专利名称：蛋白制品中利凡诺残留量的检测方法
技术领域：
本发明涉及的是一种以分光光度法为基础对蛋白制品，特别是白蛋白制品中利凡诺残留含量的检测方法。
各种蛋白制品在医疗中是被大量使用的。采用利凡诺法分离制备蛋白制品，尤其是各种白蛋白制品，简单、方便、收率高，并可对废血加以有效利用。但由于其所用的利凡诺为对人体有一定毒性的吖啶类化合物，因此对利凡诺在蛋白制品中残留量的检测和控制长期以来一直为人们所关注，并为探索更简单、准确的理想检测方法仍在不断努力。其重要的原因之一就在于对蛋白制品中利凡诺含量检测的困难除其本身性质不稳定，受光照极易分解外，主要还在于其残留量已属于极低的痕量范围，制品中的大量蛋白成分对检测的干扰影响大，因而难于准确定量检测。例如在目前对蛋白制品中利凡诺残留量的各种检测方法中，《药学通报》1985(8)中介绍了醚提-紫外荧光法;《输血及血液》1977(1)介绍了乙醇沉淀-比色法等方法，其共同之处在于均需先从制品中分离提取出利凡诺，以排除蛋白成分的干扰。这种分离操作除费时、烦琐外，对含量本已极微的利凡诺而言其检测误差的影响是显然的，因而检测的重复性差，均属限量检测。《分析测试通报》1989.8(6)中介绍了一种荧光比色法，属于目视比色，检测的准确性会受人员、环境等因素影响，属半定量的分析方法。日本《药学杂志》Vol.97(1977)介绍的快速液相层析法，以及其它如荧光分光光度法等方法除需用专门仪器外，也同样要有为消除蛋白成分干扰影响的分离操作。
分光光度法是一种可用于定量的常用检测方法。但由此类蛋白制品的普通分光光度吸收光谱可见，虽然在269.5及364nm等波长处利凡诺均可有较大的吸收，但蛋白成分同时也存在较大的干扰吸收，因此无法直接进行定量检测。近年来以分光光度法为基础发展起来的导数分光光度法由于在处理多组分和/或强弱吸收相互重叠及消除背景干扰等方面具有的独特优点，正在被深入研究并在迅速发展。
本发明的目的在于提供一种采用导数分光光度法原理对蛋白制品中利凡诺残留量的检测方法。
由导数分光光度法的特性可知，随着被测对象中各组分之间的相互影响不同，可以选用适合的不同阶数的导数分光光谱进行分析，并且各阶导数的分光光谱曲线的振幅D与被测组分的浓度C之间总存在某种正比关系的函数D＝f(C)，因而可用于定量检测分析。由利凡诺及蛋白成分通常的分光吸收光谱(即零阶导数光谱)可以看出，在利凡诺有较大吸收峰的330～390nm波长范围内，蛋白成分的吸收曲线基本呈线性(如
图1)，因此本发明方法确定选用此波长范围的一阶导数分光光度法进行检测。由此波长范围内的相应一阶导数分光光谱(如图2)可见，在利凡诺谱线的一个振幅范围内，蛋白成分的谱线可有一段呈直线的区间，且一般多呈与零线趋于平行的状态，此段波长区间即为本发明方法所依赖的基础。首先用蛋白对照液精密配制利凡诺不同含量的混合标准品，并分别测绘出其330～390nm波长范围内的一阶导数的分光光谱。在各光谱的上述蛋白成分一阶光谱呈直线，且最好为趋于与零线相平行的波长区间内任意选定两个波长λ1和λ2，并应使在各混合标准品的光谱上所选定的λ1和λ2分别保持一致。由与各混合标准品的利凡诺导数光谱中的λ1和λ2相对应的△A1和△A2之差值D及该光谱所示的利凡诺含量C即可得到表示其D＝f(C)关系的回归方程D＝aC+b。此时将待测蛋白制品在同样条件下的该λ1和λ2处的相应△A1和△A2之差值D代入该回归方程，即可定量检测出该制品中的利凡诺残留含量。
选择上述λ1和λ2时，在可能的情况下尽量增大其间的波长距离将有利于提高检测精确度。考虑到各种条件及不同仪器间的差别，实验发现该波长以λ1＝361±4和λ2＝372±4(nm)为好。
在导数分光光度法中，选用不同的波长间隔△λ所得的导数光谱对检测结果是有影响的。减小△λ可使分辨率提高，但灵敏度会相应下降，反之，△λ增大，则分辨率虽变小，但灵敏度提高。例如对本发明上述方法用△λ分别为2、3、4nm的导数光谱进行考察，结果见表1。由此可见，在本发明方法中以△λ＝3nm为佳。
由上述内容可知，在本发明方法中由选定的△λ所确定的具体导数光谱及在光谱中确定了波长λ1和λ2后，无论是由混合标准品确定回归方程，还是使用该回归方程以求得待测制品中利凡诺的残留量，都离不开在该混合标准品或待测制品中与利凡诺一阶导数光谱中的λ1和λ2相对应的△A1和△A2值。而一旦△λ及λ1和λ2被选定后，此△A1和△A2虽然在自记式分光光度仪器上可直接由其一阶导数光谱中得到，但为进一步方便和简化操作，也可直接在该混合标准品或待测制品的通常分光光度吸收光谱(即零阶导数光谱)上，分别以λ1和λ2为所选定的△λ的中间波长，由该△λ各自两端点波长处的吸收值A之差得到相应的△A。
由此不难看出，本发明的上述方法除快速、简单和对仪器无特殊要求外，最大优点就在于对制品无需作任何分离而直接检测，无疑减少了操作误差，有利于提高检测精度。用精密称取105℃干燥的利凡诺标准品配制成含量分别为1、2、3、4、5μg/ml的150个样品对本发明方法作回收率试验，平均回收率99.45%，总变异系数为3.27%。并且本发明方法检测结果的重现性好，对5批共25个样品分别在不同时间重复测定，其结果的平均一致率为97.17%，变异系数为2.67%。对不同检测条件的试验还表明，待测制品中的蛋白成分浓度及pH值的改变均不致影响检测结果，例如在白蛋白制品中蛋白浓度在5-20%范围内的变化对本发明方法的检测结果几无影响，(P＞0.01);在制品允许的pH6.40～7.40范围内的pH改变对检测结果也无显著影响(P＞0.05)。另一方面，由于此类制品中利凡诺的存在形式为游离和与蛋白形成结合物的共存状态，为此将配制的白蛋白溶液、利凡诺溶液以及其混合溶液分别用超滤法过滤并分别对其超滤前后的试液用本发明方法进行检测，结果表明本发明方法对各种状态形式存在的利凡诺均可准确测定，即对制品的检测结果为各种存在形式的利凡诺之总和含量。这更进一步表明了本发明方法是对蛋白制品中微量存在的利凡诺的一种稳定、可靠和准确的理想定量检测方法。
以下介绍作为本发明上述方法的实例。
例1将25%的白蛋白对照品(成都生物制品研究所用低温乙醇法生产，不含利凡诺，质量符合卫生部标准)和利凡诺标准品(mp.245℃，Sigma公司生产)分别配成适当浓度，以蒸馏水为空白，用PyeUnicamSP8-100型分光光度计(英国)在320～440nm波长范围内扫描，得到如图1的普通吸收光谱，其中1为利凡诺吸收曲线，2为白蛋白吸收曲线。同时再用波长间隔△λ＝3nm得到相应的一阶导数分光光谱如图2。由在图2导数光谱中蛋白谱线呈直线段区间内蛋白谱线上各点的△A值之差比较后确知在360～374nm范围内该蛋白谱线与零线基本平行，并选定其有最大波长距离的λ1＝361.5nm和λ2＝372.5nm。
用上述白蛋白对照品和利凡诺标准品精密配制成利凡诺含量分别为1、2、3、4、5μg/ml的混合标准品溶液，并分别测绘其普通分光光度吸收光谱，在△λ＝3nm前提下，分别以上述λ1和λ2为中间波长，取360和363nm及371和374nm处相应的吸收值得到△A1＝A363-A360和△A2＝A374-A371，由各混合标准液的利凡诺浓度C和相应图谱中的D＝△A1-△A2得到D＝f(C)的回归方程D＝0.263C-0.241(相关系数r＝0.9990)。除此方法外，所说的△A1和△A2也可由各混合标准品溶液的一阶导数光谱(△λ＝3nm)(如图3，为岛当UV-250型分光光度计自动重复扫描，其所示相同状态下的各λ值均相差1nm)中的λ1和λ2直接得到。另取上述利凡诺标准品精密配制成含量分别为1、2、3、4、5、μg/ml的样品5组共150个，(每组30个样品)用此回归方程作回收率试验，结果见表2。
将含有残留利凡诺的待测白蛋白制品的样品用上述同样方法和条件制备的如图1的普通吸收光谱或如图2、图3的一阶导数光谱，并由其同样λ1和λ2处的△A1和△A2所得的D值代入上述回归方程即可得知该制品中的利凡诺残留含量。用此方法对三批待测样品中利凡诺残留量的检测结果与用乙醇沉淀-可见光(λ＝410nm)比色法(对照方法)检测结果的比较见表3。二者结果间略有差别，分析原因可能为对照方法的分离操作的损失或微量蛋白干扰和/或对络合状态利凡诺的检测等误差所致。
由于利凡诺的易光解性，所以本发明方法操作时也应注意避光。
例2各标准品及其配制同例1，并用同样方法在岛津UV-120-02型分光光度仪用λ1＝360.5、λ2＝371.5(nm)及△λ＝3nm的相应△A值可得到另一回归方程D＝0.002455C+0.00275，相关系数r＝0.9996。用此回归方程作回收率试验，平均回收率(n＝15)99.594%，变异系数1.8187%，检测效果满意。
表权利要求
1.一种以分光光度法为基础对蛋白制品中利凡诺残留量的检测方法，其特征在于先用蛋白对照液精密配制利凡诺不同含量的混合标准品，并分别测绘其一阶导数分光光谱，在各光谱图的330～390nm波长范围内蛋白成分谱线呈直线段的区间中任意选定一同一波长λ1和另一同一波长λ2，由各混合标准品利凡诺导数光谱中与λ1和λ2相对应的△A1和△A2之差值D及该光谱所示的利凡诺的含量C得到D=f(C)的回归方程D=aC+b，然后将待测蛋白制品在同样条件下得到的该λ1和λ2波长处的相应△A1和△A2之差值D代入上述回归方程，即可得到其中所含利凡诺的残留量。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所说的在波长λ1与λ2所在区间内的蛋白成分一阶导数分光光谱线以与零线趋于平行的直线形式为好。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所说的测绘各导数分光光谱及与所使用的各△A相对应的波长间隔均为△λ＝3nm。
4.如权利要求1至3之一所述的方法，其特征在于所说的波长λ1和λ2分别为361±4和372±4(nm)。
5.如权利要求1至3之一所述的方法，其特征在于所说的波长λ1和λ2由各混合标准品的导数光谱确定后，与各混合标准品及待测制品的利凡诺导数光谱上在λ1和λ2处相应的△A1和△A2可以在其各自相应的普通分光光度吸收光谱中分别以λ1和λ2为该导数光谱所用波长间隔△λ的中间波长时该△λ的两端点波长处相应的吸收值A之差得到。
全文摘要
本发明涉及的是用一阶导数分光光度法检测蛋白制品中利凡诺残留量的方法。先用蛋白对照液精密配制不同利凡诺含量的混合标准品并测绘其一阶导数分光光谱，在其中蛋白谱线呈直线段的区间内任选两波长，由与此两波长相对应的利凡诺谱线上的ΔA之差值D及该标准品利凡诺含量C得到回归方程D＝aC+b，将待测制品以同样条件和方法所得的D值代入方程即得其利凡诺的残留含量。
文档编号G01N21/25GK1074038SQ9211199
公开日1993年7月7日 申请日期1992年11月20日 优先权日1992年11月20日
发明者余蓉, 刘文芳 申请人:中国医学科学院输血研究所