法有诸如将本发明的重组体λgtll克隆Y30溶原化的大肠杆菌Y1089株加IPTG(异丙基硫代-β-半乳糖苷)进行诱导的方法[实验书2，P76-77]。可用凝胶过滤法和/或用小鼠抗β-半乳糖苷(β-gal)单克隆抗体(ベ一リンガ一マンハイム，1083104)的免疫沉淀法或亲和色谱法及上述方法精制显示的融合抗原多肽。
b)通过肽合成制备本抗原多肽本抗原多肽可以本发明中确定的氨基酸序列为基础用化学合成法提供。较好地为，可将全序列切割合成较容易的长度的片断(10-50个残基)且使相邻片断之间为5-10个残基重复，并将得到的全部序列混合起来使用。更好地为，如果按表位图指定一个或几个表位，也可将此片断单独或几个混合起来使用。
含本抗原多肽的氨基酸序列的各种多肽可用液相法或固相法，手动地或用自动合成装置(如ABI社的430A型肽合成机)进行化学合成。按t-Boc法或Fmoc法，用固相法合成的多肽可以三氟甲磺酸、氟化氢或三氟醋酸等从树脂上洗脱下来。为了提高纯度，可将这些合成的肽用分取用反相高效液相色谱法(HPLC)精制。
(7)用免疫学测定法检测患者血清中的病毒抗体为了检测诸如血液、血浆、血清、脑脊液等体液试样及含人免疫球蛋白制剂等的生物学试样中的非甲非乙型肝炎病毒抗体的存在，可使用本发明所得的非甲非乙型肝炎病毒抗原多肽或含其表位的抗原多肽，用免疫学测定法进行测定。用免疫学测定法，在上述抗原多肽与试样中非甲非乙型肝炎病毒抗体之间可形成免疫学结合体(抗原抗体结合物)的条件下，使本抗原多肽与试样接触。抗原抗体结合物即便仅形成少许，即可表明试样中存在非甲非乙型肝炎病毒抗体，可用适当的手段检出和测定。
这样的检出方法有免疫沉淀法、凝集法、放射免疫测定法(RIA)、酶免疫法(EIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、蛋白印迹测定法或结合免疫测定法等。特别是用本抗原多肽的ァツセイプロトコ一ル，也可用竞争性或非竞争性结合的方法。
最简便的方法为例如将本发明所得的抗原以与β-gal形成融合蛋白的形式而表达，在硝基纤维素膜上形成的斑点作为在固相上固定的抗原，用ELISA法检出非甲非乙型肝炎病毒抗体(免疫斑点检定、蛋白印迹检定等)(实施例4)。
本抗原多肽也可用相应检测方法的标记物标记。与多肽结合的标记物可用公知的物质，如荧光分子、发光色素分子、放射性分子、酶、辅助因子、生物素、抗生物素蛋白、胶体金、磁性粒子等。此外，若对抗原多肽作化学修饰，可用公知的手段，在载体蛋白、载体多肽等或公知的支持物上进行结合。象这样的支持物，也可用诸如聚苯乙烯、聚乙烯等制的微量滴定板和珠等、玻璃管和玻璃珠、及纸、纤维素、纤维素衍生物和硅胶等色谱法用的支持物。
这些测定法中，特别在大规模筛选患者血清与血液或血液制品等时，以ELISA、凝集法及蛋白印迹检定法等为宜。
本发明的抗原多肽在检出用以往的抗原检查法不能检出的新的抗非甲非乙型肝炎病毒抗体上是有用的。即本抗原多肽在用已有抗原不能诊断出的与非甲非乙型肝炎有关的疾病的诊断上，及治疗方针的确定和流行病学调查上是有用的。
同时，本抗原多肽能捕捉用已有抗原不能检出的非甲非乙型肝炎病毒健康携带者，对供血的筛选有用。
用本发明的抗原多肽，还可测定混有非甲非乙型肝炎相关抗原多肽的混合抗原与生物学试样中存在的非甲非乙型肝炎病毒抗体反应形成的免疫学结合物，检出可确认生物学试样中非甲非乙型肝炎病毒抗体存在的非甲非乙型肝炎病毒抗体。
还可按测定免疫学结合物的ELISA法，检出非甲非乙型肝炎病毒抗体。
又可制成分析抗原多肽Y30群抗体存在的药盒，即在适当的容器内，含有抗原多肽Y30群或具有与Y30群中所含抗原多肽表位在免疫学上可视为同一表位的抗原多肽。
而且，用本发明的多核苷酸探针，还可采用杂交法检出来自非甲非乙型肝炎病毒的多核苷酸。
用本发明的多核苷酸引物，还可采用逆转录-PCR法检出来自非甲非乙型肝炎病毒的多核苷酸。
此外，利用本抗原多肽可制备在该病毒抗原的检出与非甲非乙型肝炎的治疗上可利用的多克隆抗体和单克隆抗体。本抗原多肽还可用于制备预防病毒感染和感染后治疗用的疫苗。
本发明的非甲非乙型肝炎病毒多肽作为制造该抗原的基因是有用的，而且可用于检出在用已知检测法的检测灵敏度不能测定的病毒基因组(粒子)。
以下举出实施例更具体地说明本发明，然而这些实施例并非对本发明的限制。
实施例1为制备cDNA而提取血浆RNA在谷丙转氨酶(ALT)活性值异常高(＞701μ/l)的情况下，将HBs抗原和HBV-DNA阴性的冻干血浆2000ml在室温下融化后，于4℃下，5000rpm(日立，RPR9-2转子)离心20分钟，除去纤维蛋白。在上清液中加入80g聚乙二醇4000，使其溶解。冷却30分钟后，在同样的条件下离心，回收沉淀物。从沉淀物中提取RNA是用硫氰酸胍按AGPC法进行的[Chomczynski，P.&Sacchi，N.AnalyticalBiochemistry，162，156(1987)]。即将沉淀物在2倍量(1g沉淀物换算或1ml)的6D溶液(6M硫氰酸胍、25mM苦味酸钠pH7.0、0.5%サルコシ一ル、0.1M2-巯基乙醇)中溶解后，加入0.1容量的2M醋酸钠(pH4.0)，接着用等容量的苯酚、0.2容量的氯仿∶异戊醇混合液(49∶1)进行提取。用冰冷却15分钟后，离心分取上层，加入等量的异丙醇，使RNA沉淀。离心后，用0.5ml4D溶液(4M硫氰酸胍、25mM苦味酸钠pH7.0、0.5%サルコシ一ル、0.1M2-巯基乙醇)溶解沉淀物后，添加2倍容量的乙醇，再次沉淀RNA。离心后，用75%乙醇洗净沉淀物，使其干燥。沉淀物溶解在50μl灭菌蒸馏水中，即为RNA溶液。
实施例2cDNA库的制备以10μlRNA溶液作为起始材料进行cDNA合成。从RNA制备双链cDNA是用市售cDNA合成系统。Plus(ァマシセム，RPN-1256Z)进行的。从RNA到单链cDNA的变换率为约2%，从单链cDNA到双链cDNA的变换率为约100%。合成后的双链cDNA用乙醇沉淀后，在100μlTE溶液(10mM Tris-Cl，pH8.0，1mMEDTA)中溶解。接着用市售cDNA合成药盒(ファルマシァLKB，27-9260-01)进行如下反应。将cDNA溶液通过药盒中所附的Sephacryl S-300スパン柱，从而在1×T4连接酶溶液中进行缓冲液交换(1×T4リガ一ゼ溶液パツファ一交换
行つた)。接着按说明书进行EcoRI插入物的添加反应与T4激酶反应。与cDNA不结合的插入物，用Sephacryl S-300スパン柱除去。溶出液中的cDNA与5μg转运tRNA一起进行乙醇沉淀。沉淀物用75%乙醇洗净后风干。
接着用市售的cDNA克隆化系统按λgtll插入法(ァマシセム，RPN1280)进行如下反应。在沉淀物中加入5μl灭菌蒸馏水、4μl(2μg)的λgtllEcoRIァ一ム、1μlL/K缓冲液，使其溶解后，加入1μl(2.5u)T4连接酶，于15℃下放置一夜。然后，用GIGAPACKⅡGoldλDNA装配(ペツケ一ヅンヴ)药盒(Stratagene，200216)进行上述反应物(含重组λgtllDNA)的体外装配(ペツク一ヅング)反应，制成cDNA库(Lot.B)。
实施例3通过非甲非乙型肝炎病毒抗原基因的免疫筛选进行克隆化cDNA库(Lot.B)中的空斑与第一抗体和第二抗体的反应按市售的ス一ペ一筛选-免疫筛选方法进行。在免疫筛选中使用的第一抗体即将非甲非乙型肝炎患者的混合血清(5名急性肝炎恢复期与5名慢性肝炎)用大肠杆菌溶解产物(バイオ·ラツド，17-3205)吸收(2mg溶解产物/ml血清)，所得到的溶液用溶液A(10mMTris-Cl，pH7.5，150mMNaCl，2%(W/VBSA)稀释20倍加以使用。对于第二抗体，是将过氧化物酶标记的山羊抗(人IgG)IgG(カツプル3201-0081)稀释500倍而使用的。显色反应是用市售的ラムダ·リフト药盒GAR-HRP(バイオ·ラツド17-3566)进行的。
从约500，000个空斑分离出10个阳性空斑(在硝酸纤维素薄膜上呈青紫色)。将其中1个克隆命名为Y30，继续以下的解析。
实施例4克隆Y30的抗原特异性试验a)免疫空斑试验将Y30克隆与阴性克隆(λgtll亲株)以2∶8比例混合，混合物作平皿接种，用上述免疫筛选法，观察与C100抗体、Y19抗体[抗来自HCVNS3的Y19抗原(1989年7月24日申请，申请号2-195735的抗体]、CP9+CP10抗体均为阴性的非甲非乙型慢性肝炎患者血清(5名)、非甲非乙型肝硬化患者血清(5名)及健康对照者血清(6名)的反应性。其结果，克隆Y30显示出对现有HCV抗原不起反应的非甲非乙型慢性肝炎患者血清及肝硬化患者血清发生特异性的反应(表1)。即在对已有HCV抗原不起反应的非甲非乙型肝炎患者血清中已确认克隆Y30对免疫学上识别的抗原起编码作用。
表1N阳性率非甲非乙型慢性肝炎53/5非甲非乙型肝硬化54/5健康对照者60/6ALT高值供血206/20而且，克隆Y30对ALT异常高值(35IU/L以上)的供血中C100抗体、Y19抗体、CP9+CP10抗体全阴性的20例检样中6例起反应。
实施例5来自克隆Y30的cDNA碱基序列及该序列内编码抗原多肽序列的确定将克隆Y30按实验书记载的平板溶胞液(プレ一ライゼ一ト)法增殖后制备噬菌体DNA。将5μg噬菌体DNA用EcoRI消化后，进行苯酚提取，接着用乙醇沉淀。用碱性磷酸酶处理消化物，然后用T4激酶和γ32P-ATP作5′末端标记。经苯酚提取和乙醇沉淀精制DNA片断后，进行5.0%聚丙烯酰胺凝胶电泳，经放射自显影检出用EcoRI消化切下的cDNA的长度。其结果，cDNA的大小为约510个碱基对。
然后，将上述EcoRI消化物与EcoRI消化后脱磷酸化的pTZ19(ファルマシァLKB，27-4986-01)进行连接酶催化反应。将反应液用JM109(宝酒造，9052)进行转染，分离出具有约510个碱基的插入物的质粒(命名为pTZ19-Y30)。在此pTZ19-Y30中插入的cDNA碱基序列可用7-deazaSequenaseVersion2.0药盒(东洋纺US70777)进行序列反应而加以确定。在确定时，可用M13引物M4(宝酒造，3832)、M13引物RV(宝酒造，3830)及4种合成的引物，对双链读码，从而确定碱基序列。为了确认已确定的序列上哪一条链在重组λgtll上与β-gal蛋白形成融合蛋白有关，以噬菌体DNA为直板模板，用λgtllRcoRI部位引物正向、反向(NewEnglandBiolabs，1218，1222)来确定碱基序列。基于这些结果，在非甲非乙型肝炎患者血清中编码特异反应性抗原的碱基序列及抗原的氨基酸序列确定如下。
碱基序列
氨基酸序列
(上式中，X为N末端氢原子、MetAla或Ala。)
权利要求
1.以下述氨基酸序列表示的非甲非乙型肝炎病毒抗原多肽Y30群N-X Gly Glu Gly Ala Val Gln Trp Met Asn Arg Leu Ile Ala Phe Ala SerArg Gly Asn His Val Ala Pro Thr His Tyr Val Ala Glu Ser Asp Ala SerLeu Arg Val Thr Gln Ile Leu Ser Ser Leu Thr Ile Thr Ser Leu Leu ArgArg Leu His Ala Trp Ile Thr Glu Asp Cys Pro Val Pro Cys Ser Gly SerTrp Leu Gln Asp Ile Trp Asp Trp Val Cys Ser Ile Leu Thr Asp Phe LysAsn Trp Leu Ser Ser Lys Leu Phe Pro Lys Mel Pro Gly Lew Pro Phe IleSer Cys Gln Lys Gly Tyr Arg Gly Val Trp Ala Gly Thr Gly Val Met ThrThr Arg Cys Pro Cys Gly Ala Asn Ile Ser Gly His Val Arg Met Gly ThrMel Lys Ile Thr Gly Pro Lys Thr Cys Leu Asn Leu Trp Gln Gly Thr PhePro Ile Asn Cys Tyr Thr Glu Gly Pro Cys Val Pro Lys Pro Pro Pro AsnTyr Lys Thr-C上式中，X表示N末端为氢原子，Met Ala或Ala。
2.含有5个以上如权利要求1所述的氨基酸序列的抗原多肽，其特征在于，该抗原多肽具有与权利要求1所述的抗原多肽中所含的表位在免疫学上可视为同一的表位。
3.如权利要求1或2所述的抗原多肽，其特征在于，由化学方法合成。
4.一种融合抗原多肽，其特征在于，具有权利要求1或2所述的氨基酸序列。
5.如权利要求4所述的融合抗原多肽，其特征在于，抗原多肽与β-半乳糖苷酶(β-gal)融合。
6.一种如权利要求5所述的融合抗原多肽的重组子入gtll克隆Y30。
7.一种编码如权利要求1、2、4或5所述的抗原或融合抗原多肽的多核苷酸。
8.一种以下述碱基序列所示的非甲非乙型肝炎病毒多核苷酸
9.一种用于检测来自于非甲非乙型肝炎病毒的多核苷酸的多核苷酸探针，其特征在于，该多核苷酸探针由来自于权利要求8所述的互补链的序列的、连续8个碱基，或8个以上碱基的长度组成。
10.一种用于以逆转录-PCR法检测来自非甲非乙型肝炎病毒的多核苷酸的多核苷酸引物对，其特征在于，该多核苷酸引物对由来自于权利要求8所述的序列及其互补链的连续8个碱基或8个以上碱基的长度所组成。
11.一种抗原多肽的产生方法，其特征在于，在表达该多肽的条件下，培养以编码如权利要求1、2、3、4或5所述的抗原或融合抗原多肽的重组子表达载体作形态转换的宿主细胞。
12.如权利要求11所述的产生方法，其特征在于，上述表达载体为大肠杆菌用表达载体，且，上述宿主为大肠杆菌。
13.一种根据权利要求11或12所述的产生方法产生的重组抗原多肽。
14.一种非甲非乙型肝炎病毒抗体的检测方法，其特征在于，测定由如权利要求1、2、3、4、5或13所述的抗原多肽和生物学试样中存在的非甲非乙型病毒抗体的反应而形成的免疫学上的结合物，确认生物学试样中非甲非乙型肝炎病毒抗体的存在。
15.一种非甲非乙型肝炎病毒抗体的检测方法，其特征在于，测定由在权利要求1、2、3、4、5或13所述的抗原多肽中混合非甲非乙型肝炎相关抗原多肽的混合抗原和生物学试样中存在的非甲非乙型肝炎病毒抗体的反应而形成的免疫学结合物，确认生物学试样中的非甲非乙型肝炎病毒抗体的存在。
16.如权利要求14或15所述的检测方法，其特征在于，测定免疫学结合物的方法为ELISA法。
17.一种用于分析抗原多肽Y30群的抗体的存在的试剂盒，该试剂盒在一适当的容器内，含有一抗原多肽，该抗原多肽具有可被看作在免疫学上与抗原多肽Y30群或含于Y30群的抗原多肽的表位相同的表位。
18.一种以杂交方法，使用权利要求9所述的多核苷酸探针，检测来自非甲非乙型肝炎病毒的多核苷酸的方法。
19.一种以逆转录-PCR法，使用权利要求10所述的多核苷酸引物对，检测来自非甲非乙型肝炎病毒的多核苷酸的方法。
全文摘要
一种新型的非甲非乙型肝炎病毒抗原多肽，编码该抗原多肽的多核苷酸，及使用该多肽及多核苷酸诊断非甲非乙型肝炎的方法。本发明对于已有的检查方法无法检测的新型的非甲非乙型肝炎病毒的抗体的检测是有用的。
文档编号G01N33/576GK1068893SQ92103088
公开日1993年2月10日 申请日期1992年4月25日 优先权日1991年4月26日
发明者清永保明, 今井刚, 石田纯子, 有马晖胜 申请人:山之内制药株式会社, 有马晖胜