专利名称：冷冻保存溶液的制作方法
技术领域：
本发明涉及冷冻保存溶液。更具体地说，本发明是特别适用于冷冻保存各种血液循环细胞和骨髓细胞，例如造血干细胞和祖细胞的冷冻保存溶液。
本发明还涉及冷冻保存细胞和恢复经冷冻保存的细胞的方法。
背景技术：
血液具有可识别形态和不同功能的血循环细胞包括红细胞，嗜中性、嗜酸性和嗜碱性粒细胞，B淋巴细胞，T淋巴细胞，非B淋巴细胞，非T淋巴细胞和血小板。这些成熟细胞来源于各谱系具有可识别形态的分裂的前体细胞，且于需要时可由它们取代，这些前体细胞例如有红细胞系的成红细胞，粒细胞系的成髓细胞、前髓细胞和髓细胞，以及血小板系的巨核细胞。
造血干细胞和祖细胞前体细胞来自可简单分为两亚群的更原始的细胞干细胞和祖细胞。对干细胞和祖细胞的定义是操作型的，取决于功能标准而不是其形态标准。有些干细胞在需要时发生分化，但是有些干细胞或其子代细胞生成别的干细胞以维持宝贵的这类细胞的集合。这样，多能干细胞除了能够维持自己的种系之外，还能够分化成几个亚系的、具有较为有限的自我更新能力或没有自我更新能力的祖细胞。由这些祖细胞最终产生具有可识别形态的前体细胞。祖细胞能够增殖和沿一种或多种髓细胞样分化途径进行分化。
干细胞和祖细胞在骨髓、脾脏和血液中的有核细胞中占很小的百分比。存在于脾脏中的这些细胞比骨髓中的约少10倍，成人血液中甚至更少。例如，有核骨髓细胞中约有千分之一是祖细胞；干细胞更少。
已经能够通过骨髓移植来再建造血系统。Lorenz及其同事证明，通过静脉输注骨髓可以保护小鼠抵抗致死量的辐射(Lorenz，20E，等，1951，国立癌症研究所杂志(J.Natl.Cancer Inst.)12197-201)。以后的研究表明，保护作用来自输注的细胞在受体骨髓中的定居(Lindsley，D.L.，等，1955，实验生物学与医学会记事(Proc.Sco.Exp.Biol.Med.)90512-515；Nowell，P.C.，等，1956，(癌症研究(CancerRes.)16258-261；Mitchison，N.A.，1956，英国实验病理学杂志(Br.J.Exp.Pathol.)37239-247；Thomas，E.D.等，1957，新英格兰医学杂志(N.Engl.J.Med.)257491-496)。这样，供体骨髓中的干细胞和祖细胞能够增殖和取代负责保护性免疫、组织修复、凝血和其它血液功能的血细胞。在成功的骨髓移植中，血液、骨髓、脾脏、胸腺和其它免疫器官中都重新集合了来自供体的细胞。
骨髓移植已越来越成功地被用于治疗许多致死或致残的疾病，其中包括某些类型的贫血，例如再生障碍性贫血(Thomas，E.D.等，1972年2月5日，柳叶刀(TheLancet)pp.284-289)，范康尼氏贫血(Gluckman，E.等，1980，英国血液学杂志(Brit J.Haematol.)45557-564；Gluckman，E.等，1983，英国血液杂志(Brit J.Haematol.)54431-440；Gluckman，E.等，1984，血液学评论(Seminars inHematology)21(1)20-26)，免疫缺陷(Good，R.A.等，1985，细胞免疫学(CellularImmunol.)8236-54)，癌症，例如淋巴瘤和白血病(Cahn，J.Y.等，1986，英国血液学杂志(Brit J.Haematol.)63457-470；Blume，K.J.和Forman S.J.，1982，细胞生理学杂志增刊(J.Cell.Physiol.Supp.)199-102；Cheever，M.A.等，1982，新英格兰医学杂志(N.Engl.J.Med.)307(8)479-481)，癌(Blijham，G等，1981欧洲癌症杂志(Eur.J.Cancer)17(4)433-441)，各种实体瘤(Ekert，H.等，1982，癌症(Cancer)49603-609；Spitzer，G.等，1980，癌症(Cancer)453075-3085)，以及各种造血遗传疾病。
最近，骨髓移植还被用于治疗遗传性贮积病(Hobbs，J.R.，1981，柳叶刀(Lancet)2735-739)，重型地中海贫血(Thomas，E.D.等，1982，柳叶刀(Lancet)2227-229)，镰状细胞疾病(Johnson，F.J.等，1984，新英格兰医学杂志(N.Engl.J.Med.)311780-783)，骨硬化病(Coccia，P.F.，等，1980，新英格兰医学杂志(N.Engl.J.Med.)302701-708)(全面的论述可参见Storb，R.和Thomas，E.D.，1983，免疫学评论(Immunol.Rev.)7177-102；O’Reilly，R.等，1984，血液学评论(Sem.Hematol.)21(3)188-221；1969，骨髓的保存、培养和移植，小组委员会会议录，莫斯科(Bone-Marrow Conservation，Culture and Transplantation，Proceedings of aPanel，Moscow)，1968年7月22-26，International Atomic Energy Agency，Vienna；McGlave，P.B.等，1985，血液学最新进展(Recent Advances in Haematology)，Hoffbrand，A.V.编，Churchill Livingstone，London，pp.171-197)。
现在骨髓移植的使用受到严格限制，因为很难找到完全匹配(遗传上全等)的供体，除非是得到全等双生儿或者缓解期病人的骨髓细胞以活的冷冻状态保存。即使在这样的自体系统中未能察觉的恶性细胞污染造成的危险，以及病人必须足够强健以便进行骨髓移植，仍造成严重的限制。除这样的自体移植之外，不可避免地有某种程度的遗传不匹配性，这会造成严重的有时是致命的并发症。这些并发症是双重性的。首先，为防止病人对外来骨髓细胞的免疫排斥(宿主抗移植物反应)病人通常事先服药而形成免疫抑制。其次，当(和如果)供体骨髓细胞移植成功，它们就会将病人作为异物进行攻击(移植物抗宿主病)。即使是高度匹配的亲属供体，这些部分不匹配造成的并发症也会导致遗传上不同的个体间骨髓移植引起的许多死亡或疾病。
另外还研究了将外周血作为用于再建造血系统的干细胞的来源(Nothdurtt，W.等，1977，斯堪的纳维亚血液学杂志(Scand.J.Haematol.)19470-471；Sarpel，S.C.等，1979，实验血液学(Exp.Hematol.)7113-120；Ragharachar，A.等，1983，细胞生物化学杂志增刊(J.Cell.Biochem.Suppl.)7A78；Juttner，C.A.等，1985，英国血液学杂志(Brit.J.Haematol.)61739-745；Abrams，R.A.等，1983，细胞生物化学杂志增刊(J.Cell.Biochem.Suppl.)7A53；Prummer.O.等，1985，实验血液学(Exp.Hematol.)13891-898；)。在有些研究中，对于各种白血病患者(Reiffers，J.等，1986，实验血液学(Exp.Hematol.)14312-3l5(使用冷冻保存的细胞)；Goldman，J.M.等，1980，英国血液学杂志(Br.J.Haematol.)45223-231；Tilly，H.等，1986年7月19日，柳叶刀(Lancet)pp.154-155；同时参见To，L.B.和Juttner，C.A.，1987，英国血液学杂志(Brit.J.Haematol.)66285-288，以及该文中引用的参考文献)和淋巴瘤患者(Korbling，M.等，1986，血液(Blood)67529-532)已取得了乐观的结果。提示在有些癌症病人中看到的、成人自体外周血再建造血系统的能力与强烈化疗和/或放疗引起的细胞减少后外周血内产生的数量多得多的循环祖细胞有关(反跳现象)(To，L.B.和Juttner，C.A.，1987，英国血液学杂志释义(Annot.，Brit.J.Haematol.)66285-288；同时参见1987，英国血液学杂志(Brit.J.Haematol.)67252-253，和该文中引用的文献)。使用外周血的其它研究未能产生再建作用(Hershko，C.等，1979，柳叶刀(The Lancet)1945-947；Ochs，H.D.等，1981，儿科研究(Pediatr.Res.)15(4第2部分)601)。
还研究了使用胎儿肝细胞移植(Cain，G.R.等，1986，移植(Transplantation)41(1)32-25；Ochs，H.D.等，1981，儿科研究(Pediatr.Res.)15(4第2部分)601；Paige，C.J.等，1981，实验医学杂志(J.Exp.Med.)153154-165；Touraine，J.L.，1980，医学文摘(Excerpta Med.)514277；Touraine，J.L.，1983，出生时的缺陷(Birth Defects)19139；同时参见Good，R.A.等，1983，细胞免疫学(Cellular Immunol.)8244-45和该文中的参考文献)或新生儿脾细胞移植(Yunis，E.J.等，1974，美国科学院记录(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)724100)作为再建造血系统的干细胞的来源。在免疫重建试验中还使用了新生儿胸腺细胞进行移植(Vickery，A.C.等，1983，寄生虫学杂志(J.Parasitol.)69(3)478-485；Hirokawa，K.等，1982，临床免疫学和免疫病理学(Clin.Immunol.Immunopathol.)22297-304)。
冷冻保存溶液与技术长期以来，冷冻被用于保存取自或分离自供体机体的活细胞，例如血细胞。但是，活细胞的冷冻保存和恢复显得十分麻烦。在对细胞冷冻保存的冻融循环中，细胞经受了相当苛刻的条件，造成较低的存活率。
冷冻会对多数活细胞造成损伤。当周围的介质冻结时，细胞因试图维持平衡而失水，由此升高了胞内的溶质浓度，直至在约负10-15℃时发生胞内冻结。通常认为，胞内冻结和溶液效应都造成细胞损伤。例如，有人提出，胞外冰晶造成的冷冻损伤实质上是细胞因渗透失水造成的质膜损伤。
为了尽可能提高融化细胞的存活能力已投注了大量的时间和精力。这些努力主要侧重于开发冷冻保存试剂和确定最佳冷却速度。
通过添加溶质的冷冻保存被认为通过两种潜在机制进行(i)细胞内；通过减少细胞内形成的冰晶量；和/或(ii)细胞外；通过减少因细胞周围溶质中冰晶的形成造成蒸汽压降低继而引起的细胞失水。
已经对不同的细胞说明了其不同的最佳冷却速度。许多研究组都研究了冷却速度保存剂对冷冻的骨髓细胞和红血细胞的存活或移植效率的影响(Lovelock，J.E.和Bishop，M.W.H.，1959，自然(Nature)1831394-1395；Ashwood-Smith，M.J.，1961，自然(Nature)1901204-1205；Rowe，A.W.和Rinfret，A.P.，1962，血液(Blood)20636；Rowe，A.W.和Fellig，J.，1962，联邦记事(Fed.Proc.)21157；Rowe，A.W.，1966，低温生物学(Cryolbiology)3(1)12-18；Lewis，J.P.等，1967，输血(Transfusion)7(1)17-32；Rapatz，G.等，1968，低温生物学(Crylobiology)5(1)18-25；MaZur，P.，1970，科学(Science)168939-949；Mazur，P.，1977，低温生物学(Cryolbiology)14251-272；Rowe，A.W.和Lenny，L.L.，1983，低温生物学(Cryolbiology)20717；Stiff，P.J.等，1983，低温生物学(Cryolbiology)2017-24；Gorin，N.C.，1986，血液学临床(Clinics in Haematology)15(1)19-48)。通常，使用每分钟约1-2℃的冷却速度，约-70℃至-196℃的最终保存温度对造血干细胞和祖细胞可获得最佳结果，其它血细胞通常也在此范围内。
成功的恢复在液氮中长期保存的人骨髓细胞已有所记述(1983，美国微生物保藏中心(American Type Culture Collection)，季并通讯(Quarterly Newsletter)3(4)1)。此外，骨髓中的干细胞已被证明能够耐受冷冻和解冻(Fabian，I.等，1982，pu验血液学(Exp.Hematol.)10(1)119-122)。
用于冷冻保存包括全血、脐带血、骨髓、粒细胞、中性粒细胞、血小板和造血干细胞及祖细胞在内的大多数细胞的普遍认可的工业冷冻保护剂是二甲基亚砜(DMSO)。这通常是因为普遍共知的有关基于DMSO的冷冻保存溶液的经验和知识以及一种普遍的概念，即DMSO可提供优良的保护作用和最大的细胞存活率。虽然DMSO通常能有效地达到上述目的，但也已知它具有生理毒性，尤其在高浓度时，并由此倾向于刺激涉及冷冻保存操作的人和被引入冷冻保藏的细胞的病人发生高血压、呕吐和恶心。DMSO的毒性还被认为造成冷冻保藏的细胞在体外的存活率较低。
所以，急需另一种在体内和体外都能够提供相当水平的细胞存活率的简单的具生理相容性的冷冻保存溶液。
发明综述本文开发了一种简单、价廉、生理相容的冷冻保存溶液，其中包含无毒成份(i)甘油，(ii)碱金属氯化物，(iii)单糖和(iv)血清白蛋白。
冷冻保存溶液的主要成份是冷冻保存剂甘油。碱金属氯化物提高细胞在冻融循环中的存活率。单糖的作用是作为细胞的营养性碳源。血清白蛋白的作用是作为蛋白质源，用以包裹靶细胞的细胞膜，在冻融循环和冷冻细胞的保存过程中保护细胞膜。血清白蛋白还被认为具有清除氧自由基的功能，已知氧自由基不利于多种靶细胞的存活，例如上述红细胞，嗜中性、嗜酸性和嗜碱性粒细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、非B淋巴细胞、非T淋巴细胞和血小板细胞。血清白蛋白的来源最好与将引入被保护靶细胞的受治疗者的种类相匹配。
冷冻保存溶液可以是浓缩或充分稀释的形式。可以通过在溶液中简便地添加稀释剂，例如适当处理过的水来将浓缩型稀释至使用浓度。稀释剂最好是生理平衡盐溶液，例如生理盐水。
对靶细胞，例如全血、脐带血、骨髓、粒细胞、嗜中性粒细胞、血小板和包括CD34+细胞在内的造血干细胞和祖细胞的保存及其以后的治疗使用中采用冷冻保存溶液包括以下步骤(i)根据需要稀释浓缩的冷冻保存溶液，(ii)将靶细胞加入稀溶液中，(iii)冷冻被保护的靶细胞，(iv)使冷冻溶液解冻至环境条件，以及(v)将解冻后的靶细胞引入需要这些靶细胞的受治疗者。在引入受治疗者之前最好将解冻的靶细胞和相伴的冷冻溶液温热至体温(即约37℃)。冷冻保护溶液的生理相容性允许解冻的靶细胞被引入受治疗者而不须靶细胞与冷冻保存溶液分离。
包括最佳实施方式的详细说明本文开发了一种简单、价廉、生理相容的冷冻保存溶液，其中主要包含无毒成份(i)甘油，(ii)碱金属氯化物，(iii)单糖和(iv)血清白蛋白。
本文包括权利要求书中的“重量％”与冷冻保存溶液的组份相关时，是以浓缩的冷冻保存溶液的总重为基础的，除非另作说明。
甘油(C3H8O3)可购自多家供应商，它是J.T.Baker的U.S.P.级和食品级的市售多元醇。
浓缩的冷冻保存溶液中包含约60重量％至约80重量％甘油。低于约60重量％的甘油浓度会降低细胞存活率，高于约80重量％会使溶液具有过高的渗透性(即高于约2,000mOsm/kg)。
适用于本发明的碱金属氯化物包括氯化钠和氯化钾。碱金属氯化物被认为通过将冷冻保存溶液的渗透性调节在约500至2,000mOsm/kg之间(该值利用Wescor5500型蒸汽压渗透压计按照仪器说明及使用手册中的方法测得)，在冻融循环中提高了细胞存活率。作为参考，血液的生理渗透性一般在约260至320mOsm/kg之间。该一般范围内的最佳渗透性取决于几个因素，包括具体的靶细胞，冷冻保存溶液的具体组成和冻融速度。例如，约700至约1,700的渗透性对造血干细胞和祖细胞的冷冻保存来说通常是较为理想的。
浓缩冷冻保存溶液包含与5至10重量％碱金属氯化物。碱金属氯化物浓度低于约5重量％和高于约10重量％会降低冻融循环中的细胞存活率，浓度高于10重量％还易受结晶破坏。
单糖，例如葡萄糖被作为细胞的营养性碳源。单糖通过保证细胞中有充足的养分存在来在冻融循环和冷冻细胞的保存过程中促进细胞的保存。
血清白蛋白的作用是作为包裹靶细胞膜以在冻融循环和冷冻细胞保存过程中保护细胞膜的蛋白质的来源。血清白蛋白还被认为具有清除氧自由基的功能，已知氧自由基不利于多种靶细胞的存活，例如上述红细胞，嗜中性、嗜酸性和嗜碱性粒细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、非B淋巴细胞、非T淋巴细胞和血小板细胞。血清白蛋白的来源最好与将引入被保护的靶细胞的受治疗者的种类相匹配。
在浓缩冷冻保存溶液中加入约0.2至约1重量％单糖能够达到有效浓度。浓度低于约0.2重量％造成浓度不够而降低细胞在冻融循环中的存活率，浓度高于约1重量％并不成正比地提高细胞存活率，而对其它组份的浓度具有不良影响。
血清白蛋白的作用是作为蛋白质的来源，用以在靶细胞膜周围形成包裹层，继而在冻融循环和冷冻细胞保存过程中保护细胞膜。
加入约20至约30重量％血清白蛋白可达到有效浓度。血清白蛋白浓度低于约20重量％使得浓度不够而降低细胞存活率，浓度高于约30重量％并不成正比地提高细胞存活率，并倾向于使溶液的渗透性超出约2,000mOsm/kg的上述理想上限。
可按每份浓缩冷冻保存溶液约1至10份，通常为1至2份的比例加入合适的稀释剂(例如用超滤水配制的0.9重量％的盐水、注射用水和自体血浆)将浓缩冷冻保存溶液稀释至使用浓度。通常，稀释后的冷冻保存溶液按稀释后的冷冻保存溶液总重计主要包含(i)约20至约40重量％甘油，(ii)约1.5至约5重量％碱金属氯化物，(iii)约0.1至约0.5重量％单糖和(iv)约6至约15重量％血清白蛋白。其余量为稀释剂。
冷冻保存溶液必须配制成pH在约7至7.5之间。
使用稀释后的冷冻保存溶液可方便地冷冻保存靶细胞，只需(i)将靶细胞加入稀释后的冷冻保存溶液中，和(ii)冷冻或低温保存被保护的靶细胞。加入靶细胞的稀冷冻保存溶液的体积，同时取决于含靶细胞溶液与冷冻保存溶液的体积比和靶细胞与冷冻保存溶液之比。含靶细胞的溶液与冷冻保存溶液的体积比通常应在约1∶1至1∶10之间，同时使靶细胞与冷冻保存溶液之比在约1×105个细胞/ml至约1∶1×109个细胞/ml，通常更好的是在约2×108个细胞/ml至约3×108个细胞/ml。高于上述比例会因冷冻保存溶液不足而降低活细胞浓度，低于上述比例则显然会降低冷冻保存溶液的利用率，并会为了给受治疗者引入有效量的靶细胞而引入过量的冷冻保存溶液。通常可用于保存的靶细胞只能是作为某种生物液体中的一种组份的稀释液形式(例如，从外周血中浓集的干细胞通常含有浓度为约1×106个细胞/ml至约3×108个细胞/ml的干细胞，以及包括血浆和血小板等其它血液成份的其余组份)。这些生物稀释的样品通常必须以约2∶1至1∶4的体积比与冷冻保存溶液混合(当然，这取决于多种因素，其中包括稀冷冻保存溶液的具体组成，生物稀释样品中的靶细胞浓度，靶细胞类型等)以获取最佳的靶细胞与冷冻保存溶液之比。最后含有靶细胞的溶液通常含有约4至12重量％甘油和约2至10重量％白蛋白，考虑到某些应用情况，浓度可在上述一般范围之外。
在将靶细胞引入受治疗者之前必须将冷冻保存保护的靶细胞解冻。归功于冷冻保存溶液的生理相容性，解冻后的靶细胞可以直接引入受治疗者而无需将靶细胞与冷冻保存溶液分离。解冻后的靶细胞可在室温下维持数小时而不严重损失细胞活性。为了将溶液的渗透性从理想的冷冻保存范围500至2,000mOsm/kg降至生理范围260至320mOsm/kg，可利用盐水或其它合适的离子溶液缓慢稀释解冻后的溶液，以降低渗透性突然改变对细胞膜造成的冲击。
有控制的缓慢的冷却速度通常可有效地获得最佳的细胞活性。普遍认为，不同类型的细胞有不同的最佳冷却速度(参见，例如，Rowe，A.W.和Rinfret，A.P.，1962，血液(Blood)20636；Rowe，A.W.，1966，低温生物学(Cryo Biology)3(1)12-18；Lewis，J.P.等，1967，输血(Transfusion)7(1)17-32；和Mazur P.，1970，科学(Science)168939-949，有关冷却速度对骨髓于细胞的存活及对其移植能力的影响)。
使用前，冷冻保存溶液可维持在室温下，其中混合的靶细胞可在冷冻开始前于室温保存长达30分钟而不出现细胞活性的明显损失。这与有毒的冷冻保护剂DMSO相反，后者必须在加入靶细胞前冷却至约4℃以加快冷冻过程，并为了尽可能降低DMSO造成的细胞死亡而要求在将DMSO加入细胞后立刻开始冷冻过程。
可通过使用可编程的冷冻装置来进行有控制的冷冻。可编程的冷冻设备可以确定最佳冷却速度并方便地进行标准化的可重现的冷却。
容纳细胞的容器必须在深冷低温下保持稳定，并可进行快速热传递以便有效调控冷冻和解冻过程。密封的塑料小瓶(例如Nunc和Wheaton cryules)或玻璃安瓿可用于多种小量(1至2ml)，100至200ml的较大体积可在固定于金属板之间的聚烯烃袋，例如购自Fenwal的袋中冷冻。
然后可将冷冻细胞转移到长期低温保存容器中，在一较好的实施方式中，可将样品冷冻保存在液氮(-196℃)或液氮蒸汽(-105℃)中。高效液氮冷藏箱大大方便了这样的保存。
在需要时，最好快速解冻冷冻细胞并在使用前维持于约37℃。由于冷冻保存溶液是生理相容性的，所以不需要在引入受治疗者之前分离出细胞。
可将冷冻保存和解冻后的脐带细胞、血小板和造血干细胞及祖细胞治疗性地应用在合适的病人体内重建造血系统。可利用本领域中任何已知的方法引入细胞，通常优选全身输注。
造血系统(或免疫系统)的重建在医疗上对许多疾病和失调是十分有价值的。用于再建造血系统的冷冻保存的造血干细胞和祖细胞的输注可以很好地用于治疗现在已知用自身骨髓移植来治愈的疾病。
可用干细胞输注来治疗的失调包括但不限于五大类。第一类是正常血细胞生成及成熟机能丧失或障碍引起的疾病(即再生障碍性贫血和低增生性干细胞疾病)。第二类包括造血器官中的恶性肿瘤疾病(例如白血病和淋巴瘤)。第三类包括患有多种恶性实体瘤的无造血源的病人。在这些病人中的干细胞输注起骨髓救援的作用，输注在这些病人接受了可能致命的恶性肿瘤化疗或放疗后进行。第四类疾病包括自身免疫状态，干细胞在其中起异常免疫系统取代源的作用。第五类疾病包括许多可以通过最好是同系的造血干细胞输注来矫正的遗传疾病，干细胞在移植前已接受了基因治疗。
权利要求
1.一种浓缩冷冻保存溶液，主要包含(a)甘油；(b)对提高细胞存活率来说为有效量的碱金属氯化物；(c)对在环境条件下细胞的维持来说为有效量的可生物代谢的单糖；(d)对保护质膜完整性来说为有效量的血清白蛋白。
2.根据权利要求1所述的冷冻保存溶液，其中还包括稀释剂。
3.根据权利要求1所述的冷冻保存溶液，溶液的pH在约7至7.5之间。
4.根据权利要求1所述的冷冻保存溶液，其中的浓缩液主要包含(a)约60至约80重量％甘油，(b)约5至约10重量％碱金属氯化物，(c)约0.2至约1重量％单糖和(d)约20至约30重量％血清白蛋白。
5.根据权利要求2所述的冷冻保存溶液，其中的溶液主要包含(a)约20至约40重量％甘油，(b)约1.5至约5重量％碱金属氯化物，(c)约0.1至约0.5重量％单糖，(d)约6至约15重量％血清白蛋白和(e)余量的稀释剂。
6.根据权利要求1所述的浓缩冷冻保存溶液，其中的碱金属氯化物是氯化钠。
7.根据权利要求2所述的冷冻保存溶液，其中的碱金属氯化物是氯化钠。
8.根据权利要求1所述的浓缩冷冻保存溶液，其中的单糖是葡萄糖。
9.根据权利要求2所述的冷冻保存溶液，其中的单糖是葡萄糖。
10.根据权利要求1所述的浓缩冷冻保存溶液，其中的血清白蛋白是人血清白蛋白。
11.根据权利要求2所述的冷冻保存溶液，其中的血清白蛋白是人血清白蛋白。
12.一种浓缩冷冻保存溶液，主要包含(a)约60至80重量％甘油；(b)约5至10重量％碱金属氯化物；(c)约0.2至1重量％葡萄糖；(d)约20至30重量％血清白蛋白。
13.一种冷冻保存溶液，主要包含(a)约20至40重量％甘油；(b)约1.5至5重量％碱金属氯化物；(c)约0.1至0.5重量％葡萄糖；(d)约6至1 5重量％血清白蛋白；(e)余量的稀释剂。
14.一种冷冻保存细胞的方法，包括(i)将靶细胞加入权利要求2所述的冷冻保存溶液中和(ii)冷冻保存被保护的靶细胞。
15.根据权利要求14所述的方法，其中含有靶细胞的溶液与冷冻保存溶液的体积比在约1∶1至1∶10之间，靶细胞与冷冻保存溶液之比在约1×105个细胞/ml至约1×109个细胞/ml之间。
16.根据权利要求14所述的方法，其中的靶细胞是造血干细胞或祖细胞。
17.根据权利要求14所述的方法，其中的靶细胞是血小板细胞。
18.根据权利要求14所述的方法，其中的靶细胞是CD34+细胞。
19.根据权利要求14所述的方法，其中的靶细胞来自脐带血。
20.一种冷冻保存细胞的方法，包括(i)将靶细胞加入权利要求13所述的冷冻保存溶液中和(ii)冷冻保存被保护的靶细胞。
21.根据权利要求20所述的方法，其中含有靶细胞的溶液与冷冻保存溶液的体积比在约1∶1至1∶10之间，靶细胞与冷冻保存溶液之比在约1×105个细胞/ml至约1×109个细胞/ml之间。
22.根据权利要求20所述的方法，其中以1-2℃/分钟的速度将被保护的靶细胞冷却至约-70至-196℃。
23.一种冷冻保存和恢复活细胞的方法，包括(i)将靶细胞加入权利要求2所述的冷冻保存溶液中，(ii)冷冻保存被保护的靶细胞和(iii)使被保护的细胞解冻。
24.根据权利要求23所述的方法，其中含有靶细胞的溶液与冷冻保存溶液的体积比在约1∶1至1∶10之间，靶细胞与冷冻保存溶液之比在约1×105个细胞/ml至约1×109个细胞/ml之间。
25.根据权利要求23所述的方法，其中的靶细胞是造血干细胞或祖细胞。
26.一种冷冻保存、恢复和治疗性应用细胞的方法，包括(i)将靶细胞加入权利要求2所述的冷冻保存溶液中，(ii)冷冻保存被保护的靶细胞，(iii)使被保护的靶细胞解冻和(iv)将解冻后的被保护的靶细胞引入需要这些靶细胞的受治疗者体内，无需将靶细胞与冷冻保存溶液分离。
27.根据权利要求26所述的方法，其中含有靶细胞的溶液与冷冻保存溶液的体积比在约1∶1至1∶10之间，靶细胞与冷冻保存溶液之比在约1×105个细胞/ml至约1×109个细胞/ml之间。
28.根据权利要求26所述的方法，其中的靶细胞是造血干细胞或祖细胞。
29.根据权利要求26所述的方法，其中的靶细胞是血小板细胞。
30.根据权利要求26所述的方法，其中的靶细胞是CD34+细胞。
31.根据权利要求26所述的方法，其中的靶细胞来自脐带血。
32.根据权利要求26所述的方法，其中的受治疗者是人。
全文摘要
本发明是一种简单、价廉、具有生理相容性的冷冻保存溶液,其中包含无毒成分(i)甘油,(ii)碱金属氯化物,(iii)单糖和(iv)血清白蛋白。
文档编号G01N33/53GK1177905SQ96192425
公开日1998年4月1日 申请日期1996年3月7日 优先权日1996年3月7日
发明者M·R·波洛维那 申请人:切洛克斯实验室股份有限公司