专利名称：人乙型肝炎病毒dna的制作方法
技术领域：
本发明涉及人乙型肝炎病毒(HBV)的检测方法。具体地讲，本发明涉及检验HBV前核(Pre-C)区并同时确定其基因型的方法，以及涉及用于该方法的DNA试剂。
背景技术：
自1976年Greenberg和其同事首次报道了用干扰素(IFN)治疗慢性乙型肝炎(Greenberg，H.B.N.Engl.，J.Med.，295，517-522，1975)以来，已有许多报道是关于IFN对HBe抗原阳性的慢性乙型活动性肝炎的功效的，这些报道赢得了不同程度的认可。通常，慢性乙型肝炎的发作过程的特征是出现一个HBe抗原阳性期和HBe抗原阳性后期。在HBe抗原阳性期，HBV进行活性复制，血液HBV DNA和DNA聚合酶的活性水平增高，活动性肝炎的组织学症状明显，而且在多数情况下，可发现肝损伤；在HBe抗原阳性后期，HBe抗原消失而HBe抗体出现(血清转换发生)，结果是HBV的复制平息下来并伴随着肝损伤的缓解。因此，在HBe抗原、HBV DNA和DNA聚合酶均呈阳性的慢性活动性肝炎期间，给药INF以期望加强HBe抗原的清除和有利于HBe抗体的血清转换。
然而，还存在HBe抗原呈阴性或HBe抗体呈阳性的慢性乙型肝炎，该种肝炎显示出血液HBV DNA和DNA聚合酶水平高、病程发展快、较难诊断。在这种肝炎中检测到的HBV DNA显示出，在Pre-C(前核)区的83位有一从G到A的突变，所述的前核区与HBe抗原分泌到血液中有关，因此，认为此种HBV是不产生HBe抗原的病毒(CarmanW.J等，Lancet，ii，588-591，1989)。
在上述的Pre-C突变存在下，HBe抗体和抗原的检测值可能导致误诊，即导致误诊为血清转换正在发生并因此肝损伤将会适时得以缓解。所以，在IFN治疗慢性乙型肝炎的疗法中，人们认为检测并定量上述DNA区的突变将为制定将来的治疗方案或预测该治疗的预后结果提供有用的标记。
检测和测定HBV的Pre-C区突变的己知方法是通过采用一组引物的MSSA的竞争性反应分析法，所述的引物与Pre-C区的83位的突变具有同样的序列〔Kinoshita，M.等，CCA，228，83-90，1994〕。
然而，上述方法具有以下缺陷(1)因为该方法包括使用8个不同标准物(从101到108个拷贝)的竞争性反应，对每个样品必须进行8次分析，因此检测大量的样品需要浪费大量的时间。
(2)该方法仅限于Pre-C的83位的突变，不能对野生型病毒和其他突变同时进行测定。
另一方面，已知聚合酶链式反应-单链构型多态(PCR-SSCP)分析是检测突变的方法(如，Orita M.等，Genomics，5，874-879，1989〕。该方法利用了不同构型单链DNA电泳迁移率之间的差异。在该SSCP分析中，理想的是优选待测DNA具有均一的构型并因此产生一条带，但是已知待测DNA实际上可能以几种亚稳定态的结构存在并产生数条带；因此限制了该方法的利用〔Analytical Chemistry，43，731-743，1994〕。
至今还没有通过PRC-SSCP分析来定量分析或鉴定HBV Pre-C区突变的报道，因此同时检测和测定所述突变的方法也是未知的。
本发明的公开本发明的目的在于提供，通过一次反应即可分析HBV Pre-C区突变体和野生型病毒基因型以及同时测定该基因型的DNA试剂和方法。
为实现上述目的，本发明人进行了大量的通过PCR-SSCP分析来鉴定HBV Pre-C区突变体的研究，并发现了包括待测HBV Pre-C区突变体的所有突变位点的特定区域，对于每一突变DNA和野生型病毒DNA，该区域仅具有一种特定的构型，因此在每一SSCP分析中仅产生一条带，这些DNA在迁移率上的差异足以使DNA在SSCP分析中被区分开。本发明是在上述发现的基础上完成的。
本发明提供了包括HBV DNA 1701-1794区的DNA片段。
另一方面，本发明提供了HBV是野生型病毒或在Pre-C区有至少一个突变的突变病毒的DNA片段，所述的突变选自38位的G被A的取代、42位的T被C的取代、80位的T被C的取代、83位的G被A的取代、86位的G被A的取代。
本发明还提供了具有选自SEQ ID NO3、NO4、NO5、NO6、NO7和NO8的序列的DNA片段。
再一方面，本发明提供了用来选择性扩增HBV DNA的1701-1794区的PCR引物对，优选的是SEQ ID NO1和NO2引物对。
本发明还提供了HBV的检测方法，该方法包括采用所述的引物对和作为标准物的DNA片段。
认为包括38位的G被A的取代、42位的T被C的取代、80位的T被C的取代、86位的G被A的取代的上述Pre-C区的各突变体是本发明提供的新突变体。
在本说明书中采用的关于氨基酸、肽、核苷酸序列、核酸、限制酶等等的缩写是按照IUPUC和IUPUC-IUB推荐的命名法以及撰写包含核苷酸序列或氨基酸序列的说明书的指南(日本专利局协作部，审查标准处，1994年11月)来的。
而且，本说明书中采用的HBV的核苷酸序列编号与已知的核苷酸序列的编号(Gene，30，227-232，1984)一致。
本发明引物对的特征在于，它被用来选择性地扩增HBV DNA的1701-1794区。可按照任何常规的方法来设计该引物，只要所述的区域是可扩增的。
所设计的引物对的优选例子是在下文的实施例中描述的SEQ INNO1和NO2引物对。
本发明的SEQ IN NO1引物(寡聚-DNA)具有HBV DNA Pre-C区正链的核苷酸序列，该引物能使上述的特定区域扩增。
本发明的SEQ IN NO2引物(寡聚-DNA)具有HBV DNA Pre-C区负链的核苷酸序列。
可成功地将这两个引物用作本发明的引物对，而且可化学合成这两个引物对，例如通过亚磷酰胺法来合成之。用于本发明的化学合成方法以及各种方法如进行DNA裂解、缺失、增加或剪接的酶处理以及DNA分离、纯化、转录、筛选等方法均可按照常规方式进行(Bunshi-IdengakuJikkenho(Experimental Protocols in Molecular Genetics)，Kyoritsu Shuppan，1983；PCR Technology，Takara Shuzo，1990)。
例如，可通过琼脂糖凝胶电泳进行DNA的分离和纯化，DNA的测序可通过例如双脱氧法(Sanger，F.，Nicklen，S.和Coulson，A.R.，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，74，5463-5467，1977)或Maxam-Gilbert法(Maxam，A.M.和Gilbert，W.，Method in Enzymology，65，499-560，1980)进行。DNA的测序也可采用市售的测序试剂盒进行。这些基本的方法也被用在本说明书所提及的各研究报告中，并可参阅那些文献以及下文给出的实施例。
本发明所提供的由HBV DNA的1701-1794区组成的DNA片段是包括要由PCR-SSCP分析测定的HBV Pre-C突变体的所有突变位点的特定区域，对于每一突变的和野生型病毒DNA，该区域可能仅具有一种特定的构型，因此在每一SSCP分析中仅产生一条迁移带，这些DNA具有足以使DNA在SSCP分析中被区分开的迁移率的差异。
本发明的DNA片段是野生型HBV病毒上述区域的DNA片段或在Pre-C区有至少一个突变的突变型病毒的该区域的DNA片段，所述突变选自38位的G被A的取代、42位的T被C的取代、80位的T被C的取代、83位的G被A的取代、86位的G被A的取代。可提到的较为优选的DNA片段具有SEQ ID NO3、NO4、NO5、NO6、NO7和NO8所示的序列。
本发明的SEQ ID NO3所示的DNA片段的特征在于，在HBVPre-C区的序列中，83位的G已突变为A以及42位的T已突变为C。
本发明的SEQ ID NO4所示的DNA片段的特征在于，在Pre-C区的序列中86位的G已突变为A。
本发明的SEQ ID NO5所示的DNA片段的特征在于，在Pre-C区的序列中83位的G已突变为A。
本发明的SEQ ID NO6所示的DNA片段的特征在于，该片段具有野生型病毒的Pre-C区的序列。
本发明的SEQ ID NO7所示的DNA片段的特征在于，在Pre-C区的序列中，83位的G已突变为A以及80位的T已突变为C。
本发明的SEQ ID NO8所示的DNA片段的特征在于，在Pre-C区的序列中，83位的G已突变为A以及83位的C已突变为T。
所有这些DNA片段在通过PCR-SSCP分析进行的HBV试验中，均可用作分析Pre-C区基因型以及测定病毒具体基因型的标准物。
下面对试验步骤作一详尽描述。
采用PCR-SSCP分析的试验方法可按照常规方案或参照常规方案进行。例如，可参考下列文献以获得经PCR扩增DNA特定区域的有关资料〔Saiki，R.K.，Scharf，S.，Faloona，F.A.，Mullis，K.B.，Horn，G.T.，Erlich，H.A.和Arnheim，N.，Science，230，1350-1354，1985等〕。关于SSCP分析，可参阅下列文献〔Makino，R.等，Cold Spring Harbor Lab.，2，10-13，1992等〕。
对于通过PCR-SSCP的单链DNA分析，该技术是检测试验样品中HBV的方法，其特征在于以下步骤(1)采用本发明的引物对，通过PCR扩增试验样品中的HBV DNA的步骤。
(2)通过SSCP方法分析步骤(1)获得的扩增产物的步骤。
在该检测方法中，可将由已知的分级浓缩制备的本发明DNA片段用作标准物。将由SSCP分析测得的各标准物的迁移率和峰面积与作为步骤(1)的扩增产物的待测样品的迁移率和峰面积加以比较，即可同时完成HBV DNA Pre-C区的任何突变的检测(基因型分析)和具体病毒的测定。
对于待测的含HBV DNA的试验样品没有特别的限制，只要该样品含有DNA即可，因此所述样品包括血液、血清、汗液、尿、分离的组织和其它生物学材料。可通过常规方法从这些材料提取、纯化并制备HBV DNA。
根据本发明的方法，采用本发明的引物，通过PCR对待测样品中的HBV DNA的1701-1794位的特定区域进行特异性扩增。该扩增的区域包含HBV DNA Pre-C区的第38、42、80、83和86位的核苷酸并含有在这些位置的突变。不管在所述位置是否存在突变，对于每一DNA，该扩增产物(DNA片段)可能仅具有一种特异的构型，其结果是在随后的步骤(2)的SSCP分析中，各DNA分别产生迁移率有足够差异的条带，使各DNA可彼此区分开。
因此，通过将预定的所述标准DNA片段的电泳迁移率与由步骤(1)扩增而得的待测样品的迁移率进行比较，可方便地并以很高的敏感度检测HBV DNA Pre-C区内的突变(基因型分析)。
而且，当所用标准物的梯度浓度已知的时候，通过将标准物的峰面积和样品扩增产物的峰面积进行比较，就可同时测定待测样品的病毒滴度。
因此，本发明提供了同时检测HBV DNA Pre-C区突变(基因型分析)和测定突变体的便捷方法。
下面对本发明测试方法的实施方案进行详尽的描述。在本说明书公开的基础上，本领域的普通技术人员可对本方法中所用的引物对、标准物、PCR-SSCP分析、检测方法等自由地加以修改，当然这些修改和变化仍在本发明的范围之内。
按照本发明方法的实施方案，首先通过常规方法例如通过碱或酸处理，从乙型肝炎患者的血清中提取病毒DNA。然后，使引物对(即，SEQID NO2所示的引物和荧光标记的SEQ ID NO1所示的引物)和耐热的DNA聚合酶与如上所得的DNA溶液一起作用，被标记的DNA片段由此得以扩增。
另一方面，分别将SEQ ID NO3、NO4、NO5、NO6、NO7和NO8所示的DNA片段与质粒载体连接起来，并用以转染大肠杆菌来提供转化子。大量培养和纯化后，分别用纯化的重组质粒来制备例如103、104、105、106、107和108个拷贝的标准物。然后，使引物对(即，SEQ IN NO2所示的引物和荧光标记的SEQ ID NO1所示的引物)和耐热的DNA聚合酶与各自的标准物一起作用，DNA片段由此得以扩增。
将扩增后的DNA溶液在约95℃加热约5分钟，随后立即在冰中冷却，然后将其加入自动测序仪中进行SSCP分析，并由此检测荧光峰。该SSCP分析中的电泳优选在约30±1℃下进行。
因此，将患者血清DNA峰(迁移率)和标准物的峰(迁移率)进行比较。通过迁移时间鉴别与标准峰一致的峰，患者HBV的基因型即可确定。而且通过计算各标准物的峰面积并绘制标准曲线，可从计算出的患者DNA的峰面积定量(测定)出HBV DNA。
按照本发明，提供了引物对，该引物对的特征在于通过PCR可扩增HBV DNA的Pre-C区并且所得的扩增产物通过SSCP分析检测为单一的峰。本发明还提供了作为扩增产物的同一区域的DNA片段，所述的扩增产物可用作野生型病毒和HBV突变体的标准。通过利用所述的引物对和所述的标准，HBV DNA的Pre-C区的基因型分析和病毒DNA的测定可通过一轮PCR同时完成。
附图的简要描述
图1是显示按照实施例1，人乙型肝炎病毒DNA的Pre-C区的PCR-SSCP分析结果的图。
图2是显示按照实施例1，人乙型肝炎病毒DNA的Pre-C区的PCR-SSCP分析的标准曲线。
实施本发明的最佳方式通过以下实施例对本发明作更详尽的描述，但应理解的是这些实施例无论如何不构成对本发明的限制。实施例11-1.引物的制备用于本实施例的两个引物是HBV E-1和HBV E-2。HBV E-1是根据SEQ ID NO1化学合成的寡聚DNA，HBV E-2是根据SEQ ID NO2化学合成的寡聚DNA。
所述的两个引物都是用DNA合成仪(Pharmacia LKB GeneAssembler Plus)合成的。1-2.标准物的制备如下制备用作标准物的DNA片段。因此，用下文描述的方法通过对慢性乙型肝炎患者血清中的DNA进行测序来鉴定突变体，并通过PCR来分别扩增对应于SEQ ID NO3、NO4、NO5、NO6、NO7和NO8的DNA片段。
将上述的各DNA片段插入质粒载体(PT7 Blue T-Vector，TakaraShuzo)中，并用以转染大肠杆菌。从大量培养的转化细胞中纯化重组的质粒。采用重组的质粒，用含有200微克/毫升变性鲑精DNA的无菌水配制各标准溶液SEQ ID NO3片段的浓度为103拷贝/微升，SEQ IDNO4片段的浓度为104拷贝/微升，SEQ ID NO5片段的浓度为105拷贝/微升，SEQ ID NO6片段的浓度为106拷贝/微升，SEQ ID NO7片段的浓度为107拷贝/微升和SEQ ID NO8片段的浓度为108拷贝/微升。1-3.乙型肝炎病毒DNA的提取从患有慢性乙型肝炎患者的血液中分离血清，并将10微升的血清加入试管。向该试管中加入10微升0.2N NaOH，将该混合物剧烈搅拌达5分钟，然后使之在37℃静置20分钟以提取DNA。通过加入10微升0.2N HCl对该DNA溶液进行中和，以用于PCR。1-4.PCR分别将在1-2步骤制备的标准溶液各1微升和5微升在1-3步骤制备的患者血清DNA加入新鲜的试管中。向各试管中分别加入FITC-标记的(Pharmacia)HBV E-1溶液(FITC-标记的HBV E-1的无菌水溶液(10uM))HBV E-2溶液(10uM的HBV E-2无菌水溶液)，接下来加入30微升的PCR酶溶液。在用无菌水将总体积调整到50微升后，接着加入矿物油，在PCR仪(Stratagene)中进行扩增反应94℃1分钟，58℃1.5分钟和72℃1.5分钟，循环30轮。1-5.通过SSCP分析进行基因型分析和测定将从1-4步骤得到的PCR产物溶液1微升转移到新鲜的试管中，并加入10微升的终止变性溶液(80％的去离子甲酰胺、0.01％的蓝葡聚糖)。将该混合物在95℃加热3分钟，立即在冰中冷却，通过5％的甘油-7％的聚丙烯酰胺凝胶电泳，采用ALF自动测序仪(Pharmacia)进行SSCP分析。
结果如图1所示。在该图中，纵坐标代表荧光强度，横坐标代表迁移率。面的曲线(标准)显示的是分析标准混合物所得的结果。箭头所指的6个突变体产生的峰1、2、3、4、5和6分别对应于SEQ ID NO3、NO4、NO5、NO6、NO7和NO8的DNA片段。
从该图可以看出，各标准物的峰看，完全以单线态分离，并且各峰的面积与其浓度相对应。
另一方面，下面的曲线(患者)显示的是由患者血清衍生的PCR产物的结果。该患者给出了箭头所指的两个峰，峰1和2。该两个峰的迁移率与上述标准物的迁移率进行比较揭示出，患者峰1与标准峰3(SEQ IDNO5)相一致，表示其代表的基因型为Pre-C区的83位的G已突变为A。该患者的峰2与标准峰4(SEQ ID NO6)相一致，所以发现它是野生型病毒。
此外，从图1分别计算出了各标准峰的面积(Fragment Manager，Pharmacia)。结果各峰的面积如下峰1为37，峰2为46，峰3为60，峰4为212，峰5为375，蜂6为713。采用上述数据绘制的标准曲线示于图2(纵坐标峰的面积，横坐标峰的编号)。
类似地计算出患者峰1和2的峰面积(峰122，峰21372)，以上述的标准曲线来确定各群体的大小。结果，患者峰1的群体大小为3×106个拷贝，患者峰2的群体大小为1×1012个拷贝。
因此，在该试验中所用的患者血清含有3×106个拷贝的在HBVPre-C区的83位G突变为A的HBV和1×1012个拷贝野生型HBV。
工业实用性本发明提供了对人乙型肝炎病毒(HBV)的基因组进行基因型分析以及在一次试验中对各基因型进行测定的方法、用于该方法的有关的引物和标准DNA片段，采用所述的引物和标准DNA片段可准确地进行HBV的试验。
序列表SEQ ID NO1长度22个碱基对链型单链拓扑学线性分子类型合成的DNA来源人乙型肝炎病毒DNA位置1701....1722序列描述ACCTCTGCCT AATCATCTCA TG 22SEQ ID NO2长度20个碱基对链型单链拓扑学线性分子类型合成的DNA来源人乙型肝炎病毒DNA位置1775....1794序列描述TTATACGGGT CAATGTCCAT 20SEQ ID NO3长度94个碱基对链型双链拓扑学线性分子类型PCR产物来源人乙型肝炎病毒DNA特征名称/关键词突变位置1701....1794序列描述ACCTCTGCCT AATCATCTCA TGTTCATGCC CTACTGTTCA AGCCTCCAAG CTGTGCCTTG 60GGTGGCTTTA GGGCATGGAC ATTGACCCGT ATAA 94SEQ ID NO4长度94个碱基对链型双链拓扑学线性分子类型PCR产物来源人乙型肝炎病毒DNA特征名称/关键词突变位置1701....1794序列描述ACCTCTGCCT AATCATCTCA TGTTCATGTC CTACTGTTCA AGCCTCCAAG CTGTGCCTTG 60GGTGGCTTTG GGACATGGAC ATTGACCCGT ATAA 94SEQ ID NO5长度94个碱基对链型双链拓扑学线性分子类型PCR产物来源人乙型肝炎病毒DNA特征名称/关键词突变位置1701....1794序列描述ACCTCTGCCT AATCATCTCA TGTTCATGTC CTACTGTTCA AGCCTCCAAG CTGTGCCTTG 60GGTGGCTTTA GGGCATGGAC ATTGACCCGT ATAA 94SEQ ID NO6长度94个碱基对链型双链拓扑学线性分子类型PCR产物来源人乙型肝炎病毒DNA特征名称/关键词突变位置1701....1794序列描述ACCTCTGCCT AATCATCTCA TGTTCATGTC CTACTGTTCA AGCCTCCAAG CTGTGCCTTG 60GGTGGCTTTG GGGCATGGAC ATTGACCCGT ATAA 94SEQ ID NO7长度94个碱基对链型双链拓扑学线性分子类型PCR产物来源人乙型肝炎病毒DNA特征名称/关键词突变位置1701....1794序列描述ACCTCTGCCT AATCATCTCA TGTTCATGTC CTACTGTTCA AGCCTCCAAG CTGTGCCTTG 60GGTGGCCTTA GGGCATGGAC ATTGACCCGT ATAA 94SEQ ID NO8长度94个碱基对链型双链拓扑学线性分子类型PCR产物来源人乙型肝炎病毒DNA特征名称/关键词突变位置1701....1794序列描述ACCTCTGCCT AATCATCTCA TGTTTATGTC CTACTGTTCA AGCCTCCAAG CTGTGCCTTG 60GGTGGCCTTA GGGCATGGAC ATTGACCCGT ATAA 9权利要求
1.PCR引物对，包含用来选择性地扩增人乙型肝炎病毒DNA的1701-1794区的DNA。
2.根据权利要求1的引物对，该引物对如SEQ ID NO1和NO2所示。
3.含有人乙型肝炎病毒DNA的1701-1794区的DNA片段。
4.根据权利要求3的DNA片段，其中人乙型肝炎病毒是野生型病毒或在前核区具有至少一个突变的突变病毒，所述突变选自38位的G被A取代、42位的T被C取代、80位的T被C取代、83位的G被A取代、86位的G被A取代。
5.根据权利要求3的DNA片段，该片段具有选自SEQ ID NO3、NO4、NO5、NO6、NO7和NO8所示的序列。
全文摘要
本发明提供了用来选择性扩增人乙型肝炎病毒(HBV)DNA的1701—1794区的PCR引物对,例如SEQ ID NO:1和NO:2所示的引物对,以及含有HBVDNA1701—1794区的DNA片段(标准),例如SEQ ID NO:3至NO:8所示的DNA片段。采用这些引物对和DNA片段,通过单一的反应可进行HBV Pre－C区突变体的基因型分析和基因型的测定。
文档编号G01N33/569GK1201490SQ96198072
公开日1998年12月9日 申请日期1996年10月24日 优先权日1995年11月2日
发明者木下盛敏, 葛城肃典 申请人:大制药株式会社