专利名称：作为凝集试剂的合成粒子的制作方法
技术领域：
本发明涉及通过凝集作用检测样本液体中分析物的方法，其中将样本液体与凝集试剂和惰性基质接触，反应混合物受引力作用，测定分析物与凝集试剂之间的反应。此外，公开了实施本发明的方法的新试剂。
通过血凝反应检测分析物的方法和粒子凝集试验是已知的。首先用这些试验检测抗原和抗体以诊断传染病。然而，这些方法的共同缺点是费时、费力，而且结果通常是很难解释。
凝胶免疫分析法(其中通过惰性基质中的离心步骤将凝集的血细胞与单独的未凝集红细胞分离(例如参照EP-A-0 194 212，EP-A-0 305 337，EP-A-0 557 546，EP-A-0 634 216，EP-A-0 485 228和WO95/31731))是已知的血凝反应试验，其中未固定的红细胞被用作凝集试剂。在这些方法中，已凝集的红细胞保留于惰性基质上或惰性基质中，于是可明显地与未反应的单个红细胞分离，后者可穿透基质而沉入反应容器底部。
只是在EP-A-0 305 337(该申请享受1987年在先申请的优先权)中阐述过合成粒子如胶乳或聚合的琼脂糖也可用作凝集试剂。然而，它未报导这些合成粒子的性能。此外，该文献在后来的专利或其它出版物中未被引用。反之，最近的出版物如EP-A-0 557 546强调用未固定的红细胞作凝集试剂。
但是，未固定红细胞的缺点是它们在某些反应条件下的不稳定性，导致溶血作用。该不稳定性通常导致基于未固定红细胞的产物过短终止期。此外，只能以相当费劳力的方式实现标准化和重复性生产红细胞制剂、尤其是抗体偶联或抗原偶联的红细胞制剂。其实这就会使红细胞制剂的物理性质不能保持一致。
因此，本发明的目的是至少部分地消除用红细胞作凝集试剂引起的前述缺点。确切地说，本发明旨在提供可用作凝集试剂的合成粒子，且这种合成粒子能模拟红细胞在已知的凝胶免疫分析中的行为。此外，该合成粒子应允许单纯偶联生物物质，并且应设计成在敏感性和特异性方面至少相当于以前用的红细胞凝集试剂。将这些合成粒子用于凝集试验时，应可能比先前的已知方法更易于操作和评价。
通过由凝集作用检测样本液体中分析物的方法来实现上述目的，其中将样本液体与凝集试剂和惰性基质接触，反应混合物受引力作用，测定分析物与凝集试剂之间的反应，其特征在于，选择用作凝集试剂的合成粒子的直径和密度使其对基质的行为基本上与红细胞的一样。
意外地发现，如果密度和直径控制得当，则实际上可使生产的合成粒子易于穿透凝胶免疫分析中的惰性基质，于是可完全模拟新鲜的红细胞。
在导致本发明的实验中，发现与红细胞(直径6-8μm)相比，刚性聚合物粒子的迁移大为延迟。在给定的标准条件下它尤其意味着直径为3-7.5μm的可商购标准粒子在凝胶基质中只是不完全地沉降，而更大(11.9μm)或更小(＜1μm)的合成粒子只稍能透入凝胶。尽管提高参数即延长离心时间(从10min增至50min)和加大离心速度(从1030至1300rpm)可改善沉降，但仍不完全。即使这两项措施可达到最佳沉降，但基于下述原因改变/增大离心时间和速度相当不利1.相对于类似的方法而言，本发明的系统尤其应是不费时的方法。所以可能的50min离心时间将会是包括保温的20min预定时间的3倍。
2.本领域中的技术人员熟知，提高离心速度会降低凝胶离心法的灵敏度。3.如果可遵循特定的参数，则本发明的系统可应用商品化离心机。
意外地发现，直径小于红细胞且密度高于通常值的合成粒子通过惰性基质时的行为与红细胞的相当。在这一点上，有可能应用球形和不对称的合成粒子。
业已证实平均直径≤5μm且尤其是1～5μm的合成粒子优选适于本发明的方法，而平均直径为2～4μm是特别优选的。粒子的相对密度优选≥1.1g/cm3且最好是在1.1～1.8g/cm3范围内。特别地，如果是在标准条件如对于已知的商用红细胞凝胶免疫分析规定的(例如DiaMed)条件下实施检测方法，则相对密度优选在1.1～1.6g/cm3范围内且最优选在1.15～1.4g/cm3范围内。
用作本发明方法中的凝集试剂的合成粒子优选是有机聚合物或共聚物粒子。特别优选的材料是苯乙烯和苯乙烯衍生物如溴苯乙烯、尤其是其共聚物。制备大小范围一致的、适用作本发明的凝集试剂的聚合物粒子，可采用本领域中的技术人员相当熟悉的方法(Arshady(1992)Suspension，emulsion and dispersion polymerizationA methodologicalSurvey.Colloid & Polymer Science 270，717-732；Okubo and Shiozaki(1992)Production of micron-size monodisperse polymer particles byseeded polymerization utilizing dynamic swelling method with coolingprocess.Polymer International 30，469-474)。这些方法通常是将乳液聚合和分散聚合相结合以生产具有严格规定的物理性能的粒子。
至于目视检测本发明方法中的凝集反应，可于粒子中掺入染料尤其是水不溶性染料。于是，染成蓝色、黄色、绿色、黑色或红色的合成粒子已证实特别适合于目视估测。在本发明的一个特别优选的实施方案中，由于其特别好的可检测性而应用红色粒子。
合成粒子的强度使之能通过已知的标准工业方法将大量不同的配体固定于其表面。在该技术中最好是固定可与待测分析物结合的配体分子。配体分子可通过吸附性、共价键或高亲和力相互作用来固定。共价偶联例如可通过表面露出的化学活性基团而实现，这类基团的实例有羧基、氨基、醛基和环氧基。借助高亲和作用的固定化可由高亲和力结合对的两个配对物如抗生蛋白链菌素或阿维丁/生物素、半抗原/抗体、糖类/凝集素等介导。这些共价作用和高亲和作用使之能固定配体分子如肽类例如合成制备的肽，蛋白质例如糖蛋白、脂蛋白、重组多肽，免疫球蛋白，核酸例如DNA或RNA、核酸类似物，糖类例如单糖、二糖、寡糖和多糖，脂质，激素，代谢物或其它生物物质。在这方面，可直接完成固定化，或者利用联接基以可控方式实现结合配体分子的优选最适取向。
不过，也可以通过纯粹的吸附方法固定配体分子，这对于例如下列物质而言是可能的细胞膜如红细胞、血小板或白细胞的膜，细胞膜碎片，或者细胞或病原体如病毒、细菌或寄生虫的裂解物。如果应用染色的合成粒子，就没必要另外将膜染色。
本发明的方法涉及检测样本液体中的分析物。体液优选用作样本液体，它可任意稀释，例如血液、血清、血浆、唾液或尿。用于本发明方法的样本液体体积可变范围宽，1～200μl的体积优选用于微量试验。
所述合成粒子被用作本发明方法中的凝集试剂，这些粒子的表面优选含有能与分析物以高亲和力结合的特定配体分子。该凝集试剂通常含数个结合分析物的位点，使之形成包括分析物与凝集试剂的交联凝集复合体。
可用本发明方法检测的分析物是能与凝集试剂进行专一作用和具有高亲和性的物质例如可由免疫反应测定的抗原和抗体，也可以是可由杂交反应测定的核酸。本发明第一个优选的实施方案涉及检测用作样本液体中分析物的抗体，例如抗病原体如病毒(HIV、肝炎病毒)、细菌或原生动物的抗体，抗自身抗原的抗体，抗肿瘤的抗体或抗变应原的抗体。
此外，本发明的方法还可进行类别特异性的抗体检测例如区分IgG和IgM抗体，它们通常对于例如传染病和自身免疫病的诊断相当重要。
另一方面，也可用本发明的方法测定抗原例如游离抗原如血清蛋白、代谢物、激素、介体等等，或是载体结合的抗原如细胞血型抗原。
在本发明的方法中应用含基质的反应容器，所以在引力作用后可以定量或半定量地测定待测分析物与凝集试剂之间的凝集反应。尽管也可通过相当久的沉降作用实现引力作用，但优选应用离心法，因为短时间后即可达到所要求的沉降。本领域中的技术人员很容易决定任何分析系统的离心时间和g值最佳条件。这些条件具体由以下因素决定凝集试剂和分析物构成的凝集复合体性质，处于未结合态的反应混合物成分和各场合中所用的基质。惰性粒状基质优选用于本发明的方法中；另一方面，例如也可以用描述于EP96 10 428.3中的密实基质。
基质优选是惰性粒状基质。这里的“惰性”是强调基质不应与分析物或凝集试剂发生非特异性反应。用于液相色谱的可商购粒子(例如得自Merck、Pharmacia、Bio-Rad、Tosohaas)优选用作基质，具体实例有Sephadex、Sepharose、Sephacryl、Bio-Gel或Toyopearl。这些产品基于交联聚合物或共聚物如琼脂糖、聚丙烯酰胺、聚葡聚糖、苯乙烯/二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸酯。也可考虑用玻璃珠。基质粒子的粒度优选为10μm～200μm。也可考虑应用已偶联检测试剂如抗体的基质；例如可得自Pierce或Pharmacia公司的基质。本领域中的技术人员可通过简单的初步实验来决定粒子是否可用于具体的检测方法。
依本发明的方法，当引力作用于反应混合物之后产生的结果解释如下a)如果凝集作用强，则由待测分析物与凝集试剂构成的反应产物不能渗入基质或只是稍微渗入基质，b)如果凝集作用弱，则反应产物能渗入基质但不能全部渗入以及c)如果没有凝集作用，则反应器中的粒子可基本上全部渗入基质。
在本发明方法的优选的实施方案中，两种或多种不同类的合成粒子被用作凝集试剂。换言之，存在多种相互关联的疾病(其中首先要用惯常的测试方法进行所谓的筛选以确定被查的人是否具有对这类疾病的抗体)。如果被查的人的测试体液在筛选试验中呈阳性，那么依惯常方法它就应接受第二步所谓的鉴别试验(其中确定抗体针对这类疾病中的哪一种)。这种方法的类型的一实例是HIV诊断。在筛选中测定是否存在HIV特异性抗体，在鉴别试验中测定这些抗体针对HIV-I、HIV-II还是HIV-I和HIV-II。
在本发明的方法中，现在可能应用两种不同的合成粒子，它们优选具有相同的大小、类型、密度和柔性，但具有不同的颜色例如红色和蓝色，且连接不同的表面配体。由于各组分比例相同的不同种合成粒子可形成均匀的悬浮液，所以该悬浮液可以相同方式用于一单独试验。结果可解释如下如果在样本液体中存在两种待测分析物，则离心后的基质上或上层将出现红带和蓝带；如果只有一种分析物，则在基质的上层中只能检测到一种适当色带，而其它颜色的合成粒子透过基质并处于它下方；如果样本液体中第一种和第二种分析物都不存在，则在基质下方形成两种合成粒子的一层。相应地，当然也可能应用三种或多种不同的合成粒子，它们的颜色各不相同以便在相应的参数值间同时鉴别。
适用于凝胶凝集试验的任何反应容器都可用来实施本方法。反应容器的容积优选是50μl～2ml，反应容器优选装有漏斗以接受试剂。在一个优选的实施方案中应用数个反应容器，它们一起排列在一个插板或盘上。装在插板或盘上的反应容器可设计成检测相同的分析物或检测不同的分析物。
例如由DiaMed Company出售、用于血型分析的板(其上排列6个微量反应容器)可用于实施本发明的方法。也可应用the Ortho和Diagast Companies的产品。
引力对反应混合物的作用优选在合适的离心机中通过离心反应容器来进行。于是，在本发明的一个优选实施方案中，利用预先设定参数的(t＝10min，v＝85g)可商购DiaMed ID离心机12S II。
然而，在本发明的另一个优选实施方案中，还可应用改进的离心方法，它主要是考虑基本反应的动力学，具体体现在加强弱反应。
此外，本发明方法的某些实施方案中，优选应用含第二种抗体的基质，例如所谓的族特异性抗体如抗IgG抗体。此时，在反应容器中发生两相反应，如果反应室内进行的第一个反应是阳性反应，则合成粒子上的配体分子如抗原与样本中的分析物例如抗原特异性抗体反应。此时，可能已发生不同的合成粒子间的交联(凝集)，然而，它在IgG反应的情况下通常只导致相当弱的凝集。基质中存在的第二种抗体保证由已形成的凝集复合体间的另外交联产生预期的特异性反应增强效果。
总共试验时间只有20min，本发明的所述试验系统与已知系统相比大为节省了时间。与基于固定的或未固定的红细胞作凝集试剂的试验系统相比，另一个优点是合成粒子的贮存期限更长，并且起始原料的均一性更好。
如果试验系统配备得当，则操作简单，又能明确地得出结果，所以也可用医疗辅助导引探子进行试验。该操作很简单，因为它只包括两个移液步骤。此外，应用由电池提供动力的离心机和涡动仪(vortexinstrument)，可易于在常设的实验设备之外进行测定而不用连接电力。少量样本、不需洗涤步骤和用后可以密封反应器，保证操作人员最短暂地接触潜在的传染性物质和最大可能控制潜在的传染性废物。
本发明还涉及这类合成粒子平均直径≤5μm，优选为1-5μm，特别优选为2-4μm而且相对密度≥1.1g/cm3，优选为1.1-1.8g/cm3，特别优选为1.15-1.4g/cm3；在其表面通过例如共价作用、吸附作用或高亲和作用固定化配体分子。粒子优选被染色，这些粒子可在凝集试验、优选是在凝胶凝集试验中用作凝集试剂。
本发明进一步的主题是用于检测样本液体中分析物的试剂盒，它包括a)至少一个盛有惰性基质和优选是粒状基质的反应容器和b)至少一种合成粒子，在其表面有固定化配体分子。
在本发明的几种测定方法中，优选往反应混合物中加入洗涤剂。合适的洗涤剂实例有离子型洗涤剂如SDS，或非离子型洗涤剂如Triton X-100和Tween 20。此外，还优选加入粘蛋白。洗涤剂或/和粘蛋白的加入可改善悬浮液中或凝胶迁移时粒子的均匀性。如果是阴性反应时，这会导致更完全的沉降。
还可以加入还原剂而方便地进行反应，可加入的还原剂例如巯基试剂如2-巯基乙醇、二硫苏糖醇或连二亚硫酸钠或另一种还原剂如三丁基膦。还原剂可减少非特异性反应诸如那些由例如IgM抗体引起的反应。
此外，在某些试验中，可通过改变离心条件改善试验结果。这特别适合于其中应用涂有受体如第二种抗体的基质的试验。
优选的离心条件改进方法包括间歇式离心，即第一步离心后暂停，再进行第二步离心。离心操作可任意以数步间歇方式进行，第一步离心优选只是短暂的离心步骤，持续达1min，优选达30sec。然后暂停例如1-10min或大约5min。接着进行第二步更久的离心，而且也可任意在更高的g值下进行。
通过如下实施例和附图更详细地阐述本发明的某些方面。
图1示出本发明的方法中在阳性、弱阳性和阴性反应情况下出现的结果，1-3表明强度递降的阳性反应，4表示阴性反应。图2示出试验过程的示意图。图3示出微量反应容器中发生的反应(其中基质含抗IgG抗体)
a)在反应室中b)在基质的缓冲剂上清液中或在基质中，反应1得自病人血清的特异性抗体与合成粒子上的检测-特异性抗原的结合。反应2由抗人球蛋白凝集提高IgG作用。＝病人血清中的检测-特异性IgG抗体；▲＝检测-特异性抗原，共价偶联到合成粒子上；●＝合成聚合物粒子；Y＝抗人球蛋白(抗IgG)。图4示出在反应容器中鉴别诊断两种不同分析物A1(红色粒子)和A2(蓝色粒子)的示意结果a)病人样本1，对A1呈抗体阳性即A1-pos./A2-neg；b)病人样本2，对A2呈抗体阳性即A2-pos./A1-neg；c)样本3(得自病人1和2的血清混合物)，对A1和A2呈抗体阳性即A1-pos./A2-pos；d)病人样本4，对A1和A2呈抗体阴性即A1-neg./A2-neg。图5示出关于表1中反应区的示意图。区0表示合乎阴性反应那样离心后粒子形成沉积物，区5表示未渗入凝胶基质。
实施例1.用现有技术中未在凝胶试验中起作用的合成粒子进行的实验(对照)试验步骤用10mM pH7.4的PBS溶液(Sigma P 4417)、0.1％Tween-20(Sigma P7949)(v/v)洗涤通常浓度为10％固体粒子(w/v)可商购的有色合成粒子悬浮液，并在同一溶液中调节浓度至0.15％固体粒子。
每一情况下移取25μl该悬浮液置于微量反应管中，再在表1中所述条件下沉降。
结果批号 颜色 直径在凝胶中的沉降行为10min，85g 20min，85g 40min，95g 50min，130gPolymer Laboratories，Churehstretton，UK未官能化胶乳SP-1130蓝色0.10μm区4-5区4-5区3-4区3-4SP-1025红色0.45μm区4-5区4-5区3-4区3-4SP-980 红色0.61μm区4-5区4-5区3-4区3SP-974 红色0.87μm区4-5区4-5区3 区2-3Polymer Laboratories，Churchstretton，UK未官能化微球SP-1016蓝色3.00μm区3-4区2-3区0-1区0-1SP-1269蓝色4.76μm区3-4区1-2区0-1区1SP-1024红色11.9μm区4-5区4 区4 区4批号 颜色 直径 在凝胶中的沉降行为10min，85g 20min，85g 40min，85g 50min，130g分子探针Carboxylate FluoSpheresL-5191 黄-绿色0.01μm 区5L-5201 黄-绿色0.03μm 区5L-5221 黄-绿色0.10μm 区4-5L-5261 黄-绿色0.50μm 区4-5L-5281 黄-绿色1.00μm 区4-5L-5301 黄-绿色2.00μm 区3-4Sulphate fluospheresL-5121 黄-绿色4.00μm 区1-2Rhone Poulenc，Lyon，FranceEstaporK58 绿色 0.223μm 区4-5K80 红色 0.299μm 区4-5Estapor，磁性粒子M180/121.00μm 区2-4表1各种可商购合成粒子的性能和它们在DiaMed ID系统中的沉降性能；依图5的区定义。2.制备合适的合成粒子用分散聚合法制备用于下述实施例中的合成粒子，因为该方法一般最适于制备大小范围是1～5μm的粒子。第一步是合成由聚苯乙烯制成的基本粒子(2a)；接着用苯乙烯/溴苯乙烯共聚使这些基本粒子溶胀成高密度粒子(2b)；在后续的第三步中将其干燥(2c)。2a.基本粒子的聚合步骤将60g 1-十六烷醇(Aldrich 25，874-1)、216g聚乙烯吡咯烷酮40,000(PVP)(Aldrich 85，656-8)、1744g蒸过的苯乙烯(AldrichS497-2)和10261g工业级甲基化酒精(Banners IMS 99)称入20升圆底烧瓶反应器(装有搅拌器、水冷凝器和氮气充气管)。调节搅拌速度至35-40rpm，在室温下对混合物充气16小时。接着升温至70℃，再于反应混合物中加入17.4g偶氮二异丁腈(Fisons A/9050/50)，形成白色乳液。进一步反应24小时后，将反应混合物冷却至室温。通过多次在甲醇中离心(3000rpm，5min)而洗涤所得粒子，最后一次洗涤后，将粒于再悬浮于0.1％(w/v)SDS(Fisons S/5200/53)溶液。该制备过程得1573g直径为2.3μm单分散聚苯乙烯粒子。2b.制备高密度粒子步骤将118.3g 10％(w/v) 2.3μm粒子(依实施例2a制备)的悬浮液和250g聚乙烯醇(Harco 26-88)(PVA)(5％W/V)溶液称入1升圆底烧瓶反应器(装有搅拌器、水冷凝器和氮气充气管)，调节搅拌器速度至250rpm。取1.5g过氧化苯甲酰(Aldrich 22，887-7)溶于21.6g4-溴苯乙烯(Avocado 17896)，使该溶液于250ml 0.5％(W/V)SDS溶液中乳化。再将溴苯乙烯乳液加入圆底烧瓶反应器，3小时后往反应器中加入125g 1％(W/V)重铬酸钠(Fisons S/3560/60)溶液，并升温至70℃。再过16小时后升温至80℃，又反应3小时。随后让反应混合物冷却至室温。通过在水中反复离心洗涤所得粒子，得现有直径为3.1μm的26.98g粒子。聚合的溴苯乙烯在这些粒子中的面值含量为65％(W/V)。这些粒子在水中的1％(W/V)悬浮液的沉降速率为5.7mm/hr，理论密度为1.28g/cm3(见表2)。
根据该方法聚合相同直径、不同溴苯乙烯/苯乙烯比、因而密度值不同的各种粒子(表2)。苯乙烯 溴苯乙烯 粒子直径密度[g/cm3] 在凝胶中的沉降行为5min，85g 10min，85g 20min，85g100％0％ 3.1μm 1.05 区4区3-4 区2-364％36％ 3.1μm 1.18 区0-1 区0 区035％65％ 3.1μm 1.28 区0区0 区023％77％ 3.1μm 1.32 区0区0 区0表2用标准离心条件在DiaMed ID系统中改变密度的合成粒子的沉降行为；区定义依图5。2c.制备有色高密度粒子步骤苏丹IV(红色)将200g直径为3.1μm合成高密度粒子(依2a、2b中所述方法制备)的10％(W/V)悬浮液、11.6g 5％(W/V)聚乙烯醇(Harco 26-88)溶液、40g甲醇(Hammond)和240g水称入1升圆底烧瓶反应器(装有PTFE搅拌器、水冷凝器)。取0.4g染料苏丹IV(Kodak 112 6150)溶于30g二氯甲烷(Fisons D/1852/25)，将该溶液于250ml 0.5％(W/V)SDS溶液中乳化。在室温下将此二氯甲烷乳液加入反应器，4小时后所得红色粒子乳液被加入2升烧杯。搅拌下往此悬浮液的表面充氮气以便尽可能快地使二氯甲烷挥发，温和地加热该悬浮液以达到充分挥发。在水中反复离心(1000rpm，5min)而洗涤所得红色粒子，产率为19.8g。Ferro FW 1263(蓝色)将50g直径为3.1μm合成高密度粒子(依2a、2b中所述制备)的10％(W/V)悬浮液、2.9g 5％(W/V)聚乙烯醇(Harco 26-88)溶液和60g水称入1升圆底烧瓶反应器(装有PTFE搅拌器、水冷凝器)。取0.184g染料Ferro FW1263(Ferro Normandy Plastics Ltd，Westgate，Aldridge，GB)溶于7.5g二氯甲烷(Fisons D/1852/25)，在62.5ml 0.5％(W/V)SDS溶液中乳化此溶液。然后在室温下将该二氯甲烷乳液加入反应器，2小时后所得蓝色粒子乳液被加入500ml烧杯。搅拌下往此悬浮液的表面充氮气以便尽可能快地使二氯甲烷挥发，温和地加热该悬浮液以达到充分挥发。在水中反复离心(1000rpm，5min)而洗涤所得蓝色粒子，产率为4.8g。3.粒子表面的官能化和用抗生蛋白链菌素处理a)醛粒子的制备于15ml离心管中加入1ml等分试样的红色3.1μm高密度粒子(17.1％)(W/V)(依实施例2a～2c中所述方法制备)，并用超纯(18兆欧)水通过离心(1000rpm，5min)洗涤3次。将15ml牛血清白蛋白(2.67mg/ml)(Sigma A9647)于10mM pH7.4 PBS中的0.05％NaN3溶液加入以这种方法洗后的粒子，再在室温下搅拌4小时。用15ml水通过离心(1000rpm，5min)将粒子洗涤4次，接着将粒子再悬浮于10ml水而得1.7％(W/V)的浓度。往0.5ml该悬浮液等分试样中加入3.75ml水后得0.2％(W/V)悬浮液。再加入4.25ml 2％戊二醛水溶液于该溶液中，室温下搅拌此反应混合物达1小时。用15ml水通过离心(1000rpm，5min)洗涤该粒子4次。b)制备抗生蛋白链菌素粒子将8mg红色3.1μm高密度粒子(依2a-c中所述方法制备并按3a中所述那样官能化)的悬浮液再悬浮于4ml水，并在超声水浴(Sonomaticfrom Langford Ultrasonics，Birmingham，GB)中保温1min。随后加入4ml pH3.25的50mM乙酸钠缓冲剂，再加入1ml抗生蛋白链菌素的水溶液(4mg/ml)。又一次在超声水浴中保温2分钟后，立即加入50mM氰基氢硼化钠(Aldrich15，615-9)于乙酸盐缓冲剂中的1ml溶液。在温和摇动下，将此混合物于室温时保温一夜。用15ml水通过离心(1000rpm，5min)洗涤该粒子3次后再悬浮于5.33ml pH7.4的10mMPBS中，以调节粒子浓度至0.15％(W/V)。c)制备聚赖氨酸粒子将4ml pH3.25的50mM乙酸钠加入500mg红色3.1μm高密度粒子于1ml水中的悬浮液(依2a-c中所述方法制备并按3a中所述那样官能化)。然后加入4ml 1mg/ml聚L-赖氨酸(Sigma P2636)水溶液。将该反应混合物在超声水浴中保温4min，再加入1ml 50mM氰基氢硼化钠于乙酸盐缓冲剂中的溶液，然后在温和摇动下将该反应混合物于室温下保温一夜。用水通过离心(1000rpm，5min)洗涤该粒子3次后再悬浮于333ml pH7.4的10mM PBS，以调节粒子于悬浮液中的浓度至0.15％(W/V)。4.将配体与官能化粒子偶联a)高亲和力结合在盛有1ml 0.15％(W/V)红色3.1μm高密度粒子(依2a-c制备，并按实施例3a、3b中所述那样进行官能化和用抗生蛋白链菌素处理)悬浮液的Eppendorf微量管中加入0.1ml生物素化的抗原溶液，再在摇动下保温30min。离心两次(1000rpm，5min)然后悬浮于1ml前述缓冲剂洗去未结合抗原，使得粒子悬浮液的最终浓度又是0.15％(W/V)。b)非共价偶联将10μl20μg/ml ds DNA(Sigma D 1501)于10mM pH7.4 PBS中的溶液加入500μl 0.15％红色3.1μm高密度聚赖氨酸粒子(依2a-c和3a、3c中所述方法制备)的悬浮液。在档位(level)8处经受涡动步骤(Bender & Hobein，Virtex Genie 2)5秒后，在温和摇动下，于室温下保温12小时。通过离心(1000rpm，5min)用1ml pH7.4的10mMPBS洗涤悬浮液2次，又一次再悬浮于500μl pH7.4的10mM PBS。5.凝胶基质的缓冲剂组合物微量反应容器中的凝胶基质在下列含水缓冲剂介质中5mMKH2PO4(Merck 4873)/Na2HPO4(Merck 6580)，150mM NaCl(Fluka71381)，0.024％(W/V)NaN3(Fluka 71290)，1.875％(V/V)白蛋白(Miles81-177)，0.05％(W/V)EDTA(Fluka 03685)，1.3mM Tris(Merck，8382)，1.25mM N-乙酰-L-半胱氨酸(Merck 12422)，0.025％(W/V)粘蛋白(Sigma M 1778)。视试验而定，该凝胶基质另外任意含不同量的抗人球蛋白。6.Chagas抗体试验(合成肽的高亲和力结合)a)抗原合成肽Ag-2、TcD和TcE均得自Alta Bioscience(Birmingham，UK)。b)偶联分别将1ml 0.15％(W/V)红色3.1μm高密度粒子(依2a-c中所述方法制备，并按实施例3a、3b中所述那样进行官能化和用抗生蛋白链菌素处理)悬浮液的等分试样与2ng TcD、35ng Ag-2和282ng TcE偶联，它们是由标准方法合成的，除了抗原序列外还含生物素化的赖氨酸，而且还用标准方法在RP-HPLC上纯化至纯度＞90％。为此，配成10X各种肽于水中的贮备溶液(20ng TcD、350ng Ag-2、2820ngTcE/ml)。为了偶联，再各将1vol.肽溶液加入10vol. 0.15％(W/V)合成粒子的悬浮液并快速混合。然后在温和摇动下，于室温时将反应混合物保温30min，接着在1000rpm下离心该粒子悬浮液达5min。滗去上清液，用10mM pH7.4的PBS洗涤两次。粒子在悬浮液中的最终浓度又是0.15％(W/V)，将以这种方式敏化的粒子于4℃下贮存。c)试验方法依4a中所述方法敏化的合成粒子的0.15％(W/V)悬浮液在超声水浴中被处理5min，然后各取25μl加入插板上的6个微量管(见实施例5ID card，DiaMed，Cressier sur Morat)，管内预先注入含抗人球蛋白(0.5％，V/V)的凝胶悬浮液。接着加入1.5μl病人血清或血浆。在室温下保温10min后，将它们置于离心机中在85g下离心10min，该离心机是微量管专用离心机(ID centrifuge 12 SII，DiaMed，Cressier surMorat)。离心后可立即评价结果。d)评价方法阳性结果是由凝胶上的清晰带或渗入凝胶1～2mm的带而检测出。即使凝集物遍布整个凝胶也指示阳性反应。阴性结果由合成粒子沉入容器底部的清晰沉降显示，此时在凝胶内或凝胶上无带。7.Visceral Leishmaniasis抗体试验(重组抗原的高亲和力结合)a)抗原重组抗原rK39，得自Corixa Inc.，Seattle，USA。b)生物素化和偶联将1ml于pH8.0的10mM Tris中的重组抗原rK39(0.6mg/ml)在4℃下对pH7.4的10mM PBS(Sigma P 4417)透析，然后用Puradisc25AS膜滤器(Whatman)过滤。用硫代(sulfo)-NHS生物素(Pierce21217)进行生物素化。将500μl rK39于10mM pH7.4 PBS(300μg)中的等分试样加入17.5μl 1mg/ml的硫代-NHS生物素水溶液，在室温下将反应混合物保温150min。用KwikSep脱盐柱(Pierce)分离生物化rK39与游离生物素，用10mM pH7.4 PBS，0.05％NaN3进行洗脱。
然后将1ml 0.15％(W/V)红色3.1μm高密度粒子(依2a-2中所述方法制备，按实施例3a，3b中所述那样官能化和用抗生蛋白链菌素处理)悬浮液等分试样与160ng生物素化rK39偶联。为此，配制10X在H2O中的贮备液(每ml 1600ng rK39)，再依实施例6b中所述方法进行实际偶联。c)试验步骤试验步骤与实施例6的一样，只是此时应用以rK39敏化的合成粒子悬浮液。d)评价方法同实施例6中所述8.肝炎B表面抗原试验(单克隆抗体的高亲和力结合)a)抗体针对肝炎B表面抗原的单克隆抗体(MAb)MIH9701检测亚型ad和ay，得自Medix Biotech，Walchwil，Switzerland。b)生物素化和偶联用0.1M pH5.5的乙酸钠缓冲剂稀释200μl 3mg/ml MIH9701溶液至1ml，并对同样的缓冲剂于4℃下透析一夜。将900μl冰冷的20mM偏高碘酸钠水溶液加入900μl所得MAb溶液的等分样，在0℃下暗处保温反应混合物达20min。加入11μl 10％(W/V)甘油溶液终止反应。用色谱法在Kwiksep脱盐柱上从其它反应组分中分离MAb，用0.1M pH5.5的乙酸盐缓冲剂进行洗脱，洗脱后MAb的体积是2.7ml。往其中加入270μl 50mM EZ-连接生物素(link biotin)-LC-酰肼(Pierce21340)于二甲亚砜(Sigma D 8418)中的溶液，在温和摇动下于室温时保温2小时。然后将反应混合物于4℃下对10mM pH7.4 PBS，0.05％NaN3透析，接着通过0.2μm Puradisc AS滤器(Whatman)过滤。又一次用Kwiksep脱盐柱进行对10mM pH7.4 PBS，0.05％NaN3的脱盐步骤。
如此生物素化的MAb在相同的PBS缓冲剂中被调节至35μg/ml，然后将100μl稀释后的MAb溶液加入1ml 0.15％(W/V)红色3.1μm高密度粒子(依2a-c中所述方法制备，按3a、3b所述那样官能化和用抗生蛋白链菌素处理)。在温和摇动下于室温时将此反应混合物保温30min。然后用相同缓冲剂通过离心(1000rpm，5min)洗涤粒子三次。c)试验步骤试验步骤同实施例6，但有如下差别i)应用以MAb MIH9701敏化的合成粒子悬浮液。ii)凝胶基质不含抗人球蛋白。d)评价方法同实施例6。9.抗-dsDNA抗体的试验(非共价结合ds DNA)a)抗原双链(ds)-DNA，I型，得自Sigma(D-1501)。b)偶联将10μl20μg/ml ds DNA(Sigma D 1501)于10mM pH7.4 PBS中的溶液加入500μl 0.15％(W/V)红色3.1μm高密度粒子(依2a-c和3a、3c制备)的悬浮液中。在档位8经涡动步骤(Bender & Hobein，Vortex Genie 2)5秒后，于温和摇动下在室温时保温12小时。用1ml10mM pH7.4的PBS用离心法洗涤悬浮液2次，再悬浮于500μl 10mMpH7.4的PBS中。粒子的最终浓度又为0.15％(W/V)，敏化后的粒子于4℃下贮存。c)试验步骤同实施例6中所述。d)评价方法同实施例6。10.HIV1/HIV2抗体鉴别试验(应用两种以不同方式敏化的不同颜色合成粒子，但它们的物理性质相同)a)抗原HIV-1 gp41和HIV-2 gp36的合成肽序列，得自Alta Bioscience(Birmingham，UK)。b)依实施例6，每ml 0.15％(W/V)粒子悬浮液用72ng gp-41肽和40ng gp36肽偶合。红色粒子(依2a-c制备，按实施例3a、3b中所述那样进行官能化和用抗生蛋白链菌素处理)用HIV-2特异性肽(得自gp 36的抗原序列)敏化，而蓝色粒子(依2a-c制备，按实施例3a、3b中所述那样进行官能化和用抗生蛋白链菌素处理)则用HIV-1特异性肽(得自gp 41的抗原序列)敏化。c)试验步骤同实施例6，但有如下差异分别将10μl红色粒子悬浮液和蓝色粒子悬浮液移转入微量管的反应室，在其中加入2.5μl病人血清。d)评价方法HIV-1/HIV-2阳性结果由凝胶上清晰的红/蓝色带或渗入凝胶1～2mm的色带而检测到，此时粒子未沉降。HIV-1抗体阳性结果由凝胶上或渗入凝胶的蓝带指示，而红色粒子在反应容器底部沉积。HIV-2抗体阳性结果由与之相反的图指示。HIV-1/HIV-2阴性结果由微量反应容器底部清晰的红色/蓝色沉积物指示。11.特异性检测非IgM抗体a)抗原S.aureus A蛋白得自Sigma(P 6650)；山羊抗人IgM抗体(μ链特异性)-生物素偶联物F(ab)2片段得自Sigma(B 2641)。b)生物素化和偶联依实施例8中所述方法进行A蛋白的生物素化。生物素化的抗IgM抗体于10mM pH7.4 PBS中在一种混合物中被调至40μg/ml 3.1μm高密度粒子(1.5％，W/V)，在另一种混合物中被调至1μg/ml粒子(0.15％，W/V)；生物素化的A蛋白被调至浓度为1μg/ml粒子(0.15％W/V)。该操作中，是分别将100μl浓缩10倍的溶液(每种情况中含生物素化的抗IgM抗体(400μg/ml或10μg/ml)或A蛋白(10μg/ml))加入1ml红色3.1μm高密度粒子(依2a-c中所述方法制备，按3a、3b中所述那样官能化和用抗生蛋白链菌素处理)悬浮液。
在温和摇动下于室温时保温该反应混合物达30min。然后用同样的缓冲剂由离心(1000rpm，5min)洗涤粒子3次。c)试验步骤将1ml用抗IgM敏化的粒子在1000rpm下离心5min，弃去上清液。加入20μl稀释1～10倍的健康人血清。在档位8时涡动5秒后，在温和摇动下于室温下将反应混合物保温30min以吸附血清的IgM抗体。在1000rpm时反复离心5min后除去上清液。将下述溶液吸移至含抗IgG的插板(依实施例6中所述)位置125μl A蛋白粒子(1μg/ml)位置225μlA蛋白粒子(1μg/ml)位置325μl抗IgM粒子(1μg/ml)位置425μl抗IgM粒子(1μg/ml)各将5μl吸附前稀释1～10倍的血清加入位置1和3，各取5μl吸附后稀释1～10倍的血清加入位置2和4。在室温下保温10min后于专为微量管设计的离心机(ID离心机12S II，DiaMed，Cressier surMorat)中在85g下离心10min。d)评价方法对照管1和3均呈现如实施例6中所述的明显阳性反应。对于测试混合物2和4，2表现与管1并无不同的阳性反应，而位置4处粒子于反应容器底形成沉积物，于是指示阴性反应。表明试验中有可能专一检测非IgM抗体反应。12.改进离心合成粒子a)抗原和偶联合成肽的来源和偶联依实施例6。b)试验方法惯常方法先后将25μl已敏化的合成粒子和5μl血清/血浆吸移入如实施例6中所述预先装备好的微量管保温室。于室温下保温10min后，将它们置于适于微量管的离心机(ID离心机12S II，DiaMed，Cressier surMorat)内在85g下离心10min。改进方法先后将25μl合成粒子和5μl血清/血浆吸移入如实施例6中所述预先装备好的微量管保温室。于室温下保温5min后将插板置于改进的ID离心机(DiaMed，Cressier sur Morat)中，依如下程序操作1)5s离心，30g2)5min暂停，0g3)10min离心，85gc)评价方法依实施例6中的方法进行评价。在用含抗IgG的凝胶基质操作的试验中，观察到特意对弱阳性结果进行一般增强后的结果。
权利要求
1.通过凝集作用检测样本液体中分析物的方法，其中将样本液体与凝集试剂和惰性基质接触，反应混合物受引力作用，测定分析物与凝集试剂之间的反应，其中将合成粒子用作凝集试剂，选择其直径和密度使得它们对基质的行为基本上与红细胞的一样。
2.权利要求1的方法，其中合成粒子的平均直径≤5μm。
3.权利要求2的方法，其中合成粒子的平均直径在1-5μm范围内。
4.权利要求3的方法其中合成粒子的平均直径在2-4μm范围内。
5.权利要求1-4中之一的方法，其中合成粒子的相对密度≥1.1g/cm3。
6.权利要求5的方法，其中合成粒子的相对密度在1.1-1.8g/cm3范围内。
7.权利要求6的方法，其中合成粒子的相对密度在1.15-1.4g/cm3范围内。
8.权利要求1-7中之一的方法，其中使用由有机聚合物或共聚物构成的合成粒子。
9.权利要求8的方法，其中使用由苯乙烯或苯乙烯衍生物构成的合成粒子。
10.权利要求1-9中之一的方法，其中应用染色粒子。
11.权利要求10的方法，其中应用染成红色的粒子。
12.权利要求1-11中之一的方法，其中能与待测分析物结合的配体分子被固定于粒子表面。
13.权利要求12的方法，其中配体分子由吸附作用、共价作用或高亲和力作用而被固定。
14.权利要求12或13的方法，其中肽、蛋白质、核酸、核酸类似物、糖类、脂质、激素或代谢物通过共价作用或高亲和力作用而被固定于粒子表面。
15.权利要求12或13的方法，其中细胞膜、细胞膜碎片或者细胞或病原体的裂解物通过吸附作用而被结合在粒子表面。
16.权利要求1-15之一的方法，其中分析物由免疫反应测定。
17.权利要求16的方法，其中分析物是抗体。
18.权利要求17的方法，其中进行抗体的类别特异性检测。
19.权利要求16的方法，其中分析物是抗原。
20.权利要求1-15中之一的方法，其中分析物由核酸杂交反应测定。
21.权利要求1-20中之一的方法，其中应用粒状基质。
22.权利要求21的方法，其中基质粒子的平均直径在10-200μm范围内。
23.权利要求1-22中之一的方法，其中应用对每种分析物颜色各不相同的凝集试剂同时测定数种分析物。
24.权利要求1-23中之一的方法，其中反应混合物含去污剂和/或粘蛋白。
25.权利要求1-24中之一的方法，其中反应混合物含还原剂。
26.权利要求1-25中之一的方法，其中引力对反应混合物的作用包括离心作用。
27.权利要求26的方法，其中在数个时间间隔内进行离心作用。
28.平均直径≤5μm且相对密度≥1.1g/cm3的合成粒子，在其表面固定化配体分子。
29.权利要求28的粒子，其中它们的平均直径为2-4μm，而相对密度为1.15-1.4g/cm3。
30.权利要求28或29的粒子，其中它们被染色。
31.权利要求28-30中之一的粒子在凝集试验中作为凝集试剂的应用。
32.检测样本液体中分析物用的试剂盒，它包括a)至少一个含惰性基质的反应容器和b)至少一种权利要求28-30中之一的合成粒子。
33.权利要求32的试剂盒，其中将数个反应容器排在一个插板或盘上。
全文摘要
本发明涉及通过凝集作用检测样本液体中分析物的方法,其中将样本液体与凝集试剂和惰性基质接触,反应混合物受引力作用,测定分析物与凝集试剂之间的反应;其中合成粒子被用作凝集试剂,选择其直径和密度使得它们对基质的行为基本上与红细胞的一样。此外,公开了在其表面吸附有配体分子的新型合成粒子和这些粒子作为检测试剂的应用。
文档编号G01N33/543GK1191312SQ9712553
公开日1998年8月26日 申请日期1997年12月17日 优先权日1996年12月18日
发明者P·施维德, D·巴什福思, R·N·霍比斯, G·马吉茨, M·J·马歇尔, M·J·J·罗伯特 申请人:诊断研究基金会