专利名称：一种莱姆病酶联免疫诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用酶联免疫方法检测人和哺乳动物的抗莱姆病螺旋体抗体(IgG、IgM)，进行莱姆病流行病学调查和临床诊断的试剂盒。
莱姆病(Lyme disease)是一种经蜱传播莱姆病螺旋体(Borrelia burg-dorferi)引起的人兽共患传染病。它已成为全球性的重要虫媒传染病。它呈慢性感染病变过程，临床表现复杂多样，主要有慢性游性红斑、慢性萎缩性肢皮炎、淋巴细胞性脑膜神经根炎、周围神经炎及莱姆关节炎等。在这种病的晚期可观察到严重危及神经系统、心脏和关节的情况。该病临床表现的复杂类型及与其他神经性和风湿病症的显著类似造成了诊断的困难。因此，实验诊断手段倍受重视。由于该病原体培养较困难，病原生长缓慢，难于快速诊断，其它侦察病原因子的方法(如聚合酶联反应等)存在特异性不好和难于推广应用等问题，所以，诊断莱姆病最好的辅助手段是血清学检查。在诸多的血清学方法中，酶联免疫吸附试验具有较好的特异性和灵敏性，被广泛应用。国外已有这方面的研究报导，且有试剂盒研制成功(Fister R.D.，etal.J.Clin.Mierobiol.1989，27(12)2834-7)。但是本发明研究发现中国莱姆病螺旋体的外膜蛋白抗原与欧、美等国的莱姆病螺旋体的外膜蛋白抗原有明显的区别，如中国莱姆病螺旋体的外膜蛋白A和B分子量偏大，外膜蛋白B对美国B31菌株外膜蛋白B的H6831单克隆抗体呈阴性反应。国内外尚未见有与本发明技术特征相近的莱姆病酶联免疫诊断试剂盒的研究报导和专利申请。
本发明的目的在于研制出一种特异、灵敏、稳定、使用方便、更适用于中国莱姆病的流行病学调查和临床诊断的酶联免疫诊断试剂盒。
本发明的内容和技术要点所说的试剂盒由从中国莱姆病螺旋体提取的新的特异纯化抗原(含外膜蛋白A、32KD，B、36KD，C、22KD和鞭毛蛋白、41KD四种纯蛋白抗原)包被的条块酶联反应板、辣根过氧化物酶标记抗抗体加保护剂配制的酶结合物、以柠檬酸、磷酸氢二钠和乙二胺四乙酸(EDTA)为缓冲系统加3，3′5，5′-四甲基苯(TMB)和过氧化氢尿素配制的显色底物及试剂盒使用说明书组成。
1、抗原物质的提取将培养好的莱姆病螺旋体10000g离心30分钟收集菌体，冰镇下超声波粉碎30分钟，4000g离心20分钟，去沉淀取上清，Sephadex G100柱层析，流速为每分钟20滴，280nm波长紫外监测下收集第一个吸收曲线内的全部液体(图1)，浓缩至2-4毫克/毫升，测定蛋白含量，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，含外膜蛋白A(32KD)，B(36KD)，C(22KD)和鞭毛蛋白(41KD)四种纯蛋白抗原(图2)，其外膜蛋白A和B分子量偏大，外膜蛋白B对美国B31菌株外膜蛋白的H6831单克隆抗体呈阴性反应，这些特征明显区别于欧美等国的莱姆病螺旋体的相应外膜蛋白抗原。
2、酶联反应板的制备将提取的特异纯化蛋白抗原用包被缓冲液(pH9.6碳酸盐缓冲液NaCO31.95g，NaHCO32.93g，H2O 1000ml)稀释至20ug/ml，以每孔0.1ml加微孔板中，4℃包被24小时。取出抗原板，空干。用0.01MpH7.4 PBS(NaCl 8.0g，KH2PO40.2g，KCl 0.2g，Na2HPO412H2O 2.9g，H2O1000ml)配制的1.0％脱脂奶粉，每孔0.2ml，4℃封闭24小时，取出用PBS洗涤5次，室温风干、消毒、密封备用。
3、酶结合物用辣根过氧化物酶标记的抗人或动物的IgG或IgM抗体，加保护剂(0.01％硫柳汞和1％牛血清白蛋白)和PBS配制而成。
4、显色系统以柠檬酸、磷酸氢二钠和EDTA为缓冲系统加TMB和过氧化氢尿素配制成显色底物。
配方 A液B液磷酸氢二钠36.82g柠檬酸 10.5g柠檬酸10.21gEDTA 0.146g过氧化氢尿素 0.6g 去离子水 1000ml去离子水 1000mlTMB0.25g5、试验原理
6、试剂盒使用方法(1)加待检样品和酶结合物用PBS适当稀释待检样品和酶结合物，各取50ul加入抗原板孔内，37℃40分钟，取出用PBS洗涤5次，室温风干。
(2)加显色底物和终止反应取显色底物溶液A和B各50ul加孔内，避光37℃15-20分钟，加入2M H2SO450ul终止反应。
(3)检测样品的同时设立标准阳性和阴性以及空白对照。
(4)结果判断以特异性抗莱姆病螺旋体抗体(含IgG60ug/ml)为阳性标准对照和无特异性抗体的阴性对照作判断结果的标准。用酶联免疫检测仪450nm波长测吸光度(A)或目测。仪器测定空白孔调零当标准阳性对照的A大于或等于0.15者，阴性对照的A小于0.06时试剂盒有效。样品孔A大于或等于0.15者为阳性，小于0.15者为阴性。目测判断样品孔颜色深于或等同于标准阳性孔者为阳性，颜色浅于阳性对照孔者为阴性。单份血清稀释度为1∶500，脑脊液为1∶100，双份样品阳性稀释度呈四倍或四倍以上增高者为阳性。
7、特异性和敏感性检测采用1500份东北、内蒙古吉林区患者血清，用间接免疫荧光抗体法(IFA)作对照，对本发明进行了特异和敏感性检测(结果见表)。本发明的特异性达94％，敏感性达96％。
表.1500份患者血清抗莱姆病螺旋体抗体(IgG)检测结果实验组阳性数阴性数合计对照组阳性数 82335 858阴性数 47 595 642合计 870 630 1500本发明的优点和积极效果本发明除更适用中国莱姆病的流行病学调查和临床诊断外，还具有以下明显特点特异采用本发明研究发现的新的特异纯化蛋白抗原(含外膜蛋白A、B、C和鞭毛蛋白)，诊断特异性达94％，灵敏采用标准阳性对照检测灵敏度达到60ug/ml抗体水平，灵敏性达96％，稳定经稳定性考验，本发明于4℃保藏，有效期达9-12个月，简便试剂配套，使用方便，结果判断不需要特殊仪器，可目测判断，易于普及，适宜于批量生产，价格便宜。
图1.Sephadex G100柱层析提纯蛋白抗原紫外监测曲线其中A-光吸收度；T-收集时间1-收集的外膜蛋白(A、B、C)和鞭毛蛋白区2-弃除的蛋白区图2.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析其中1-纯化前的蛋白抗原区带2-纯化后的蛋白抗原区带
权利要求
1.一种莱姆病酶联免疫诊断试剂盒，其特征是由从中国莱姆病螺旋体提取的新的特异纯化蛋白抗原包被的酶联反应板、辣根过氧化物酶标记的抗抗体加保护剂配制的酶结合物、柠檬酸、磷酸氢二钠、乙二胺四乙酸缓冲系统加3，3′5，5′-四甲基苯构成的显色底物和试剂盒使用说明书组成的。
2.根据权利要求1所述的诊断试剂盒，其特征是从中国莱姆病螺旋体提取的新的特异纯化抗原，是经超声粉碎中国莱姆病螺旋体，离心去沉淀，取上清，280nm波长紫外监测下收集，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，所得样品含有外膜蛋白A(32KD)、B(36KD)、C(22KD)和鞭毛蛋白(41KD)四种特异纯蛋白抗原。
3.根据权利要求1所述的诊断试剂盒，其特征是将特异纯化抗原用包被缓冲液稀释至20ug/ml，每孔0.1ml加入微孔板中，4℃包被24小时，空干，用0.01M pH7.4 PBS配制的1.0％脱脂奶粉，每孔0.2ml，4℃封闭24小时，用PBS洗涤5次，风干、消毒、密封过程制备得到酶联反应板。
4.根据权利要求1所述的诊断试剂盒，其特征是用辣根过氧化物酶标记的抗抗体加保护剂(0.01％硫柳汞，1％牛血清白蛋白)配制成酶结合物，用柠檬酸、磷酸氢二钠、乙二胺四乙酸缓冲系统和3，3′5，5′-四甲基苯配制成显色底物。
全文摘要
一种莱姆病酶联免疫诊断试剂盒，由从中国莱姆病螺旋体提取的新的特异纯化抗原(含外膜蛋白A、B、C和鞭毛蛋白四种)包被的酶联反应板、辣根过氧化物酶标记的抗抗体加保护剂配制的酶结合物、柠檬酸、磷酸氢二钠、乙二胺四乙酸缓冲系统加3，3′，5，5′-四甲基苯(TMB)配制的显色底物和试剂盒使用说明书组成，检测人和哺乳动物的抗莱姆病螺旋体抗体(IgG、IgM)，用于莱姆病的流行病学调查和临床诊断，具有特异、灵敏、稳定、简便等优点。
文档编号G01N33/53GK1150649SQ96105050
公开日1997年5月28日 申请日期1996年5月24日 优先权日1996年5月24日
发明者万康林, 张哲夫 申请人:中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所