专利名称：鉴别活性物质的方法
技术领域：
本发明涉及一种鉴别活性物质的方法，特别是在活性物质范围内鉴别大量试样的方法。本发明还涉及一种近场显微镜设备的使用以及涉及一种包含近场显微镜设备和控制设备的装置。此外，本发明还涉及一种纳米级滴定设备。
发现新的基本结构即分子结构，例如配位体、兴奋剂或活性物质时至今日仍然是一种费力费时的检查方法，这些化合物在对于酶或各种受体、DNA-核酸酶或DNA-聚合酶、蛋白酶如凝血酶、膜受体、核受体或结合蛋白的作用已有很大改进。
其成功很大程度上取决于机会，这是由于十分大量的物质必须进行仔细检查直到发现对应目标分子的各种活性物质-例如受体。如果考虑利用例如细胞或者酶的活性测试需要很长的培养时间，则检验大量物质(例如100,000-1,000,000)的生物活性就要花很长的时间，如果测试同样是高度灵敏和非常快速的，这样大量的物质试样才能快速测试和检验。
在很多情况下，在这样的测试中采用荧光法。虽然非常灵敏，但极受干扰。此外，这类方法也非常耗时。即必须考虑由实际的培养到测量操作还需大量其它处理步骤。这些步骤特别包括清洗步骤，用以降低本底荧光，因此提高信噪比。通常，可以说，提高检测方法的灵敏度会降低测试速度。通过单一的测试方法或通过相应的装置来同时解决这两个问题迄今为止显然是不可能的。
最近，由Binnig和Rohrer发明的扫描隧道显微镜(RTM；英文为STM)〔G.Binnig,H.Rohrer,C.Gerber,E.Weibel,Phys,Rev.Lett(物理评论通讯)49(1982),57〕导致在超高灵敏度扫描探测法的领域的快速发展。
在扫描隧道显微镜中，一金属制的探针在导电或半导电试样的上方逐行扫描。以在该探针和试样之间很小的距离下产生的隧道电流作为受控量，将被检测表面的高度分布图和/或电子结构分布图记录下来。这样就能在标准实验室的条件下按照约0.1纳米的原子分辨率检测该结构。1986年〔G.Binnig,C.F.Quate,C.Gerber,Phys.Rev.Lett.56(1986)930〕利用扫描原子力式显微镜(Scanning Force Microscopy,SFM)已将该方法应用于非导电试样。这样就使得能够检测聚合物材料〔G.Krausch,M.Hipp,M.Bltau,O.Marti,J.Mlynek,Macromolecules(大分子)28(1995)260〕以及甚至在生理条件下的生物结构〔C.Bustamante,D.Keller,Physice Today(现代物理)，December 1995,32〕。在SFM中，利用装在柔性杠杆臂上的由硅或氮化硅制作的锥形的探针进行扫描。通常以先学方式测量杠杆壁偏转，并再构成高度分布图。
如果取代所述的探针，使用例如输入激光的呈尖头的光导纤维作为探针在试样上方移动，利用光电探测器检测依赖于试样特性的反射光或透射光，可用扫描式近场光学显微镜(Scanning,Nearfield OpticalMicroscopy,SNOM或NSOM)来实现〔Heinzelmann,D.W.Pohl,Appl.Phys．(应用物理)A59(1994)89；E.Betzig,J.Trautman,Science(科学)257(1992)189〕。通过回避在常规光学中产生的衍射限制，利用所有通常的光学对比机理，例如吸收、反射、偏振、荧光等，这些方法直到纳米范围都可能得到十分高的局部分辨率。在荧光式显微镜中，所达到的灵敏度使得能检测单个产生荧光的分子〔E.Betzig,R.J.Chichester,Science 262(1993)1422〕。这种方法示意地表示在
图1中。
除利用上述实例介绍的SNOM装置之外，在现有技术中还介绍另一些装置。例如，可以采用四面体探针(Koglin J.et al.,Photons andLocal Probes(光子和定域探针)，Proc.of the NATO AdvancedResearch Workshop.Ed.Mart O.et al.,Kluwer Academic Publ.1995)或者，例如，光导探针(Akamine S.et al.,Proceedings.IEEEMicro Electro Mechanical System 1995,Page 155)。
这些技术仅用于在生物领域中的零星的探测中，例如S.Smith et al.,Proc.SPIE-Int.Soc.Opt.Eng.1855,81(1994)(扫描探针显微镜Ⅱ)或者D.M.N.Jondle et al.,Chromosome Research(染色体研究)3,239(1995)。后一参考文献介绍了利用SFM研究来自果蝇唾腺的多线染色体的超细结构。
基于上述，本发明的目的是提供一种鉴别活性物质的方法，其中可以在十分短的时间内检测多个试样，这种方法不仅省时，而且与迄今为止的通用方法相比较只需要尽可能少的用工量。
利用这样一种方法实现这一目的，即由利用扫描近场光学显微镜设备(SNOM设备)可以观察的信号〔S〕的变化检测活性物质。因此，本发明还涉及在该鉴别方法中SNOM设备的应用，以及涉及一种装置，其包含近场显微镜设备、单个或多个试样接受设备以及控制装置，用以利用SNOM设备对该单个或多个试样贮存设备中的各个隔室进行寻址。
本发明的各优选实施方案是从属权利要求的主题。
在附图中图1表示利用光导纤维的SNOM设备的基本结构，图2a)和2b)表示在本发明的鉴别方法中利用SNOM进行的处理步骤，为在〔a)〕之前或在〔b)〕之后添加一种含有活性物质W2的和另一种活性物质Wx的溶液到由受体R1和荧光标记的活性物质W1形成的配合物中；图3a)和3b)表示与图2a)和2b)中相同的处理步骤，不过受体R1和活性物质W1的排列是互换的；图4表示在本发明方法的实施方案中以夹层一技术形式进行的处理步骤；图5表示本发明方法的另一实施方案，其中由该受体的构象变化间接检测未知的活性物质Wx。
如在图1中所示的SNOM设备一般具有一尖端形的光导纤维(1)，例如来自光源(3)的Ar激光入射到其中，并且利用控制装置(4)导向试样(2)以及还有一带检测电子电路装置(6)的光电探测器(5)，用于检测由试样(2)反射或透射的光。
如前所述，本发明还涉及一种特别是在鉴别大批试样中采用SNOM技术鉴别活性物质的方法。借助于这种技术，如果探针和试样之间的距离处在几纳米范围内，就能够检测各单个分子的荧光。然而，在本发明方法中采用SNOM技术原则上并不局限于荧光法的领域，而是，可以采用任何一种在其中被检的新活性物质能够引起光信号变化的检测方法。因此，该光信号除了涉及荧光外还可以涉及吸收、偏振或波长取决于这些特性的变化。
同样在本发明方法中采用的SNOM技术不局限于在图1、2和3中所示的，即利用光导纤维形成光的近场。所有扫描型光学装置都可以采用，只要它们能形成可达到与利用光纤可能达到的相似分辨率的近场。这些仪器例如包含上述的四面体探针或光导探针。
为了鉴别活性物质，SNOM能有利地例如按照如下方式使用首先，将受体R1(图2)或参照活性物质W1化合物(图3)固着在基片2的适宜表面上。术语受体在这里是十分广义的，例如包含血纤维蛋白原、内皮缩血管肽、DNA或RNA、蛋白质和脂类，此外还有完整的细胞或者一块组织。这些需固着的物质下文中还被称为分子A。该基片可以是具有汽相沉积金涂层的硅晶片，即经改性的例如硅烷化过的硅表面或者另一种平的基片例如云母、石墨等。还可以使用生物基片。不过可能需要事先将它们固着在上述无机基片上。固定的受体(R1)(图2)或参照活性物质(W1)(图3)用荧光标记的活性物质(W1-F)或者荧光标记的受体(R1-F)，下面以分子B表示覆盖以及可以说被屏蔽。如果添加具有较高亲合力的更强的活性物质W2〔图2b〕或〔图3b〕，则将参照活性物质(W1)由该受体结合部位置换出，并将活性物质W2结合。因此，由该表面置换出荧光标记的活性物质W1(图2b)。在相反的情况下发生同样过程，如果参照活性物质W1固定在基片上，则两种活性物质W1和W2将竞争结合到非固定的但是以荧光标记的受体上(图3)。在这两种情况下，好象直接位于受体上的光导纤维接收的荧光降低或者甚至下降到零。然而，还可以仅受到调制，例如其波长关系发生改变。在这种情况下，无光强变化而是荧光颜色变化。
利用SNOM技术的本发明方法的特殊优点在于，由于扩散在溶液中自由运动的发荧光的分子实际上不起作用，即未被SNOM探针检测。采用SNOM时产生相关信息的体积是极少的，这是由于信号与距离有很强的相关性。该体积达几立方纳米到几万立方纳米。因此，自由扩散的发荧光的分子在这种方法中不起作用，故得到很好的信噪比。这与目前已知的高灵敏测量方法相比具有决定性的优点，由此不需对试样进行耗时的后处理，例如多次洗涤。
由于这一点，很清楚的是在本发明方法中利用光导纤维形成近场不是关键。任何能形成适当近场的方法都具有上述优点。
在图4中表示本发明方法的另一实施方案。这种方案不同于图1到3中所表示的上述方案，其区别之处是，直接检测新的活性物质Wx。首先，将未知的活性物质Wx结合到受体R1上。此新的活性物质Wx具有一区域(*)，通过它与已知的活性物质W1相区别。为了检测这一区域，可使用一种已知的分子探针，例如利用荧光素-异硫氰酸盐(FITC)标记的抗体。这种以荧光标记的抗体被结合到由活性物质Wx和R1组成的配合物上。按照这种方式，利用检测的荧光可以直接检测该配合物。
在图5中表示本发明方法的另一实施方案。这一实施方案不同于在图4中所示的实施方案，其区别在于荧光标记的抗体并没有直接结合到未知的活性物质Wx上，而是在结合到受体R1时多次引起在受体R1中的构象产生变化(变构效应)。在构象变化显示出在受体上的新的结构区域。一个生物分子探针例如荧光标记的抗体(FITC)被结合到这些区域。按照这种方式，通过新活性物质Wx产生的荧光可以间接地检测该活性物质。
在上述各情况中，活性物质可经由适当的溶剂例如水性或酒精的盐溶液或适当溶剂添加。测量可在溶剂中或者对干燥的试样进行。活性物质的检测不是单个进行，而是可以按照相同的方式对各活性物质的混合物，也可对与其它化合物的混合物进行分析(参看图2)。可以利用ELISA-板(96-孔-微型滴定板)和对应的试样处理系统以及溶液处理系统例如用于纳米级系统的自动移液管来固定。当然还可以按相同的方式对固定在细胞状结构上的受体进行分析。
可以按照共价或非共价方式实现分子的固定，该分子可以是受体、配合体或者另一个分子，例如纳米级受体或在免疫系统细胞上的受体或在基片上的细胞状结合蛋白。非共价固定例如通过间接吸附实现。然而，如果该基片具有适当的活性表面，也可以利用共价结合实现固定。例如，在液相吸附时(自装配〔S.Akari等人；Adv.Mater.7(1995)549〕，基片表面活化可通过涂敷三硫醇羧酸来实现。利用面向外的酸根的吸附，该硫醇结合到基片例如金表面上。
不是必须将分子A直接结合到基片表面上或者硫醇羧酸上。还可以是间接的。例如，可以在上述硫醇羧酸和分子A之间配置例如蛋白质、受体、配合体等之间配置所谓间隔基。一种这种类型的间隔基是氨基己酸或亚精胺。这些分子可以通过氨基结合到上述硫醇羧酸上。
下面介绍分子的结合，即将受体活性物质、配合体之类结合到基片表面上。在上述情况下，通过间隔基按共价结合。
如果由于某些原因例如由于不合适的空间构象使在基片表面和分子A之间加入间隔基不能实现，也可多次重复间隔基的引入步骤。例如，可以将上述的间隔基氨基己酸中的两个或多个分子彼此连接。连接的间隔基的数目的限制仅在于，如果在基片表面和通过间隔基连接到其上的分子A之间有大的距离时，就词的真实意义上讲固定就不再发生，这是由于十分长的间隔基自然是相当能变形的。因此不可能利用SNOM。
根据测量原理，有一点是特别有利的，即方法的并行是可能的。代替单条光导纤维可同时采用多条纤维。荧光的检测可以利用光纤耦合器件和/或探测器阵列进行。因此，可以直接例如读取ELISA板中的多个小穴，或者甚至读取通常具有96个检测部位的整块板。
然而，利用本发明装置来实现是有利的，该装置包含近场显微镜设备、单个或多个试样接受设备以及用于利用SNOM设备对于单个或者多个试样接受设备中的各个隔室进行寻址的控制装置。当然，相反的控制过程也是可能的，即利用该可动的多试样接受设备对近场显微镜设备进行寻址，其方式与在常规的显微镜中移动试样台一样。
在这一设备中多试样接受设备最好具有多孔-微滴定板，例如像在ELISA测试中使用的一样。这种类型的多试样接受设备尺寸最好最小化，以便提高本发明的活性物质鉴别方法的速度。在这种情况下，对于个个隔室的尺寸(直径)的下限仅由光导纤维的尺寸来确定。因此该下限约为10纳米。
原理上不存在上限。然而，为使鉴别方法的速度达到最佳，在微型化的设备中的隔室尺寸超过几百微米特别是500微米则不是十分有效的。优选的上限是150微米。
在这种最小化的接受设备中，为了使速度最佳，对于具有孔〔“阱”〕形的含试样的个个隔室不再是必需的，正像已知常规的微滴定板一样。适宜的结构可为小凹槽、小穴或金属化凸点，例如在硅或其它材料例如塑料或玻璃中或其上通过光刻和/或蚀刻或压印工艺形成。此外，可考虑利用蒸气沉积结构或者利用自集合方法形成的结构。也可以采用由LIGA法形成的微结构。
为了对隔室更快读数，具有穴形、槽形或平的凹槽形的结构就足够了。在这方面对于在本发明方法或在本发明装置中采用的多试样接受设备的最佳结构由十分平的平板组成，在其上以很小的滴形放置需分析的试样。如果所用的基片是Si-晶片，其上以小滴的形状放置各试样，最好所涉及的位置的表面结构与其周围环境不同。例如，在有蒸气沉积金的区域情况下，最好个个隔室具有金的基层，而疏水性的硅将各个隔室彼此隔开。
包含近场显微镜仪器、具有试样用隔室的单个或多个试样接受设备和控制装置的整个装置可按如下的方式改进，即控制装置不是控制SNOM设备，而是控制多试样接受设备，其方式与在如上面已介绍的利用常规显微镜的在光学显微镜的该区域中移动的显微镜试样台相似。
控制机构本身与本技术领域的技术人员从其它计算机控制设备的熟悉的例如步进电动机控制系统相似。
一般地说，这种类型的多试样接受设备中的各个隔室可以按照所需的方式分布，不过特别是呈矩形或者圆形结构。
实施例下面提供本发明方法的一个实例。
利用市售的SNOM仪器(例如Aurora,TopoMetrix公司)检测荧光。所用的基片是具有金蒸气沉积的金的ELISA板或Si-晶片。通过液相吸收(自集合)将硫醇羧酸涂敷到其上。硫醇结合到金表面上，酸根面向外。将相关的受体例如抗生物素蛋白或凝血酶通过肽键合固定到其上。
利用如上所述的间隔基(例如氨基己酸或亚精胺)或其它配位体衍生带羧基的改性的表面或探针可以实现这一点。为此，利用100毫摩尔N-羟基丁二酰胺(C4H5NO3)和N-(3-二甲基-氨基丙基)-N′-乙基碳化二亚胺(氯化氢)C8H18ClN3和利用氨基己酸或亚精胺(在每种情况下100毫摩尔)培养基片或金探针的羟基持续5分钟。
然后利用N-羟基丁二酰胺和N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳化二亚胺按照上面介绍的将以氨基己酸衍生的表面重新活化，并且再次利用例如浓度为100微克/毫升的含氨基的配位体(例如凝血酶或另一种蛋白质)反应。然而，还可以将低分子量配位体例如如下的凝血酶抑制剂结合到该表面上。
假如所选择的隔基是亚精胺，则它的自由氨基可以与配位体的活化的羧基反应。这种活化的羧基同样可按照上述方法制备。然而也可以采用其它方法，例如公知的由肽合成活化羧基a)利用氯甲酸、EEDQ、IIDQ活化羧酸，以得到混合的酐，b)利用碳化二亚胺活化羧酸，以得到对称的酐，c)例如利用碳化二亚胺、苯三唑的脲鎓盐类或通常的脲鎓盐类以及可能利用五氟化酚、羟基丁二酰胺、羟基苯三唑或者它们的衍生物作为活性酯进行活化，d)作为卤化物或拟卤化物活化，例如用TFF的氟化物，用BrOP的溴化物或作为叠氮化物活化。
然后添加按荧光标记的抗生物素蛋白或凝血酶，并结合到参照活性物质上，因此直接在基片的表面上形成发荧光的配合物。利用SNOM可检测这种个个分子的荧光。如果添加带有更有效的活性物质的混合物，则标记的抗生物素蛋白或凝血酶由其结合状态游离出来并由该表面扩散开。由此使荧光降低。然而，在添加的混合物中所含的更有效的活性物质不必与固定在基片表面上的活性物质固定在相同的部位。以荧光素标记的分子的减少还可以由结合到基片上的另一部位来引起。构象的改变(变构效应)会降低荧光标记的分子对于在基片表面上固定的配合体的亲合力，使得仅有小部分的发荧光分子保持结合在该表面上，因此同样使荧光降低。
作为基片使用的细胞状结构的实例特别是膜片固定的受体；除传统的信号转换受体(例如与G-蛋白偶合的受体和与配位体相关的离子通道以及与电压相关的离子通道)外，在免疫系统的细胞上或在血小板上的受体(例如GPⅡb/Ⅲa受体)以及在细胞上的纯结合蛋白也是重要的细胞状结构体。
权利要求
1．一种鉴别活性物质的方法，其中利用扫描式光学近场显微镜设备(SNOM设备)所观测到的信号〔S〕的变化来检测活性物质。
2．如权利要求1所述的方法，其中扫描式光学近场是利用光导纤维(1)形成的。
3．如权利要求1或2所述的方法，其中活性物质鉴定的步骤包含提供具有多个用于试样的隔室的多试样接受设备，以及最好利用并行工作的SNOM设备在所有的或者一部分隔室实施如下的步骤a)将分子A直接或间接地、按共价或非共价方式结合到基片(2)上；b)使利用扫描式光学近场显微镜设备的信号〔S〕可检测的分子B按非共价方式结合到分子A；c)添加一种包含活性物质W2的溶液，由分子B结合的变化以及由此引起的信号〔S〕的变化来检测活性物质W2的存在。
4．如权利要求1或2所述的方法，其中活性物质鉴定的步骤包含提供具有多个用于试样的隔室的多试样接受设备，以及按并行或顺序的方式在所有的或一部分隔室实施如下的步骤a)使分子A能结合到基片(2)上，b)添加包含活性物质(Wx)的溶液，c)使活性物质Wx与A结合，形成分子配合物A-X，d)添加包含分子探针FITC的、可利用扫描式光学近场显微镜设备的信号〔S〕来进行检测的溶液，e)使分子探针FITC与配合物A-X结合，以及f)通过测量〔S〕检测FITC与A-X的结合。
5．如前述任一权利要求所述的方法，其中的信号〔S〕是荧光信号。
6．如前述任一权利要求所述的方法，其中通过吸附实现分子A与基片(2)的结合。
7．如前述任一权利要求所述的方法，其中的基片(2)是Si-晶片、经金蒸气沉积的微滴定板、云母、石墨或细胞状结构、或者它们的组合。
8．如权利要求7所述的方法，其中该细胞状结构是一种经膜片固定的受体。
9．如前述任一权利要求所述的方法，其中的分子A经由间隔基，特别是亚精胺或氨基己酸间接地结合到基片(2)上。
10．如权利要求9所述的方法，其中间隔基经由吸附在基片(2)上化合物结合。
11．如前述任一权利要求所述的方法，其中使用包含SNOM-设备的并行测量装置，同时检测用于鉴定活性物质用的多个试样隔室。
12．如前述任一权利要求所述的方法，其中信号〔S〕利用光的对比，特别是在吸收、荧光、偏振或其波长相关性上的差别来检测物质X的结合。
13．如权利要求10-12中之一所述的方法，其中多次重复间隔基的结合步骤。
14．一种用于鉴别活性物质的扫描式光学近场显微镜设备(SNOM-设备)的应用，其中利用扫描式光学近场显微镜设备所观察到的信号〔S〕的变化来检测活性物质。
15．如权利要求14所述的应用，其中实施权利要求1-13所述的方法之一。
16．一种装置，它包含近场显微镜设备、单个或多个具有用于试样的隔室的试样接受设备、以及利用近场显微镜设备对该单个或多个试样接受设备中的各个隔室进行寻址的控制装置。
17．一种装置，它包含近场显微镜设备、单个或多个具有用于试样的隔室的试样接受设备、以及利用单个或多个试样接受设备对近场显微镜仪器进行寻址的控制装置。
18．如前述任一权利要求所述的装置，其中的单个或多个试样接受设备是多孔的微滴定板。
19．一种多隔室-纳米级滴定设备，它包含一平板和在其上分布的多个纳米级隔室。
20．如权利要求19所述的多隔室-纳米级滴定设备，其中隔室的尺寸(直径)为10-100纳米。
21．如权利要求19或20所述的多隔室-纳米级滴定设备，其中纳米级隔室呈蝶形凹穴状。
22．如权利要求19或20所述的多隔室-纳米级滴定设备，其中纳米级隔室是由该平板上的剩余区域所隔开，其尺寸(直径)是由与这些剩余区域不同的化学结构或者成分所确定。
23．如权利要求19-22中之一所述的多隔室-纳米级滴定设备，其中平板是疏水性的硅，该纳米级隔室是由表面结构的变化所确定。
全文摘要
一种鉴定活性物质的方法,其中利用扫描式光学近场显微镜设备(SNOM设备)所观察到的信号[S]的变化来检测该活性物质,以及一种适用于此目的装置,其包含SNOM设备、单个或多个试样接受设备和控制装置。
文档编号G01N33/543GK1231728SQ97198334
公开日1999年10月13日 申请日期1997年7月30日 优先权日1996年8月2日
发明者H·弗赫斯, T·弗里德里希, W·施雷普 申请人:Basf公司