专利名称：一种测定样品中氧气浓度的方法
技术领域：
本发明涉及一种测定样品(例如人体或动物体)中氧浓度的方法，更具体地说涉及用样品的电子自旋共振增强的磁共振成像(OMRI)来测定其中的氧浓度，特别涉及利用OMRI来产生显示样品中溶解的氧浓度的图像。
氧在生物体系的代谢过程中起着关键性的作用，许多种生理条件都与身体中不正常的氧浓度有关。为了更好地理解这种代谢作用并帮助临床诊断，显然需要改进测定肌体组织中氧水平的方法。
常规的测定氧浓度的方法不能令人满意。其中一种技术涉及把一个克拉克(Clark)电极直接插入血管中来测定局部的氧浓度，很显然由于这种技术的侵入性及只能局部使用而具有局限性。
非侵入性的测定技术的发展一直很缓慢，而且一般不适于研究处于样品表面下深处的组织。
发展最完善、最准确的体外用测定方法是“自旋标记测氧法”。在这种方法中，监测因氧的存在而引起的自由基电子自旋共振(esr)线宽的变化。这种技术一般使用固相固定化的顺磁性物质作为自旋标记物，因而不适合作体内测量。
电子自旋共振增强的MRI(在这里指OMRI(核极化效应MRI)，但在早期的出版物中也指ESREMRI或PEDRI)是一种完善形式的MRI，其中产生图像的磁共振信号的增强是通过动态核极化(核极化效应)而达到的，这种极化发生在本研究主题的顺磁性材料中的esr过渡态(一般是一个稳定的自由基)对VHF的激励时。磁共振信号可能增强到几百倍以上，这样就保证OMRI图像可迅速产生，而且只需要较低的主磁场强度。
已经有几位作者描述过OMRI技术，主要的有Leunbach，Lurie，Ettinger，Grucker，Ehnbolm和Sepponen，例如在EP-A-296833，EP-A-361551，WO-A-90/13047，磁共振杂志(J.Mag.Reson.)76366-370(1988)，EP-A-302742，SMRM 9619(1990)，SMRM 624(1987)，SMRM 71094(1988)，SMRM 8329(1989)，US-A-4719425，SMRM 8816(1989)，磁共振医学(Mag.Reson.Med.)14140-147(1990)，SMRM 9617(1990)，SMRM 9612(1990)，SMRM 9121(1990)，GB-A-2227095，DE-A-4042212和GB-A-2220269中作了描述。
在基本的OMRI技术中，成像程序包括先用选定频率的射线(通常为VHF射线)辐照置于均匀磁场(主磁场BO)中的受试体，在一种顺磁性增强剂中激发一种窄线幅的esr过渡态，这种增强剂在受试体中或已投药给受试体。动态核极化导致了成像核(即那些引起磁共振信号的核，一般为质子)的核自旋激发态和基态数量之间的差增大。由于MR信号强度与这种数量差成正比，每种成像程序的后续步骤(基本上按常规的MRI技术进行)都导致检测到了更大幅度的MR信号。
在室温下进行的任何OMRI试验中，顺磁性的氧对所在的自旋体系都有一定的影响。一般来讲，与自由基的电子自旋体和核自旋体系之间的一级相互作用相比，这种二级效应可以不考虑。尽管如此，还是有人提出可以利用这种效应来测定样品中的氧浓度。而这样的研究特别集中在利用氮氧化物自旋标记物上。这样的自由基其本身的缺点是具有宽的esr共振线幅，因而对氧效应的灵敏度低。因此，到目前为止，对氧效应的认识仅仅处于定性的水平，任何关于定量地认识氧效应重要性的尝试都失败了。
例如，Grucker等人(MRM，34219-225(1995))报道了一种通过测定氮氧自由基的核极化效应并且把氧气对核极化效应因子的非线性效应与它的浓度相关联而计算氧气浓度的方法，这需要拍两张照片，一张是在共振条件下而另一张是在非共振条件下拍摄的，然后用一级近似来推出氧气浓度。但是，Grucker发现，真空的氧浓度与计算出来的氧浓度之间的相关性很差，因此这种方法本身就不准确。这归因于计算中涉及的大量参数。
Ehnholm(US-A-5289125)提出了一种OMRI技术，其中至少在两套不同的操作参数下检测一种顺磁材料的信号，从而产生各种物理、化学或生物参数条件下的图象。虽然氧压是这样几个参数中的一个，但是Ehnholm并没有证明使用这样的技术能定量测定溶解的氧。
本发明涉及一种非侵入性的测定样品中氧气浓度的方法，这涉及对核极化效应的控制，其中当一种给药的长寿命自由基的电子自旋共振过渡态饱和时，极化被动态地转移到质子上。更具体地说，本方法基于对在氧存在下由于一种自由基的饱和特征的变化而引起的各种质子信号增强的观察和控制。
因此，从一个方面来看，本发明提供了一种测定样品(例如人体或非人体，优选哺乳动物，受试体)中氧气浓度的方法，所说的方法包括下列步骤向所说的样品中导入一种有效量的生理上可接受的自由基(一般为长效的自由基)，该自由基的esr过渡态的线幅(于37℃下水中测量)小于400mG，优选小于150mG；用选定振幅(即功率)和频率的射线(一般这里指VHF射线)辐照所说的样品来激发所说的自由基的电子自旋共振过渡态；在至少第一、第二和第三个条件下检测所说样品的电子自旋共振增强的磁共振信号，从而在所说的第一和第二个条件下，所说的射线具有第一个频率，在所说的第三个条件下，所说的射线具有不同于第一个频率的第二个频率，在所说的第一、第二和第三个条件下，所说的射线具有第一、第二和第三个振辐，所说的第一和第二个振幅至少应是彼此不相同的；处理所说的检测到的信号进而测出所说样品中的氧浓度。
在一个优选的实施方案中，本发明的方法包括(a)以胃肠外进药方式(例如通过向身体组织或脉管系统注射)引入自由基；(b)在VHF功率PA，辐射时间TVHF1和共振(ΔH＝0)(即把其中射线的频率选定为esr过渡态的共振频率)条件下产生所说样品的第一个OMRI图像；(c)在第二个VHF功率PB，辐照时间TVHF1和共振(ΔH＝0)条件下产生所说样品的第二个OMRI图像；(d)在VHF功率PC(例如等于PA或PB)，辐照时间TVHF1和非共振(ΔH≠0，例如100-200mG)下，产生所说样品的第三个OMRI图像；(e)处理步骤(b)-(d)中所得到的图像，并用体外测定的参数来校正，得到所说样品的氧图像。
在一个特别优选的实施方案中，在该成像程序中还产生第四个和第五个OMRI图像，第四个图像的成像条件除VHF辐照时间TVHF2不同(例如两倍长的时间，即TVHF2＝2TVHF1)外，其它条件与第一个图像的相同，而第五个图像是在没有VHF辐照的条件下得到的，例如通过重复时间为TR＝TVHF的常规MRI技术产生强度为I0的自然图像。
在另一个实施方案中，可以产生样品(例如人体)的自然图像(即用常规的MRI技术得到的图像)，从而提供附加了氧图像的结构(例如解剖)信息。以这种方法有可能精确地确定例如缺氧的肿瘤的位置。
精确地测量身体组织中氧的水平对临床医生是一个无价的帮助，因而本发明的方法有多种最终用途。例如可以利用血液中溶解氧浓度的知识(从已知的速率常数)来计算与红血球有关的氧的浓度。这个有用的参数目前是用不太受欢迎侵入性技术或是BOLD MR成像技术进行测定的，该成像技术涉及用高场成像来测定氧对顺磁性铁的影响，但是这种技术的缺点是；要测定血液氧的浓度需要知道受测的血液的体积。
本发明方法的其它用途对于技术人员来说将是显而易见的，这包括例如心脏、动脉和恶性肿瘤的氧成像(例如映像)，例如在大脑、乳腺、肺、淋巴组织和肝脏的表面区域中恶性肿瘤的氧成像。对于肿瘤的氧成像来说，通过放射疗法成功地治疗恶性肿瘤可以从组织中氧的水平反映出来(典型地，小于0.01mM的氧浓度表明该组织已坏死，因而这种治疗可能是无效的)。
本发明的方法也显然可用于心脏病学、外科和强度护理中估测氧，几乎是任何组织中的氧水平，甚至在灌注法中都可通过非侵入性的方法估测。
处理用本发明方法检测到的MR信号一般都要产生一组表明自由基浓度的图像数据(即可以从中产生一个图像的一组数据)和一组或多组表明自由基电子驰豫时间(一般是T1e，T2e或T1e·T2e)的图像数据以及对这些数据组的处理和用体外校正数据校正而得到一组表明氧浓度的图像数据。这种氧浓度图像数据组可以转换为氧浓度图像或者经上下限滤光片过滤以鉴别出是高氧浓度区或是低氧浓度区，如果需要的话，可以再显示图像。
广义地说，增强质子MR信号的核极化效应依赖于本发明的方法中使用的自由基的esr过渡态驰豫时间T1e和T2e。这些驰豫时间本身依赖于体液中自由基和溶解的氧浓度以及体液的温度和化学性质。然而，虽然核极化增强可以很容易地被用于测定体外氧浓度(对于体外已知自由基浓度的小体积分离出来的样品的氧浓度)，但是测定体内氧浓度却是复杂的，这是因为对于一个大的不是分离的样品(例如活体)来说，核极化增强还强烈地依赖于样品结构，尤其是当射线穿透到大体积样品时呈现非均一性。
因此，虽然本发明方法要求校正数据，但是在预设的温度下测得的对应于体液(该体液中的氧需要测定)的流体样品(例如血液)中的一系列自由基和氧浓度数据，还需要作进一步处理，以便从检测到的样品的OMRI信号中求出体内氧浓度。
校正数据是通过在选定的温度和氧(优选也是自由基)浓度范围内，测定在选定体液中自由基的核极化效应增强值而产生的。在同样的条件下，用带有温度控制器的常规的esr光谱仪、用Ravin等的方法(J.Appl.Physiol.18784-790(1964)，一种已知的能产生准确的和重复性结果的方法)测定氧浓度的情况下，可以测得自由基的固有的esr驰豫时间。
总之，应当对于自由基浓度达到0.2mM，优选达到1.0mM，特别优选达到1.5mM，而氧浓度达到0.1mM，优选达到0.5mM时产生的校正数据进行研究。
这里所说的优选的自由基是指全氘代的羟基三苯甲基自由基，对37℃F的血样进行这样的校正表明，最大的核极化增强(即在不限定的VHF功率和不限定的自由基浓度下)值为192，而T1即质子驰豫为0.44mM-1S-1。发现T1e和T2e对自由基和氧浓度的依赖性符合下列线性函数2(3YeT2e)-1=20+21.5Crad+428Co2---(1)]]>3(3YeT1e)-1=10+3.6Crad+330Co2---(2)]]>(YeT1eT2e)-1=15+6.9Crad+319Co2---(3)]]>其中Ye为电子的旋磁比，Crad为以mM为单位的自由基浓度，Co2为以mM为单位的氧浓度，而T1e和T2e为以秒为单位的电子驰豫时间，系数是以测量的线幅单位的mG为单位。
对本发明方法中所用的任何自由基都可以从试验中得到相似的方程。
如果用这种校正数据可以计算一个样品的OMRI图像中象素的T1e，T2e或T1e·T2e的话，那么用方程(1)，(2)或(3)可以很容易地确定那个象素的氧浓度。通过处理用本发明的方法检测到的MR信号，可以测定自由基的浓度，从而得到一组自由基图像数据。
然而，必须从在成像过程中检测到的OMRI信号中求出象素的T1e，T2e或T1e·T2e的值。本发明方法中所用的OMRI成像程序可以是任何一种常规的成像程序，
图1中示意了这样的一种可用程序的例子，该程序涉及一个与水中质子的T1大致相同数量级的VHF辐射时间(TVHF)和一个远比T2小的单回声时间TE，则象素强度(I)由方程(4)给出Iα(1-exp(-TVHF/T1)) (4)在VHF辐照期间发生动态质子极化<Iz>，稳定态受核极化方程(5)约束<Iz>Io=1-[Sok.f.IoSo-<Sz>]So---(5)]]>其中对于电子质子动态核极化，So/Io＝658(Io在此处代表平衡磁化强度)，K为偶合因子(在低场处等于1/2)，f为漏泄因子，而(So-<Sz>)/So为电子自旋过渡态的饱和度(SAT)。
漏泄因子f由方程(6)给出
(其中r为自由基的驰豫系数；Crad为自由基浓度，而T10为在没有自由基存在时质子的驰豫时间T1)。
最终图像的象素强度由方程(7)给出Iα(1-exp(-TVHF/T1))(1-329rCradT1SAT)Io(7)(其中Io为原始图像象素的强度)。
从方程(7)中的指数函数的泰勒展开式可以看到，假如TVHF远小于T10，则T1减少到一级。SAT随激发的VHF场强度B1e而变化并遵守基本的Bloch方程，esr过渡态为单洛仑兹型时，这是指SAT由方程(8)给出SAT=αPYe2T1eT2e1+αPYe2T1eT2e+(ΔωT2e)2--(8)]]>(其中α为转换因子；P为VHF功率；而Δω为共振的VHF激发频率与非共振的VHF激发频率之差(当使用共振频率时，Δω当然为0))。
在体内大样品图像中，转换因子α随空间变化很大，因此仅仅知道P、SAT、Ye和Δω本身还不足以确定氧浓度。
而且，在大多数情况下，由于自由基分子间存在磁偶合，esr过渡态并不是单洛仑兹型的。其中对于窄esr线幅的自由基(例如这里提到的三苯甲基自由基)来说，偶合常数远小于线幅，共振线型将变为沃伊特函数，SAT将是由方程(9)中的高斯型强度函数加权的所有非共振值的积分SAT=1-2π1ΔHppG∫-∞∞exp(-2H′2/ΔHppG2)1+43(ΔH-H')2/ΔHppL2)1+43(ΔH-H')2/ΔHppL2+23αPγeT1e/ΔHppL)dH']]>(其中ΔHGPP和ΔHLPP为高斯型函数和洛仑兹函数的峰对线宽的一级导数，磁场单元ΔH是非共振磁场)。
方程(8)和(9)分别适用于均匀变宽的和非均匀变宽的单个esr峰。对具有大的偶合常数、分得较开的谱峰来说，饱和度以对应于远离共振分数的因子减小(氮氧化合物由于氮偶合其因子为1/3，三苯甲基由于多重13C偶合其因子为0.8)。
在本发明的方法中，数据处理大体上是把以象素/象素为基础而测得的SAT拟合到方程(8)或(9)之一中，求出T1e，T2e或T1e·T2e，再以象素/象素为基础这样就从方程(1)、(2)或(3)(或者是适合本方法中所用的自由基的等价方程)中计算出允许的象素氧浓度。
在本发明方法的一个优选的实施例中，以非均匀变宽方程(9)为基础进行数据处理来计算esr线幅。
本方法最基本地需要产生3个OMRI图像，然而还可以并且优选地附加一些在非共振条件下记录的图像，而且优选附加在不同辐射时间下记录的图像和原始图像。
在本方法中，图像A、B和C按下列的基本方式记录AVHF功率PA.Δω＝0(即共振)ΔH＝0，辐照时间TVHF＝TVHF1BVHF功率PB(≠PA)，Δω＝0，辐照时间TVHF＝TVHF1CVHF功率PC(例如＝PA或＝PB)，Δω≠0(即非共振)ΔH≠0(例如10-20μT(100-200mG))，辐照时间TVHF＝TVHF1。
在这些条件下，象素强度可以书写为I=A{1-2π1ΔHppG∫-∞∞exp(-2H′2/ΔHppG2)1+43(ΔH-H')/ΔHppL21+43(ΔH-H')2/ΔHppL2+23αPγeT1e/ΔHppL)dH'}-B]]>(其中A＝增益×质子密度×rCradT1×(1-exp(-TVHF/T1))，对rCradT1＜＜1(增益是指体系增益因子，而质子密度是指象素的质子密度)；而B＝增益×质子密度×(1-exp(-TVHF/T1))。方程(10)有5个未知数T1质子密度、Crad、
和αT1e。
在大的增强值(例如大约10)、相对于T1较小的TVHF1、和在分布有自由基的流体介质中质子密度基本上均匀的情况下，B可以省去，可以在象素/象素的基础上，用分别从图像A、B和C得到的3个I值解出3个未知数Crad、ΔHLPP和αT1e。然后可以通过用增益和r计算A得到一个自由基浓度图像来确定自由基浓度(Crad)，再用确定的ΔHLPP值和自由基浓度图像，可以从方程(1)计算出氧浓度图像。
如果再产生两个图像(一个是在功率PA和辐照时间TVHF＝TVHF2(其中TVHF2≠TVHF1，例如TVHF2＝2×TVHF2)的共振条件下得到的图像D，另一个是用常规的MR技术、重复时间TR＝TVHF1、不需要VHF激发的条件下得到的图像E)，则用这种方法可以更加准确地测定氧浓度。图像E给出象素的初始强度I。
从象素的5个强度值可以计算出所有5个未知数，还得到一个浓度图像和用方程(1)可以确定氧浓度图像的ΔHLPP。
按照这种方法，如果把含有体液和自由基的参考样品进行样品表面(例如含有已知浓度的自由基的血管)处理，甚至可以把氧浓度图像调整到能更准确地表达浓度的程度。
本发明方法的另一个优选的实施例利用了方程(3)(即T1e·T2e乘积的方程)对氧浓度的更大的敏感性。但是这种方法需要确定α值，该α值给出象素的VHF磁场。
在这另一方法中，氧浓度和自由基浓度图像是从3个或更多个上述的图像中计算出来的。1/T1e图像是从这些图像计算出来的，而α图像则是通过把已经确定的1/T1e图像与αT1e图像相乘而计算得到。然后用例如一种多项式函数使α图像平滑。优选在上述所讨论的研究条件下处理参考样，如果这样做了的话，那么就可以利用在参考样点处有固定值的平滑函数使α图像平滑。这样减小了图像的统计误差并且使图像正规化，由于α对空间变化很迟钝，对固定的参考点将产生准确的α图象。
利用这种α-图像，可以计算出ΔHLPP与1/T1e的乘积，从这个值(该值依赖于1/T1e·T2e)和自由基浓度图像，可以计算出更精确的氧图像。
如果不使用参考样品管，那么还是可以计算出平滑的α-图像，但是在这种情况下，所确定的α-值被优选地用于从检测到的OMRI图像计算3个(或5个)变量，从所得的1/T1e计算进一步平滑的α-图像，重复该程序直至连续产生的α图像基本上不变化为止(即程序收敛于最佳配合)。
用于按照本发明的方法采集的数据的各种计算方法代表了在准确地测定样品中氧浓度方面一个重要的进步。虽然对具有大的esr线幅的自由基(典型地为氮氧自由基)来说，洛仑兹模型是线形的一个准确的近似值，但对于窄esr线幅的自由基来说，需要更加精确的线形分析，使之对氧浓度的更加准确的测定。
这样，本发明的方法可导致真实的氧浓度和计算出的氧浓度之间的一致性因子典型地小于或等于大约5％(对于一个3×3×10mm体积单元、100秒的采集时间、0-0.1mM的氧浓度和0.1-0.2mmol/kg体重、样品典型地为人体大小来说)。
为了能够计算VHF磁场的空间变化，用上述的另一方法得到纵向驰豫时间(或纵向驰豫时间与横向驰豫时间的乘积)的一个绝对数值。纵向驰豫时间(甚至更是纵向驰豫速率和横向驰豫速率的乘积)对氧更加敏感，因而总体上讲这种方法是比较敏感的技术。
虽然上述方法着重于利用沃伊特函数来计算各种未知的参数，但是本发明方法同样可以用洛仑兹型函数，其中这些函数是esr线形的一个精确模型，而这样的一种方法构成了本发明的又一个实施方案。例如在大线幅的自由基(典型地为氮氧自由基)中，非均一性效应可以忽略，该线形基本上是洛仑兹型。因此，在这个优选的实施方案中，数据处理步骤的主要目的在于把SAT(例如在象素/象素基础上确定的)拟合到方程(8)，在象素/象素基础上求出T1e，T2e和T1e·T2e，从而能够从经验关系(例如方程(1)，(2)和(3))确定氧浓度。
在实践中，可能有必要对本发明方法中的流动效应进行补偿，所采取的合适步骤对本领域技术人员来说都是已知的。其它参数例如样品粘度、pH值、温度、自由基自动变宽等，一般只是二级效应，因而与本发明方法中的顺磁性氧的一级效应相比可以忽略。但是在方程1-3中对自由基自动变宽作了校正。
一般地讲，本发明方法可以使用任何常规的、在生理条件下稳定的长寿命自由基，该长寿命自由基具有足够长的半衰期(至少一分钟，优选至少一小时)，具有长的电子驰豫时间和良好的驰豫性。根据对发明方法的讨论，很显然对于具有窄线幅esr过渡态的自由基(例如最高达500mG，优选小于150mG，特别优选小于60mG)来说，氧测定的敏感性将得到提高。通过举例说明，对于用500mG/mMO2的谱线变宽表示的一种典型的氧敏感性来说，具有与T2e相关的500mG线幅的自由基(例如Lurie等人在J.Mag.Reson.76366-370(1988)上所提出的那种氮氧自由基)在氧浓度增大0.1mM时，其线宽只增加10％，而对于一个50mG线幅的自由基来说，氧浓度增大同样数量时，其线幅都增大100％。
优选地，选择用于本发明方法的自由基应当基本上扩散到细胞外液中(例如应当是一种ECF试剂)，这是因为在细胞外液中可以避免受顺磁性铁(例如在红细胞中的铁)的影响。
用于本发明方法的自由基的又一个优选的特征是它们应当有低的自变宽效应，优选使每mM的自由基其自变宽效应小于100mG，特别优选使其自变宽效应处于0与50mG之间。
一类特别优选的特别适用于本发明方法的具有很小的esr线宽和自变宽效应的化合物是在WO-A-91/12024，US-A-5530140和美国专利申请号08/467,273(Nycomed Innovation AB)和国际专利申请号PCT/GB95/02151中所讨论的三芳基甲基自由基(以后称为“三苯基甲基自由基”)以及它们的氘代类似物。
特别优选的用于本发明方法的三苯基甲基自由基是下式的自由基及其盐、前体和氘代类似物
其中n为0，1，2或3；R1为羧基或其衍生物；R2为氢或可以被羟基化或烷氧基化的C1-6的烷基，其中烷氧基本身可以被羟基化，优选为CmH3、CmH2OH或CmH2(OR3)基(其中m为1或2，即2H为氘，而其中的R3为可以被羟基化的C1-6的烷基，优选为可以被羟基化的乙基)。
很自然地，这种定义是为了把能够在给药前或甚至在给药时发生一个产生自由基的步骤而产生自由基的自由基前体覆盖进去。自由基前体和产生自由基的步骤已为本领域的技术人员所熟知。特别优选的三苯基甲基自由基是下式的自由基(此处分别指全氘代的三苯基甲基自由基、没有氘代的羟基三苯基甲基自由基、氘代的羟基三苯基甲基自由基和对称的三苯基甲基自由基)
和下列的化合物及其氘代的类似物
适用于本发明方法的自由基的制备在很多情况下都是熟知的合成方法，而在另外的情况下例如在WO-A-91/12024，US-A-5530140和美国专利申请号08/467,273(Nycomed Innovation AB)中讨论过。全氘代的三苯基甲基自由基可以用下面的实施例15-20中所述的制备其没有氘代的羟基三苯基甲基自由基的方法来制备，但是在开始的缩酮化步骤(如WO-A-91/12024的实施例2所述)中要用六氘代的丙酮代替丙酮。氘代的羟基三苯基甲基自由基一般是通过连续的稠环形成和氘代的还原步骤，然后是类似于在下面的实施例23-27中所述的制备其没有氘代的类似物的方法中所述的步骤而制备的，也可以按照实施例33-37来制备。
形成本发明的另一个方面的化合物是下式的化合物
其中n为0，1，2或3；R1为羧基或其衍生物；R2为氢或可以被羟基化或烷氧基化的C1-6的烷基，其中烷氧基本身可以被羟基化，优选为CmH3、CmH2OH或CmH2(OR3)基(其中m为1或2，即2H为氘，而其中的R3为可以被羟基化的C1-6的烷基，优选为可以被羟基化的乙基)。
条件是假如n为0，2或3，则至少有一个R2是烷氧基化的C1-6的烷基，其中烷氧基本身可以被羟基化；及其盐、前体、氘代的类似物，特别是下式的化合物及其氘代的类似物。
另一类特别用于本发明方法的自由基化合物是氘代的氮氧自由基，特别是具有很窄线宽的全氘代的2，5-二叔丁基-3，4-二甲氧基羰基-吡咯氧基。这些化合物可以通过使2，5-二叔丁基-3，4-二甲氧基羰基-吡咯氧基的甲基酯部分进行氘代来制备，该氘代是用四氘代的甲醇和/或叔丁基经过一个以六氘代的丙酮开始的多步程序发生酯基转移作用而实现的。
用于体内成像的自由基化合物当然应当是一种生理上可接受的自由基或以生理上可接受的剂型(例如以溶液、胶囊，或前体形式)存在的自由基。自由基可以方便地与常规的药物载体或赋形剂一起配制成造影介质。
本发明所用的造影介质除含有惰性自由基(或者是刚好在给药前形成自由基的非自由基前体)外，还含有制剂用的辅剂例如常规用于医疗和兽医中作为治疗和诊断组合物的辅剂。这样的介质的例子可以包括助溶剂、乳化剂、增粘剂、缓冲剂等。该介质可以是适于胃肠外给药(例如静脉注射)或胃肠给药(例如口服)的剂型，例如直接用于具有外空腔(例如消化道、膀胱和子宫)的体腔，或用于注射或灌注到心血管系统、肌肉或其它组织的剂型。然而，一般优选用生理上可接受的介质制成的溶液、悬浮液和分散液。
用于体内诊断成像的介质(优选基本上是等渗的)，可以方便地以足以在成像区使自由基的浓度达到1μM-10mM、优选达到0.05-1mM、特别优选达到0.1-0.3mM的浓度给药。然而，精确的浓度和剂量当然依赖于多种因素例如毒性、器官对造影剂的定位能力和给药方式，最佳的自由基浓度是综合各种因素的结果。总之，在大多数情况下最佳浓度处于0.1-100mM，优选处于0.2-10mM，更优选处于0.5-5mM的范围。用于静脉给药的组合物将优选含有1-1000mM、特别优选含有5-500mM浓度的自由基。对于离子性材料，特别优选的浓度范围为5-200mM、最优选10-150mM，而对于非离子性材料，特别优选的浓度范围为20-400mM、最优选30-300mM。
因此，从另一方面来看，本发明提供了把长寿命自由基、优选具有小的esr固有线宽的自由基、特别优选三苯基甲基自由基，用于测定体内氧浓度的方法。
下面的实施例是为了以一种非限定性的方式阐述本发明。实施例用NMRD、动态核极化(DNP)和ESR(实施例1-4)研究了下面四个水溶性的、单一ESR谱线的三苯基甲基自由基。
(1)双-(8-甲酸钠基-2，2，6，6-四-(三氘代甲基)-苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)-二硫杂环戊烯-4-基)-单-(8-甲酸钠基-2，2，6，6-四-(三氘代甲基)-苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)-二氧杂环戊烯-4-基)甲基。
这里是指下列的全氘代的三苯基甲基自由基(MW＝1080)。
2)双-(8-甲酸钠基-2，2，6，6-四-羟甲基-苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)-二硫杂环戊烯-4-基)-单-(8-甲酸钠基-2，2，6，6-四-羟甲基-苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)-二氧杂环戊烯-4-基)甲基。
这里是指下列的非氘代的羟基三苯基甲基自由基(MW＝1129)。
(3)双-(8-甲酸钠基-2，2，6，6-四-(羟基二氘代甲基)-苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)-二硫杂环戊烯-4-基)-单-(8-甲酸钠基-2，2，6，6-四-甲基-苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)-二氧杂环戊烯-4-基)甲基。
这里是指下列的氘代的羟基三苯基甲基自由基(MW＝1145)。
(4)三-(8-甲酸钠基-2，2，6，6-四-(三氘代甲基)-苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)-二硫杂环戊二烯)甲基。
这里是指下列对称的三苯基甲基自由基(MW＝1151)。
实施例1分别在23℃和37℃下，在水、血浆和血液中测定驰豫和DNP增强，结果数据在表1和2中列出。
表1在血浆和血液中测定的氘代的羟基三苯基甲基自由基的NMRD图象和DNP增强曲线的参数
表2在不定浓度和功率下，三种自由基在水中的驰豫和增强值
实施例2通过在23℃和37℃下对水中、等渗盐水中、血浆中和血液中氘代的羟基三苯基甲基自由基以及对水中和等渗盐水中全氘代的和对称的三苯基甲基自由基的CW ESR光谱和DNP数据进行分析而测定电子自旋驰豫速率，结果列于表3中；表3以mG/mM峰间值表示的三种自由基在等渗盐水中以及其中氘代羟基三苯基甲基自由基在37℃血浆和血液中浓度依赖性的驰豫速率。
实施例3在水和血浆中于37℃下，用ESR在9GHz的X-波段对全氘代的三苯基甲基自由基和非氘代的羟基三苯基甲基自由基进行测氧计校准。试验在配有温度控制器的Varian光谱仪的X-波段上进行。在微波阱附近放置一个热电偶以便准确地测定温度。把样品置于薄壁聚四氟乙烯毛细管中，使其与一种流动的气体混合物快速达到平衡。用一种医学传感器氧分析仪OM-11测定该流动气体中氧的百分含量。用于控制温度的气体压力和氧压力维持在20psi。测量电子自旋共振的线宽和饱和度。选择弗莱米斯盐作为B1校准标准，得到38.6±0.2mG/
的转换因子。
图2和图3示出了线宽随氧浓度变化的结果。在37℃下血浆中全氘代的三苯基甲基自由基的氧变宽系数为583mG/mMO2。实施例4分别在23℃和37℃下用ESR和DNP于水中和血液中以260Hz检测氘代的羟基三苯基甲基自由基对氧的敏感性。所需的氧分压通过一个简易的摇动式张力计达到。把1-2ml体积的样品与一种缓缓流过样品的水饱和的气体混合物一起摇振5分钟，样品和气体置于恒温水浴中，气体混合物是高纯度的并且经过化学分析。结果示于图4-7和表4中。在37℃和23℃下在水中的洛仑兹型线变宽系数分别为511和369mG/mMO2，而在23℃在血液中的洛仑兹型线变宽系数为329mG/mMO2。
表4在23℃和37℃下，水中和血液中氘代的羟基三苯基甲基自由基的驰豫速率mG/mM峰/峰值和DNP倒数曲线(mG/mM)斜率的平方根随氧浓度的变化
实施例5下列试验是用羟基三苯基甲基自由基(如上述所定义的)在PickerNordstar MEGA4 250-300 MR仪器上进行的，通过把主磁场强度从0.1减小到0.01T，并且配置能发射具有200-300MHz范围频率和0-100W范围功率的VHF射线的VHF发射器而使该仪器适用于OMRI。(a)具有不同自由基浓度和氧压力的血液样品计算三种不同的自由基剂量2.0mM，4.0mM和6.0mM的血液样品中的自由基浓度和氧图象，结果示于图8中。参数扫描时间 436分钟TR/TE270ms/20ms狭缝 4mm象素大小 0.5×0.5mm2平均值 2T-vhf200ms采样时间 24ms样品频率 21kHz
样品基板 512×256(在阅读方向过量采样)记录仪基板 256×256(b)OMRI测氧法在体重为120g的大鼠吸入不同氧含量的气体后，得到了显示体内氧浓度的三个图象。向尾静脉中注入1.5ml浓度为1.5mmol/kg的自由基药剂，注射时间为10s(在得到第一个图象前10s)，结果示于图9中。参数扫描时间328分钟TR/TE 270ms/20ms狭缝5mm象素大小0.75×0.75mm2平均值 2T-vhf 200ms采样时间24ms样品频率21kHz样品基板512×192(在阅读方向过量采样)记录仪基板 192×192(c)OMRI测氧法在体重为125g的大鼠吸入不同氧含量的气体后，得到了显示体内度的五个图象。向尾静脉中注入1.5ml浓度为1.5mmol/kg的自由基药剂，注射时间为15s(在得到第一个图象前15s)，结果示于图10中。参数扫描时间328分钟TR/TE 270ms/20ms狭缝5mm象素大小0.75×0.75mm2平均值 2T-vhf 200ms采样时间24ms样品频率21kHz样品基板512×192(在阅读方向过量采样)
记录仪基板 192×192(d)OMRI测氧法对于肺中所测得的氧压与吸入的气体中的氧含量之间相关性进行了试验研究。向体重150g的大鼠尾静脉中注入0.5ml浓度为1.0mmol/kg的自由基药剂，注射时间为10s(在得到第一个图象前10s)，结果示于图11中。参数扫描时间144分钟TR/TE 270ms/18ms狭缝5mm象素大小1.0×2.0mm2平均值 2T-vhf 200ms采样时间24ms样品频率21kHz样品基板512×96(在阅读方向过量采样)记录仪基板 192×96(e)OMRI测氧方法在定位后，得到一张高功率图象和一张计算出来的氧图象。向体重132g的大鼠尾静脉中注入1.0ml浓度为2.0mmol/kg的自由基药剂，注射时间为60s(在得到第一个图象前15分钟)，在定位后8分钟开始成像，结果示于图12中。
参数扫描时间328分钟TR/TE 270ms/20ms狭缝8mm象素大小1.0×1.0mm2平均值 2T-vhf 200ms采样时间24ms样品频率21kHz样品基板512×192(在阅读方向过量采样)
记录仪基板 192×192实施例6也研究了可用于本发明方法的一系列部分氘代的和全氘代的氮氧自由基(化合物3b-d)，这些自由基从2，5-二叔丁基-3，4-二甲氧基羰基-吡咯氧基(化合物3a)衍生而来，把它们与TEMPONE(4-氧杂-2，2，6，6-四甲基-哌啶-1-氧基，1)和CTPO(3-氨基甲酰基-2，2，5，5-四甲基-吡咯啉-1-基氧基，2a)(这些是典型的常用于成像目的的氮氧化物的例子)一起研究。
材料.4-氧杂-2，2，6，6-四甲基-哌啶-1-氧基，1(Jansen，95％)，4-氧杂-2，2，6，6-四甲基-哌啶-十六氘代-1-氧基，1-16氘代(MSD同位素，98％的原子被氘代)和2，2，5，5-四甲基-3-吡咯啉-十三氘代-氧基-3-羧酸，2b-十三氘代(MSD同位素，97.5％的原子被氘代)用原装的。2，2，5，5-四甲基-3-吡咯啉-1-氧基-3-羧酸，2b，从早期的工作中得到。甲基-4，4-二甲基-3-氧杂-戊酸盐(Aldrich，99％)(5a)，三甲基甲硅烷碘化物(TMSI，Jansen，97％)，六氘代丙酮(Glaser AG，氘代率＞99.5％)和四氘代甲醇(CIL，氘代率＞99.8％)用原装的。十二氘代的3，3-二甲-2-丁酮(频哪酮)从Organic Synthesis Coll.，1，459-462的非氘代化合物部分所述的六氘代的丙酮得到。乙醚(含水＜0.01％)在使用前用中性氧化铝过滤。氢化钠(Aidrich，80％的矿物油悬浮液)和过氧化镍(Aidrich)用原装的。所有其它的化学试剂都是原装的、商业上可得到的最高级别的试剂。
仪器ESR光谱用Brucker ER-200D SRC仪器的精装型ESP 3200-200SH在22°下测定。自由基浓度范围为0.1-0.2mM，调制幅度10mG，微波功率远远低于饱和功率。NMR光谱在Varian XL-300光谱仪上记录。质谱用装配有ESPC电子喷雾器的VG Quattor II仪器记录。GLC分析在配有熔融石英柱(30m，0.25μm，HP-1701)的HP 5830 II型仪器上进行。TLC分析和柱色谱分离用硅胶-60，以庚烷/乙醚作洗脱液。
5c的制备按照J.Am.Chem.Soc.，72，1356(1950)所述的制备非氘代的化合物的方法，使NaH(22.9g，0.77mol)和碳酸二甲酯(64.1，0.77mol)与十二氘代的3，3-二甲-2-丁酮(32.4g，0.29mol)作用，得到5c(28.1g，0.17mol，59％)，沸点98-100℃/6mm。1H NMR(CD3OD)δ3.72(s，3H).13C NMR(CD3OD)δ209.0(-CO-)，168.8(-COO-)，51.2(-CH3)，43.7-42.0(m，-CD2)，25.0-23.5(m，-CD3)。
5b和5d的制备把未氘代的甲酯(5a，5c)溶解于CD3OD中，与2％mol的NaOCD3作用。蒸发后，重复该程序。当用NMR鉴别不出甲基上有质子时，认为酯交换反应已经完成。蒸发该混合物，加入乙醚，再蒸发，不再需要进一步纯化就可用于下一步反应中。
6d的制备在氩气气氛和搅拌下，在2小时内，向Na(1.22g，53mmol)的15ml乙醚悬浮液加入5d(8.5g，49mmol)的30ml乙醚溶液。搅拌4小时后，以1小时的时间加入I2(6.35g，25mmol)的50ml乙醚溶液。混合物放置过夜，把所得的白色悬浮液倒入乙醚/饱和氯化钠溶液。水层用乙醚萃取两次，合并的有机层通过MgSO4干燥、蒸馏和色谱分离，收集到4.8g(14mmol，56％)无色的油状物6d，该油状物由一个非对映体混合物组成，在其中的两个不对称的(及酸的)碳原子发生了不完全的氘代。13C NMR(CD3OD)209.0+208.1(-CO-)，168.5+168.2(-COO-)，53.7-53.0(m，-CD2-+-CHD+-CH2-)，51.7-50.7(m，酯-CD3)，25.0-23.5(m，-CD3)。质谱(ESP+)，m/z379(M+39)，363(M+23)。类似地，6a-6c可以从5a-5c制得，产率40-60％。
7d的制备把NaOCOCH3(1.78g，13.0mmol)，NH2OHxHCl(0.80g，11.5mmol)溶于13ml水而成的溶液与6d(2.80g，8.2mmol)溶于35ml CH3COOH而成的溶液混合，在65℃搅拌72小时。冷却混合物并蒸去大部分溶剂，把残留物倒入乙醚/NaHCO3水溶液，水层用乙醚萃取。合并的乙醚层通过Na2SO4干燥，所得的油状物经色谱分离得到1.6g回收的原料。然后与肟(0.025g，0.07mmol，2.0％)和7d(0.065g，0.19mmol，5.4％)作用，得到白色结晶，熔点156-158℃。1HNMR(CD3CN)δ9.82(s，1H)。13C NMR(CD3CN)68.3，136.5，109.3，52.2-50.9(m，酯-CD3)，33.5，30.2-28.1(m，t-CD3)。质谱(ESP-)，m/z334(M-1)。同样得到了7a1HNMR((CD3)2CO)δ9.80(s，1H)，3.67(s，6H)，1.40(s，18H)。质谱(ESP-)，m/z310(M-1)。7b1H NMR((CD3)2CO)δ9.80(s，1H)，1.40(s，18H)。13CNMR((CD3)2CO)δ167.1，135.3，108.7，45.8-44.7(m，CD3)，33.4，29.3。质谱(ESP-)，m/z316(M-1)。7c1H NMR((CD3)2CO)δ9.87(s，1H)，3.63(s，6H)。13CNMR((CD3)2CO)δ167.1，135.3，108.7，50.9，32.3，29.7-28.2(m，CD3)。质谱(ESP-)，m/z328(M-1)。
3a-3d的制备3a是按照前面所说的、Bull.Soc.Chim.France，72，4330(1970)中制备乙酯的方法，从甲基酯5a制得，相似地，3b是通过5a的酯交换反应而制得的。3a，6a，和7a的甲基酯部分很难发生酯交换和常规的水解，这意味着在制备3b时，在二聚步骤之前进行酯交换步骤。制备3c和3d时，先进行六氘代丙酮的频哪醇化反应，然后进行频哪醇重排和羧基化反应，得到5c，酯交换反应、二聚合及与羟基胺的闭环反应如下列的反应简式所示。可以从反应混合物中分离出中间体肟(产率与闭环产物相近)，而这些中间体在其它的同等条件下将单独转变为羟基胺，或者简单地转入下一轮合成中。使7a与TMSI在CdCl3中水解，以中等产率得到二羧酸4。
i. NaH，(CH3)2OCO ii. CD3OD，催化量NaOCD3iii.a)Na/乙醚 b)I2iV. NH2OH，CH3COOHv. NiOOH反应简式1吡咯氧基自由基的制备向经过脱气的2mg羟基胺7a-7d溶于2ml苯而成的溶液中加入大约10mgNiOOH，5分钟后，过滤悬浮液，用脱气的苯稀释淡兰绿色的溶液以制得一种适于ESR测定的溶液。
2，5-二叔丁基-N-羟基-吡咯-3，4-二羧酸(4)的制备当按照上述的酯交换反应条件处理7a时，在加猪肝酯酶或在标准的碱水解条件下作用时，没有观察到反应。把7a(0.09g，0.29mmol)溶于10ml干燥的CDCl3，并加入TMSI(0.240g，1.20mmol)。加热到55℃过夜后，混合物用40mlCH2Cl2稀释，用饱和NaCl水溶液洗涤，用几滴溶于饱和NaCl水溶液的Na2S2O4溶液洗涤，最后用饱和NaCl水溶液洗涤。经过Na2SO4干燥和蒸发后，把残余的固体溶于9∶1的庚烷-乙醚中，蒸发并用庚烷研制，得到无色结晶的二羧酸4(0.040g，0.14mmol，49％)。1H NMR((CD3)2CO)δ1.50(s)。13CNMR((CD3)2CO)δ159.5，141.0，108.2，33.7，29.2。质谱(ESP-)，m/z264(M-19)。按上述方法与NiOOH作用后，记录到几乎与3b相同线宽的ESR信号。
ESR测量表5中所概括的是上述的氮氧自由基的ESR线宽。所有的光谱都是在22℃下用仔细脱气的苯高度稀释后记录下来的。全氘代导致1的线宽降低2.2倍，2b的线宽降低2.5倍。对于3a-d的氮氧化物，酯部分的烷基氘代引起线宽降低1.9倍(3c3d)，而只有叔丁基氘代时，对线宽几乎没有影响(3a3e)。发现，在迄今为止所记录下的氮氧化物中，全氘代的氮氧化物3d具有最窄的线宽113mG，氮偶合常数4.4G(在苯中)。在表6中，就自旋密度分布、氮偶合常数和固有线宽，把3d与其它的氮氧化物作了比较。
表5在23℃下，未氘代的和全氘代的氮氧化物在苯中的ESR线宽
表6一些氮氧化物的自旋密度分布、氮偶合常数和固有线宽
a对PO+PN≤1实施例72，2，6，6-四(乙氧基羰基)苯并[1，2-d4，5-d’]双(1，3)二硫杂环戊烯
反应在氩气气氛下，用脱氧的溶剂进行。把1，2，4，5-苯并四硫醇(1.50g，7.3mmol)和K2CO3(4g)与干燥的DMF(70ml)混合，加入二溴代丙二酸二乙酯(4.26g，14.6mmol)的DMF(15ml)溶液。把混合物加热到60℃并搅拌65小时。冷却到室温后，把反应混合物倒入冰水中，然后用CH2Cl2(2×100ml)萃取，合并有机相，用水(4×50ml)洗涤，干燥(Na2SO4)并蒸发。产率3.32g(88％)。1HNMR(CDCl3)6.97(s，2H)，4.29(q，J＝7.2Hz，8H)，1.28(t，J＝7.2Hz，12H)。实施例82，2，6，6-四(乙氧基羰基)-4，8-二溴代苯并[1，2-d4，5-d’]双(1，3)二硫杂环戊烯
把2，2，6，6-四(乙氧基羰基)苯并[1，2-d4，5-d’]双(1，3)二硫杂环戊烯(10.7g，20.6mmol)溶于冰醋酸中，加入溴(16.5g，0.103mol)。溶液在65℃下搅拌17小时，加入Na2S2O4水溶液。水溶性浆液用CH2Cl2(3×100ml)萃取，合并有机相，用水(3×50ml)洗涤，干燥(MgSO4并蒸发。残留物用CH3CN研制，干燥。产率10.1g(72％)。
1HNMR(DMSO-d6)4.28(q，J＝7.2Hz，8H)，1.21(t，J＝7.2Hz，12H)。实施例94，8-二溴代苯并[1，2-d4，5-d’]双(1，3)二硫杂环戊烯-2，6-二螺环-(4，4-二甲基-3，5-二噁烷)
把2，2，6，6-四(甲氧基羰基)-4，8-二溴代苯并[1，2-d4，5-d’]双(1，3)二硫杂环戊烯(6.76g，10.0mmol)溶于干燥的THF中，溶液冷却到0℃，滴加DIBAL的甲苯(17.8ml，100mmol)溶液。将溶液加热回流3小时，然后冷却到室温。滴加甲醇(20ml)，然后加水(60ml)，用6MHCl把pH值调节到2。蒸发除去除水之外的溶剂，过滤收集沉淀。产物用水、乙腈洗涤，干燥，然后悬浮于干燥的丙酮(600ml)中。加入BF3·Et2O(2.52ml，20mmol)，溶液搅拌20分钟，加入固体K2CO3(6.0g)，再继续搅拌5分钟。通过一个短的碱性氧化铝填料柱过滤后，蒸发除去溶剂，残留物用CH2Cl2研制，干燥。产率1.12g(19％)。
1HNMR(DMSO-D6)4.15(s，8H)，1.37(s，12H)。实施例104-溴代苯并[1，2-d4，5-d’]双(1，3)二硫杂环戊烯-2，6-二螺环-(4，4-二甲基-3，5-二噁烷)
在氩气气氛下，把4，8-二溴代苯并[1，2-d4，5-d’]双(1，3)二硫杂环戊烯-2，6-二螺环-(4，4-二甲基-3，5-二噁烷)(1.14g，1.94mmol)溶于干燥的THF中。溶液冷却到-45℃后，滴加正丁基锂的环己烷溶液(2.5M，2.02mmol)。搅拌5分钟后，加入甲醇(3ml)，让溶液恢复到室温，蒸发除去溶剂。产物用硅胶柱色谱纯化(以CH2Cl2和甲醇的混合物(99.5∶0.5)作洗脱液)。产率0.70g(71％)。
1HNMR(CDCl3)6.80(s，1H)，4.15(s，8H)，1.37(s，12H)。实施例11三(苯并[1，2-d4，5-d’]双(1，3)二硫杂环戊烯-4-基-2，6-二螺环-(4，4-二甲基-3，5-二噁烷))甲醇
在氩气气氛下，把4-溴代苯并[1，2-d4，5-d’]双(1，3)二硫杂环戊烯-2，6-二螺环-(4，4-二甲基-3，5-二噁烷)(0.99g，1.94mmol)悬浮于干燥的乙醚(28ml)中，滴加正丁基锂的环己烷溶液(2.5M，1.94mmol)。5分钟后，缓慢加入碳酸二乙酯(0.078ml，0.64mmol)的乙醚(3ml)溶液。搅拌18小时后，加入乙醇(5ml)，蒸发除去溶剂。产物用硅胶柱色谱纯化(以CHCl3和乙酸乙酯的混合物(20∶1)作洗脱液)。产率0.65g(71％)。
1HNMR(CDCl3)7.16(s，1H)，6.01(s，1H)，3.86-4.22(m，24H)，1.43，1.41，1.37，1.32(4s，36H)。实施例12三(8-乙氧基羰基苯并[1，2-d4，5-d’]双(1，3)二硫杂环戊二烯-4-基-2，6-二螺环-(4，4-二甲基-3，5-二噁烷))甲醇
在氩气气氛下，把三(苯并[1，2-d4，5-d’]双(1，3)二硫杂环戊烯4-基-2，6-二螺环-(4，4-二甲基-3，5-二噁烷))甲醇(0.205g，0.156mmol)溶于含有N，N，N’，N-四甲基乙二胺(0.33ml，2.18mmol)的干燥的苯中，滴加正丁基锂的戊烷溶液(1.5M，2.18mmol)并持续搅拌40分钟。然后把溶液转移到另一个在0℃恒温并含有焦碳酸二乙酯(1.3ml，8.82mmol)和苯(6ml)的烧瓶中。搅拌45分钟后，加入NaH2PO4的水缓冲液，分离出有机相，用水洗涤并蒸发。产物用制备性的HPLC纯化。产率55mg(23％)。
1HNMR(CDCl3)6.68(s，1H)，4.41-4.52(m，6H)，3.86-4.21(m，24H)，1.22-1.60(m，45H)。实施例13三(8-乙氧基羰基-2，2，6，6-四羟基甲基苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)-二硫杂环戊烯-4-基)甲醇
在氩气气氛下，把三(8-乙氧基羰基苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)-二硫杂环戊烯-4-基-2，6-二螺环-(4，4-二甲基-3，5-二噁烷))甲醇(55mg，0.0359mmol)溶于冰醋酸(20ml)和水(5ml)的混合物中，溶液在室温下搅拌42小时。蒸发除去溶剂，痕量的酸通过加入苯后蒸发的办法除去。HPLC分析表明产物纯度大于98％。产率42.4mg(91％)。
MS(ESP-，m/e)1293(M+，68％)，1291([M-2]-，100％)。实施例14三(8-羧基-2，2，6，6-四羟基甲基苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)-二硫杂环戊二烯-4-基)甲基钠盐
把三(8-乙氧基羰基-2，2，6，6-四羟基甲基苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)-二硫杂环戊烯-4-基)甲醇(3.4mg，0.0026mmol)溶于乙腈(2ml)中，溶液冷却到0℃。加入三氟甲磺酸(0.017ml)。15分钟后，加入SnCl2(0.4g)的乙腈(1ml)。再过15分钟，加入NaH2PO4的水缓冲液，蒸发除去溶剂，把残留物悬浮于水中，用1M的NaOH水溶液把pH值调节到12。搅拌1小时后，用1M的HCl水溶液中和溶液，蒸发除去溶剂。产物用制备性的HPLC纯化。产率2.0mg(60％)。
ESR(在水中的浓度为1.5mM，100G)单重峰，线宽100mG。
该化合物也可用于本发明方法中。实施例152，2，6，6-四甲基苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)-二氧杂环戊烯-4-羧酸
在氩气气氛下，把2，6，6-四甲基苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)-二氧杂环戊烯(10.0g，45.0mmol；按照WO-91/12024的方法制备)溶于干燥的THF中(200ml)中。溶液冷却到-20℃，加入加正丁基锂(20.0ml，50.0mmol)的己烷溶液。恢复到室温后，把反应混合物转移到固体二氧化碳(150mg)上并放置过夜。加入水(200ml)，用2M的NaOH水溶液把pH值调节到10。用乙醚洗涤后，水相用2M的盐酸酸化到pH＝2，然后用乙醚萃取(2×300ml)。把有机相干燥(Na2SO4)并蒸发，得到纯的产物。产率10.7g(89％)。1H NMR(CDCl3，300MHz)δ6.50(s，1H)，1.71(s，12H)。13C NMR(CDCl3，75MHz)δ165.1，140.9，140.8，119.8，98.9，97.3，25.6。实施例162，2，6，6-四甲基苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)-二氧杂环戊烯-4-羧酸甲酯
把2，2，6，6-四甲基苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)-二氧杂环戊烯-4-羧酸(10.0g，38.0mmol)溶于干燥的THF中(100ml)中，加入碳酸钾(15.2g，110.0mmol)。混合物加热到55℃，反应30分钟。冷却到室温后，加入碘甲烷(15.6g，110.0mmol)，溶液搅拌过夜。过滤掉沉淀后，蒸发溶液，将残留物溶解于饱和的NaHCO3水溶液和乙醚中。倒去水层，把有机相干燥(Na2SO4)，过滤，蒸发，得到9.4g(88％)纯的产物。1H NMR(CDCl3，300MHz)δ6.44(s，1H)，3.85(s，3H)，1.65(s，12H)。13C NMR(CDCl3，75MHz)δ163.4，140.8，140.6，119.0，99.9，99.4，51.8，25.6。实施例17双-(2，2，6，6-四甲基苯并[1，2-d4，5-d’]双(1，3)二硫杂环戊烯-4-基)-单-(2，2，6，6-四甲基苯并[1，2-d4，5-d’]双(1，3)二氧杂环戊烯-4-基)甲醇
把2，2，6，6-四甲基苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)-二硫杂环戊烯(2.86g，10mmol；按照WO-91/12024的方法制备)溶于干燥的THF中(75ml)中并冷却到-70℃，加入加正丁基锂(4.4ml，2.5M的己烷溶液)。反应混合物恢复到室温后，加入固体的4-甲氧基羰基-2，2，6，6-四甲基苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)-二氧杂环戊烯(1.5g，5mmol)。1小时后，用饱和的NaH2PO4水溶液淬灭混合物的反应。倒去水层，蒸发有机层，将残留物溶解于二氯甲烷中，用水洗涤并干燥(Na2SO4)。产物用柱色谱纯化(二氯甲烷∶庚烷＝1∶1)，得到1.8g(44％)纯的产物。1H NMR(CDCl3，300MHz)δ7.10(宽的单峰，2H，ArH)，6.39(s，1H，ArH)，4.79(s，1H，OH)，1.82-1.56(m，24H，CH3)，1.53(s，6H，CH3)，1.46(s，6H，CH3)。实施例18双-(8-乙氧基羰基-2，2，6，6-四甲基苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)-二硫杂环戊烯-4-基)-单-(8-乙氧基羰基-2，2，6，6-四甲基苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)-二氧杂环戊烯-4-基)甲醇
在氩气气氛下，把双-(2，2，6，6-四甲基苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)二硫杂环戊烯-4-基)-单-(2，2，6，6-四甲基苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)-二氧杂环戊烯-4-基)甲醇(0.50g，0.61mmol)溶于干燥的苯中(6.0ml)中。加入加正丁基锂(2.44ml，1.5M的戊烷溶液)和TMEDA(0.545ml，3.66mmol)。用超声波处理反应混合物25分钟，然后缓慢加入碳酸二乙酯(7.2ml，59.4mmol)的干燥的苯溶液(16ml)。搅拌1.5小时后，加入NaH2PO4水溶液(50ml)。分离出有机层，用水洗涤，干燥(Na2SO4)并蒸发。产物用制备性的HPLC纯化后，得到130.0mg(21％)纯的产物。1H NMR(CDCl3，300MHz)δ4.98(s，1H)，4.28-4.37(m，6H)，1.48-1.79(m，36H)，1.46(t，6H，J＝7.0Hz)，1.38(t，3H，J＝7.0Hz)。13C NMR(CDCl3，75MHz)δ166.2，166.0，162.9，141.9，141.6，141.2，140.8，140.4，140.0，136.6，134.5，129.9，128.5，128.1，127.8，127.2，120.3，118.9，111.9，101.1，80.6，62.1，61.0，60.3，60.2，59.8，59.2，34.4，34.3，33.5，28.8，28.1，27.0，26.9，26.5，25.8。实施例19双-(8-乙氧基羰基-2，2，6，6-四甲基苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)-二硫杂环戊烯-4-基)-单-(8-乙氧基羰基-2，2，6，6-四甲基苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)二氧杂环戊烯-4-基)甲基
把双-(8-乙氧基羰基-2，2，6，6-四甲基苯并[1，2-d4，5-d’]双(1，3)二硫杂环戊烯-4-基)-单-(8-乙氧基羰基-2，2，6，6-四甲基苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)二氧杂环戊烯-4-基)甲醇(520mg，0.501mmol)与氯化锡(II)(95mg，0.501mmol)和乙腈(5ml)一起溶解于干燥并且脱气的二氯甲烷(15ml)中。加入BF3·Et2O(70μL，0.557mmol)，把溶液搅拌20分钟。加入二氯甲烷(80ml)后，用脱气的水(80ml)洗涤，分离出有机层，干燥(Na2SO4)过滤并蒸发。产物用制备性的HPLC纯化。产率110mg(22％)。ESR(THF，200G)单峰，线宽325mG。核极化效应增强值(THF，2.1mM)156(当微波功率为4W时)。稳定性测定值在没有排除空气的乙腈中的半衰期为2000小时。实施例20双-(8-羧酸钾-2，2，6，6-四甲基苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)二硫杂环戊烯-4-基)-单-(8-乙氧基羰基-2，2，6，6-四甲基苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)-二氧杂环戊烯-4-基)甲基
把双-(8-乙氧基羰基-2，2，6，6-四甲基苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)-二硫杂环戊烯-4-基)-单-(8-乙氧基羰基-2，2，6，6-四甲基苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)二氧杂环戊烯-4-基)甲基(132mg，0.129mmol)溶于乙醇(10ml)中，加入氢氧化钾水溶液(5ml，1.0M)，反应混合物在50℃下搅拌过夜。蒸去乙醇后，在50℃下搅拌混合物1小时，然后用2M盐酸酸化，水相用乙醚萃取，分离出有机层，干燥(MgSO4)，过滤并蒸发。产物用制备性的HPLC纯化。蒸馏组分，然后加水，水层用乙醚萃取，分离出有机层，干燥(MgSO4)，过滤并蒸发。加水和1MKOH(0.387ml，0.387mmol)溶解产物将溶液冻干。产率101mg(75％)。ESR(H2O，200G)单峰，线宽105mG)。核极化效应增强值(H2O，6.9mM)219(当微波功率为0.012W时)。实施例21苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)-二硫杂环戊二烯-2，2，6，6-四羧酸四乙酯
在氩气气氛下，把1，2，4，5-苯四硫醇(1.50g，7.28mmol)溶解于干燥的DMF(55ml)中，加入K2CO3(4.0g)和2，2-二溴代丙二酸乙酯(4.26g，14.6mmol)。溶液在室温下搅拌16小时，然后在60℃再搅拌5小时。然后把反应混合物倒入冰水混合物(200g，200ml)中，用乙酸乙酯(2×250ml)萃取。合并有机相，用水(4×100ml)洗涤，干燥(Na2SO4)并蒸发。把粗产物洗涤到不需要纯化就足以能用于下一步的纯度。产率3.05g(80％)。1H NMR(CDCl3，300MHz)δ6.91(s，2H)，4.29(q，J＝7.2Hz，8H)，1.38(t，J＝7.2Hz，12H)。实施例222，2，6，6-四(羟基二氘代甲基)-苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)-二硫杂环戊烯
把苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)-二硫杂环戊烯-2，2，6，6-四羧酸四乙酯(5.0g，9.65mmol)加入到索氏提取器的上部，把氘化铝锂(1.62g，38.6mmol)和乙醚(300ml)的混合物加入到提取器的下部的圆底烧瓶中。把乙醚加热回流20小时，然后使混合物冷却借助于水(50ml)来滴加甲醇(150ml)，用浓盐酸(20ml)酸化混合物，通过真空蒸发把溶剂减少到50ml，过滤出白色固体，用水(2×25ml)洗涤并干燥。产率3.15g(91％)。1HNMR(300Mhz，DMSO-d6)7.06(2，2H)，5.45(宽的单峰，4H)。实施例232，2，6，6-四(二甲基三甲丙基硅氧甲基)-苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)-二硫杂环戊烯
反应在氩气气氛下进行。
把2，2，6，6-四(羟甲基)-苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)-二硫杂环戊烯(0.8g，2.2mmol)溶解于DMF(20ml)中。加入咪唑(1.1g，15.8mmol)，将溶液冷却到0℃，滴加(大约2分钟)二甲基三甲丙基氯化硅(2.8g，15.8mmol)，溶液在室温下搅拌48小时。将反应混合物倒入冰/水中，加入CH2Cl2(100ml)，把两相分离。有机相用1MHCl和水(3×100ml)洗涤，干燥(Na2SO4)并蒸发溶液。产物通过以二氯甲烷-庚烷(1∶9)作洗脱剂的柱色谱纯化。产率1.1g(52％)。1H NMR(CDCl3，300MHz)δ6.84(s，2H，ArH)，3.94(s，8H，CH2)，1.62(七重峰，4H，J＝6.8Hz，CH)，0.88(d，24H，J＝6.8Hz，CH3)，0.08(s，24H，Si(CH3)2)。13C NMR(CDCl3，75MHz)δ134.3，115.8，74.2，65.0，34.2，25.1，20.3，18.6，-3.6。实施例24双-(2，2，6，6-四(二甲基三甲丙基硅氧甲基)-苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)-二硫杂环戊烯-4-基)-单-(2，2，6，6-四甲基苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)-二氧杂环戊烯-4-基)甲醇
反应在氩气气氛下进行。把2，2，6，6-四(二甲基三甲丙基硅氧甲基)-苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)-二硫杂环戊烯(7.0g，7.6mmol)溶解于干燥的DMF(50ml)中，将溶液冷却到-70℃，加入正丁基锂(5.0ml，1.6M的己烷溶液)，使温度恢复到室温，再搅拌1小时。在室温下真空蒸发除溶剂，加入乙醚(20ml)，然后一次性加入4-乙氧基羰基-2，2，6，6-四甲基苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)-二氧杂环戊烯(0.8g，2.9mmol)，反应混合物在室温下搅拌12小时。将混合物倒入NaH2PO4溶液中。把两相分离，水相用乙醚萃取(2×100ml)，把有机相干燥(Na2SO4)并蒸发，残留物用制备性的HPLC纯化。产率1.7g(62％)。1H NMR(CDCl3，300MHz)δ6.80(s，2H，ArH)，6.26(s，1H，ArH)，4.95(s，1H，OH)，3.80(宽的多重峰，16H，CH2)，1.5(宽的多重峰，20H，CH3+CH)，0.9(d，48H，CH3)，0.7(s，48H，CH3)，0.2(2s，48H，Si(CH3)2)。13C NMR(CDCl3，75MHz)δ141.5，140.3，139.8，139,6，131.7，118.6，117.1，108.1，94.4，80.0，65.4，34.1，25.9，25.0，20.3，18.7，-3.2。实施例25双-(8-乙氧基羰基-2，2，6，6-四(羟甲基)苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)-二硫杂环戊烯-4-基)-单-(8-乙氧基羰基-2，2，6，6-四甲基苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)二氧杂环戊烯-4-基)甲醇
在氩气气氛下，把双-(2，2，6，6-四(二甲基三甲丙基硅氧甲基)-苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)-二硫杂环戊二烯-4-基)-单-(2，2，6，6-四甲基苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)-二氧杂环戊烯-4-基)甲醇(3.2g，1.54mmol)与TMEDA(3.2ml，21.6mmol)一起溶解于庚烷(12.8ml)和苯(10.7ml)中。将溶液冷却到-22℃，加入叔丁基锂(14.4ml，1.5M的戊烷溶液)。在-22℃搅拌3小时后，把反应混合物转移到在-22℃恒温的焦碳酸二乙酯(12.8ml，87mmol)的庚烷和干燥的苯(23ml)溶液中，然后反应混合物恢复到室温，再搅拌1小时，加入饱和的NaH2PO4溶液(40ml)。把混合物搅拌1小时，分离出有机相，用水(2×100ml)和乙腈(2×100ml)洗涤。蒸发庚烷/苯相，然后溶解于THF(25ml)中，加入Bu4NF的THF(20ml，20mmol)溶液，混合物搅拌过夜。蒸去溶剂后，使残留物在水(300ml)和乙酸乙酯(300ml)之间进行相分配。有机相用水洗涤(2×100ml)，干燥(Na2SO4)并蒸发，经制备性的HPLC纯化，得到400mg(22％)纯的产物。1H NMR(CDCl3，300MHz)δ5.78-5.92(m，6H)，5.03-5.52(m，24H)，2.98-3.21(m，12H)，2.90(t，6H，J＝7.0Hz)，2.84(t，3H，J＝6.9Hz)。实施例26双-(8-乙氧基羰基-2，2，6，6-四(羟甲基)苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)-二硫杂环戊烯-4-基)-单-(8-乙氧基羰基-2，2，6，6-四甲基苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)二氧杂环戊烯-4-基)甲基
在氩气气氛下，把双-(8-乙氧基羰基-2，2，6，6-四(羟甲基)苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)-二硫杂环戊烯-4-基)-单-(8-乙氧基羰基-2，2，6，6-四甲基苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)二氧杂环戊烯-4-基)甲醇(294mg，0.25mmol)溶解于乙腈(70ml)中。将溶液冷却到0℃后，加入三氟甲磺酸(190μL，2.2mmol)，搅拌3分钟后，加入溶解在乙腈(7ml)中的氯化锡(II)(48mg，0.25mmol)。1分钟后，加入饱和的NaH2PO4溶液(50ml)，水相用乙腈(2×50ml)洗涤。将合并的有机相干燥(Na2SO4)并蒸发，经制备性的HPLC纯化，得到176mg(61％)纯的产物。ESR(H2O，200G)单峰，线宽433mG。实施例27双-(8-羧基-2，2，6，6-四(羟甲基)苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)-二硫杂环戊烯-4-基)-单-(8-羧基-2，2，6，6-四甲基苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)二氧杂环戊烯-4-基)甲基钠盐
把双-(8-乙氧基羰基-2，2，6，6-四(羟甲基)苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)-二硫杂环戊烯-4-基)-单-(8-乙氧基羰基-2，2，6，6-四甲基苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)二氧杂环戊烯-4-基)甲基(316mg，0.275mmol)溶解于1MNaOH水溶液(3ml)、水(1.5ml)和乙醇(3ml)中。溶液在室温下搅拌15分钟，蒸去乙醇，残留物在室温下再搅拌2小时。接近蒸干时，依次通过制备性的HPLC和冷冻干燥分离出纯粹的酸(240mg，82％)。通过加入水(50ml)，然后用1M NaOH水溶液把pH调节到7并进行冷冻干燥的办法，把酸转变为相应的钠盐。ESR(3.4mM的水溶液，200G)单峰，线宽120mG。核极化效应增强值(上述的水溶液)164(在5W的微波功率下)稳定性测量值在没有排除空气的水中的半衰期为120小时。实施例28三-(8-乙氧基羰基-2，2，6，6-四(羟乙基)甲基苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)-二硫杂环戊烯-4-基)-甲醇
把三-(8-乙氧基羰基-2，2，6，6-四羟甲基苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)-二硫杂环戊烯-4-基)甲醇(实施例13)(169mg，0.13mmol)与氢化钠(280mg，80％的矿物油溶液)和2-(2-溴代乙氧基)四氢吡喃(2.16g，10.3mmol)一起溶解于N，N-二甲基乙酰胺(18ml)中。反应混合物在55℃搅拌3.5小时，使其冷却，然后将其倒入磷酸钠缓冲水溶液(100ml，pH7)中。用二氯甲烷萃取后，把有机相干燥，蒸去溶剂，将残留物溶解于甲醇(30ml)和水(4ml)的混合物中，然后用2M的HCl水溶液把pH值调节到0.8，溶液再在室温下搅拌15分钟。溶液用NaHCO3水溶液中和，蒸去溶剂，产物用制备性的HPLC(RP-18，甲醇-水40-60)纯化。产率142mg(60％)。1H NMR(300MHz，CD3OD)δ4.42(6H，q，J＝7Hz)，3.48-4.16(84H，m)，1.43(9H，t，J＝7Hz)。MS(ESP，m/e)1822(73％)，1821(78％)，1820(96％)，1819(100％)。实施例29三-(8-羧基-2，2，6，6-四(羟乙基)甲基苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)-二硫杂环戊烯-4-基)-甲基钠盐
把三-(8-乙氧基羰基-2，2，6，6-四(羟乙基)甲基苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)-二硫杂环戊烯-4-基)甲醇(40mg，0.022mmol)溶解于乙酸酐(5ml)和吡啶(10ml)的混合物中，溶液在室温下搅拌2小时。蒸去有机溶剂，将残留物溶解于二氯甲烷并用水洗涤。蒸去溶剂后，将残留物溶解于二氯甲烷(8ml)，然后在0℃下加入三氟甲磺酸的二氯甲烷溶液(0.58mmol溶于4ml)。搅拌2分钟后，加入SnCl2的乙腈溶液(2mg溶于2ml)，再将溶液搅拌1分钟。把反应混合物倒入pH＝7的磷酸钠缓冲水溶液中，分离出有机相，水相用二氯甲烷(25ml)萃取。把合并的有机相干燥(Na2SO4)并蒸去溶剂。残留物用乙醇(10ml)溶解，加入1M氢氧化物水溶液(3ml)。在室温下搅拌1小时后，用1MHCl水溶液把pH调节到2，然后用制备性的HPLC纯化溶液(RP-18，CH3CN-HCl(pH2)20∶80)。将含有纯粹的产物的组分合并，蒸去乙腈，把残留的水溶液冷冻干燥，将残留物溶解于水，溶液用1M的NaOH水溶液中和，再将溶液冷冻干燥。产率24mg(62％)。ESR(1mM的水溶液，100G)单峰，线宽116mG。实施例30
下列实施例是用羟基三苯甲基自由基在Picker Nordstar MEGA4 250-300Hz仪器上进行的，通过把主磁场强度从0.1T减小到0.01T，并且配置一个VHF发射器发射频率为200-300MHz、功率为0-100W的VHF射线来使该仪器适用于OMRI。(a)大鼠心脏、大脑、肝脏和腺体组织的形态学矢量OMRI扫描血管造影对重125g的大鼠成像。把剂量为1.5mmol/kg的自由基以1.5ml的体积、10秒的注射时间(在成像前15分钟进行)注入尾静脉中。结果如图13所示。参数扫描时间 436分钟TR/TE270ms/20ms狭缝 4mm象素大小 0.5×0.5mm2平均值 4T-vhf200ms采样时间 24ms样品频率 21kHz样品基板 512×192(在阅读方向过量采样)记录仪基板 192×192后处理 再取样到348×348基板(b)心肌梗死对重110g的大鼠成像。把剂量为2.0m mol/kg的自由基以1.8ml的体积5秒注射时间(在成像前20分钟进行)注入尾静脉中。结果如图13所示。参数扫描时间 315分钟TR/TE190ms/20ms狭缝 4mm象素大小 0.5×0.5mm2平均值 4T-vhf125ms采样时间 24ms样品频率 21kHz
样品基板 512×256(在阅读方向过量采样)记录仪基板256×256后处理Y-校正注释 注射后8分钟杀死实施例31使用全氘代的羟基三苯甲基自由基的代表本发明“基本方法”的简式。自变宽和氧变宽由方程1给出，非均匀变宽为ΔHGpp＝60mG，驰豫为0.4mM-1s-1。
图象A，B和C
实施例32使用全氘代的羟基三苯甲基自由基的、代表本发明的优选方法的简式。自变宽和氧变宽由方程1给出，非均匀变宽为ΔHGpp＝60mG，驰豫为0.4mM-1s-1。
图象A，B，C，D和E
实施例332，2，6，6-四(二甲基三甲丙基硅氧基(2H2-甲基)-苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)-二硫杂环戊二烯
反应在氩气气氛下进行。
把2，2，6，6-四(羟基(2H2-甲基)-苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)-二硫杂环戊烯(29.1g，81mmol)溶解于DMF(176ml)中，加入咪唑(44.3g，650mmol)，将溶液冷却到0℃，滴加二甲基三甲丙基氯化硅(87.2g，96mmol)，溶液在室温下搅拌48小时。反应混合物用庚烷萃取(4×200ml)，然后蒸发合并的庚烷相。残留物通过用二氯甲烷-庚烷(1∶9)作洗脱剂的柱色谱纯化。
产率37.6g(55％)。
1HNMR(CDCl3，300MHz)δ6.84(s，2H，ArH)，1.62(七重峰，4H，J＝6.8Hz，CH)，0.88(d，24H，J＝6.8Hz，CH3)，0.84(s，24H，CH3)，0.08(s，24H，Si(CH3)2)。实施例34双-(2，2，6，6-四(二甲基三甲丙基硅氧基(2H2-甲基))-苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)-二硫杂环戊烯-4-基-单-2，2，6，6-四甲基苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)二氧杂环戊烯-4-基)甲醇
反应在氩气气氛下进行。
把2，2，6，6-四(二甲基三甲丙基硅氧基(2H2-甲基))-苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)-二硫杂环戊烯(80.9g，88mmol)溶解于干燥的DMF(300ml)中，将溶液冷却到-70℃，加入正丁基锂(70ml，2.5M的己烷溶液)，使温度恢复到室温，再搅拌1小时。在室温下真空蒸发除去溶剂，加入乙醚(200ml)，然后一次性加入4-乙氧基羰基-2，2，6，6-四甲基苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)-二氧杂环戊烯(11.7g，42mmol)，反应混合物在室温下搅拌16小时。将混合物倒入饱和的NaH2PO4溶液(200ml)和水(200ml)的混合物中。把两相分离，水相用乙醚萃取(2×200ml)，把有机相干燥(Na2SO4)并蒸发，残留物用制备性的HPLC纯化。产率51.5g(56％)。1H NMR(CDCl3，300MHz)δ6.80(s，2H，ArH)，6.33(s，1H，ArH)，4.95(s，1H，OH)，1.5(宽的多重峰，20H，CH3+CH)，0.9(d，48H，CH3)，0.7(s，48H，CH3)，0.2(2s，48H，Si(CH3)2)。实施例35双-(8-乙氧基羰基-2，2，6，6-四(羟基(2H2-甲基))-苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)-二硫杂环戊烯-4-基)-单-(8-乙氧基羰基-2，2，6，6-四甲基苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)二氧杂环戊烯-4-基)甲醇
在氩气气氛下，把双-(2，2，6，6-四(二甲基三甲丙基硅氧基(2H2-甲基))-苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)-二硫杂环戊烯-4-基)-单-(2，2，6，6-四甲基苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)-二氧杂环戊烯-4-基)甲醇(54g，26mmol)与TMEDA(54ml)一起溶解于庚烷(216ml)和干燥的苯(178ml)中，将溶液冷却到-22℃，加入叔丁基锂(54ml，2.5M的戊烷溶液)。在-22℃搅拌1小时后，把反应混合物转移到在-40℃恒温的焦碳酸二乙酯(216ml，1.47mol)的庚烷(640ml)溶液中，然后使反应混合物恢复到室温，再搅拌1小时，加入饱和的NaH2PO4溶液(40ml)。把混合物搅拌1小时，分离出有机相，用水(2×100ml)和乙腈(2×100ml)洗涤。蒸发庚烷/苯相，然后溶解于THF(380ml)中，加入Bu4NF的THF(300ml，300mmol)溶液，混合物搅拌过夜。蒸去溶剂后，残留物用制备性的HPLC纯化，得到11.4mg(39％)纯的产物。1H NMR(CDCl3，300MHz)δ5.77-5.92(m，6H)，5.11-5.51(m，8H)，2.98-3.24(m，12H)，2.90(t，6H，J＝7.0Hz)，2.84(t，3H，J＝6.9Hz)。实施例36双-(8-乙氧基羰基-2，2，6，6-四(羟基2H2-甲基))-苯并[1，2-d4，5-d’]双(1，3)-二硫杂环戊烯-4-基)-单-(8-乙氧基羰基-2，2，6，6-四甲基苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)二氧杂环戊烯-4-基)甲醇
在氩气气氛下，把双-(8-乙氧基羰基-2，2，6，6-四(羟基(2H2-甲基))-苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)-二硫杂环戊烯-4-基)-单-(8-乙氧基羰基-2，2，6，6-四甲基苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)二氧杂环戊烯4-基)甲醇(5.07g，4.30mmol)溶解于乙腈(650ml)中。将溶液冷却到0℃后，加入三氟甲磺酸(2.2ml)，搅拌3分钟后，加入溶解在乙腈(90ml)中的氯化锡(II)(447mg，2.36mmol)。1分钟后，加入饱和的NaH2PO4溶液(200ml)，水相用乙腈(2×50ml)洗涤。将合并的有机相干燥(Na2SO4)并蒸发，经制备性的HPLC纯化，得到2.66mg(53％)纯的产物。ESR(H2O，200G)单峰，线宽268mG。实施例37双-(8-羧基-2，2，6，6-四(羟基(2H2-甲基))-苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)-二硫杂环戊烯-4-基)-单-(8-羧基-2，2，6，6-四甲基苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)二氧杂环戊烯-4-基)甲基钠盐
把双-(8-乙氧基羰基-2，2，6，6-四(羟基(2H2甲基))-苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)-二硫杂环戊烯-4-基)-单-(8-乙氧基羰基-2，2，6，6-四甲基苯并[1，2-d4，5-d’]-双(1，3)二氧杂环戊烯-4-基)甲基(7.48g，6.4mmol)溶解于1MNaOH水溶液(80ml)和乙醇(80ml)的混合物中，溶液在室温下搅拌15分钟，蒸去乙醇，残留物在室温下再搅拌1小时。接近蒸干时，依次通过制备性的HPLC和冷冻干燥分离出纯粹的酸。通过加入水(50ml)，然后用1MNaOH水溶液把pH调节到7并进行冷冻干燥的办法，把酸转变为相应的钠盐。产率3.96g(55％)ESR(1mM的水溶液，200G)单峰，线宽60mG。
权利要求
1.一种测定样品中氧浓度的方法，该方法包括下列步骤把一种有效量的、生理上可接受的、esr过渡态的线幅小于400mG的自由基引入所说的样品中；用选定振幅和频率的射线辐照所说的样品以激发所说的自由基的电子自旋共振过渡态；至少在第一个、第二个和第三个条件下检测所说样品的电子自旋共振增强的磁共振信号，从而在所说的第一个和第二个条件下，所说的射线具有第一个频率，在所说的第三个条件下，所说的射线具有与第一个频率不同的第二个频率，在所说的第一个、第二个和第三个条件下，所说的射线具有第一个、第二个和第三个振幅，所说的第一个振幅和第二个振幅至少是彼此不相同的；和处理所检测到的信号，从而测出样品中的氧浓度。
2.权利要求1中所说的方法，其中处理所检测到的信号的步骤包括产生一组图象数据。
3.权利要求1或2中的任意一项所说的方法，包括(a)在VHF功率PA、辐照时间TVHF1和共振(ΔH＝0)条件下，产生所说样品的第一个OMRI图象，(b)在VHF功率PB、辐照时间TVHF1和共振(ΔH＝0)条件下，产生所说样品的第二个OMRI图象，(c)在VHF功率PC、辐照时间TVHF1和非共振(ΔH≠0)条件下，产生所说样品的第三个OMRI图象，(d)用体外测定的参数处理在步骤(a)-(c)中得到的图象并进行校正，得到所说样品的氧图象。
4.权利要求3中所说的方法，其中另外在VHF功率PA和辐照时间TVHF2时产生第四个图象，在没有VHF辐照时产生第五个MR图象。
5.前述的任意一项权利要求的方法，还包括一个产生样品的原始MR图象的步骤。
6.权利要求1中所说的方法，其中处理所说的检测信号的步骤包括把所测的esr过渡态的饱和度拟合到一个沃伊特函数。
7.前述的任意一项权利要求的方法，其中所说的生理上可接受的自由基是一种能扩散进入细胞外液的自由基。
8.前述的任意一项权利要求的方法，其中所说的生理上可接受的自由基，其esr过渡态的线幅小于150mG。
9.权利要求8中所说的方法，其中所说的自由基的esr过渡态的线幅小于60mG。
10.前述的任意一项权利要求的方法，其中所说的生理上可接受的自由基是三苯基甲基自由基。
11.权利要求10中所说的方法，其中所说的三苯基甲基自由基是下式的自由基及其盐、前体和氘代的类似物
其中n为0，1，2或3；R1为羧基或其衍生物；R2为氢或者是可以被羟基化或烷氧基化的C1-6烷基，其中的烷氧基本身可以被羟基化。
12.权利要求10中所说的方法，其中所说的三苯基甲基自由基是下式的自由基
或
全文摘要
一种用电子自旋共振增强的磁共振成像测定样品中氧浓度的方法。
文档编号G01R33/28GK1200179SQ9619775
公开日1998年11月25日 申请日期1996年9月6日 优先权日1995年9月8日
发明者简·H·阿登科贾尔-拉森, 伊布·莱恩巴赫 申请人:耐克麦德英梅金公司