专利名称：用于抑制肿瘤性损伤的化合物的鉴定方法
背景技术：
本发明提供了用于鉴定化合物的方法，所述化合物可用于治疗和预防哺乳动物中的前癌损伤和癌损伤。本申请是美国专利申请08/866027(Piazza et al.,1997年5月30日申请)的接续申请。
家族性腺瘤息肉病(FAP)是一种遗传病，在大多数情况下患者的结肠中有许多息肉或腺瘤。由于这些患者长有许多息肉或腺瘤，而这些息肉或腺瘤发展成癌症的可能性很大--通常的治疗方法是通过外科手术除去结肠。在约1983年，Waddell发现，当将非甾体抗炎药(NSAID)舒林酸施用给患FAP的患者时，会使结肠息肉(一种前癌损伤)退化并防止其复发。Waddell用舒林酸治疗FAP患者的结果在数个随后的研究中得到证实。不幸的是，由于舒林酸和其它NSAIDS会使长期施用它们的患者的消化道损伤(更不用说与肾有关的副作用和干扰正常的血液凝集)，因此，该方法不是可行的治疗FAP或任何其它需长期给药的癌或前癌指征(即肿瘤)的方法。
Waddell最初假设舒林酸对结肠息肉的作用机制是抑制前列腺素(PG)的合成。(Waddell,W.R.et al.,“Sulindac for Polyposis of theColon”,Journal of Surgical Oncology,24:83-87,1983)。前列腺素(PG)合成的抑制产生于因NSAID而引起的环加氧酶(COX)的抑制。NSAID的一种常见好处是降低炎症，通常认为这是由PG水平的降低引起的。由于已知NSAID可抑制COX,COX抑制PG合成，因此普遍认为结肠息肉的退化是这种特性作用的结果。事实上，尽管与最新的发现相反，但人们已经习惯地认为将PG合成抑制剂(如NSAID)施用给患FAP或其它前癌损伤或癌损伤的患者后，会因PG水平的降低而使损伤退化。
但最新发现将科学家引向一个完全不同的方向--即不需抑制COX就可成功地治疗肿瘤患者。Pamukcu等在美国专利5401774中公开了磺酰基化合物可出人意料地抑制多种肿瘤细胞(包括结肠息肉细胞)的生长，而以前报道认为这些化合物没有PG合成抑制剂的活性(因此不是一种NSAID或抗炎化合物)。已在结肠癌的大鼠模型中证实了这些磺酰基衍生物是有效的，而且已证明一种变体(现称为exisulind)在FAP病人的初期临床试验中是有效的。
不能夸大该发现--以及抗肿瘤活性和COX抑制之间没有关系的重要性。如果这两种现象是有关的，那么对于用于FAP患者的NSAID治疗的安全性就不能寄于什么希望，因为NSAID的副作用，如胃刺激也是由COX抑制引起的。前列腺素对于胃内壁(lining)有保护作用。在施用NSAID时，COX受到抑制，PG水平降低胃刺激是一种普遍结果。在短期(急性)治疗中，这些副作用本身并不显著。但是在长期(缓慢的)NSAID治疗中，胃刺激、出血和溃疡是很常见的。在许多病例中，均由于这些严重的副作用以及其它可能的致死副作用而必须终止NSAID治疗。此外，所述副作用的严重性随年龄的增加而增加，可能是因为胃粘膜中的天然PG水平随年龄而下降的缘故。因此，用于治疗肿瘤损伤的有用的化合物应能合理地抑制肿瘤细胞的生长，但不应抑制COX。
可以用筛选化合物的常规方法找到抑制肿瘤细胞生长的改进的化合物。在这种情况下，可用体外模型筛选药物。但常规体外筛选方法可能会由于许多意想不到的问题而放过许多在以后的动物模型中表明是无效的化合物，问题之一可能是体外筛选不能预测化合物的功效。动物模型费时费钱。因此，需要能提供预兆的治疗肿瘤信息的更精确的体外筛选化合物的方法，以便在人试验前筛选化合物。有关抑制人癌症特异性靶的知识可以使精确度和效力更高，由此在动物试验前鉴定出高效安全的化合物。
目前，合理药物鉴定方法被用于药物工业以改进临床上有用的化合物的鉴定方法。通常，合理药物鉴定方法指“锁-匙”概念，由此，确定治疗靶分子(锁)和药物化合物(匙)之间的结构关系。通过专用的计算机软件进入化合物数据库，以鉴定与靶分子吻合的可能的几何接合，从而大大改进了所述方法。不幸的是，为了使用这些系统，人们不得不深入了解靶分子(锁)。所述靶可能是例如酶、蛋白质、膜或核受体、或核酸序列。
在复杂的疾病如肿瘤中，科学家已经鉴定了许多可能的靶点。但是，可用于治疗肿瘤的许多药物是非特异性的并对正常组织有毒性，因此不能用于治疗前期癌，而只有当肿瘤细胞发展为癌时才能使用这些药物。对癌症机制的进一步了解可以使科学家转向设计更具特异性的抗肿瘤药物-即可以在疾病进展的早期安全施用的药物。本发明概述本发明涉及新的体外筛选试验化合物的方法，该方法用于检测化合物安全治疗和预防肿瘤、特别是前癌损伤的能力。具体地说，本发明提供了鉴定试验化合物的方法，所述化合物可用于治疗和预防肿瘤、包括前癌损伤并且与COX抑制和其它非特异性相互作用有关的副作用最小。
因此，在本发明的优选实施方案中，筛选方法包括测定试验化合物的COX抑制活性。由于本发明人发现了抑制癌症和抑制磷酸二酯酶5型同工酶(“PDE5”)之间的关系，所以本发明包括测定化合物的PDE5抑制活性。本发明的筛选方法优选还包括测定化合物是否可以抑制细胞培养物中的肿瘤细胞的生长。
在另一个实施方案中，本发明的筛选方法涉及测定化合物的COX抑制活性、测定化合物的PDE5抑制活性以及测定化合物是否可以诱导肿瘤细胞的细胞程序死亡。
通过用该方法筛选化合物，可以比以往更迅速、更精确地鉴定出潜在的有益的且更好的化合物。通过下述详细说明，其它优点将更加明显。附图简述
图1说明舒林酸的硫化物衍生物和舒林酸的砜衍生物(a.k.a.exisulind)对纯化的环加氧酶活性的影响。
图2说明试验化合物B和E对COX抑制的影响。
图3说明舒林酸的硫化物和exisulind对从培养的肿瘤细胞中纯化出的PDE-4和PDE5的抑制作用。
图4说明舒林酸硫化物对HT-29细胞中环核苷酸水平的影响。
图5说明化合物B的磷酸二酯酶抑制活性。
图6说明化合物E的磷酸二酯酶抑制活性。
图7说明舒林酸硫化物和exisulind对HT-29细胞的细胞程序死亡和坏死的影响。
图8说明舒林酸硫化物和exisulind对HT-29细胞生长抑制和由DNA片段化确定的细胞程序死亡诱导的影响。
图9说明化合物E的细胞程序死亡诱导特性。
图10说明化合物B的细胞程序死亡诱导特性。
图11说明舒林酸硫化物和exisulind对肿瘤细胞生长的影响。
图12说明舒林酸硫化物和对照(DMSO)的生长抑制和细胞程序死亡诱导活性。
图13说明化合物E的生长抑制活性。
图14说明在小鼠乳腺器官培养中，舒林酸代谢物对前期恶性、肿瘤损伤的抑制作用。优选实施方案的详述本发明的方法用于鉴定可用于治疗或预防肿瘤的化合物，所述化合物没有常规NSAID的严重副作用。
认为癌症和前期癌是与细胞生长失调有关的疾病。细胞生长涉及许多不同的因素。其中一种因素是细胞增殖怎样过快，另一种是细胞怎样快速死亡。根据环境刺激的情况，细胞可通过坏死或细胞程序死亡而死亡。细胞分化是影响肿瘤生长动力学的另一因素。分辨出试验化合物影响与细胞生长有关的许多因素的哪一方面，对于发现药物治疗的相关靶点是非常重要的。可将以该选择性为基础的筛选试验与确定哪个化合物有生长抑制活性的试验相结合。
本发明是数个重要发现的产物。首先，本发明人发现合乎需要的肿瘤细胞生长抑制剂诱导通过细胞程序死亡的癌细胞在成熟前死亡(参见Piazza,G.A.et al.,Cancer Research,55(14),3110-16,1995)。其次，本发明人意想不到地发现选择性地诱导细胞程序死亡而基本没有COX抑制作用的化合物，也可抑制磷酸二酯酶(PDE)。具体地说，与科学家的研究相反，可治疗肿瘤损伤的化合物选择性地抑制磷酸二酯酶的5型同工酶(PDE5)(EC3.1.4.17)。PDE5是至少7种磷酸二酯酶同工酶中的一种。PDE5是独特的，即它可选择性地降解环GMP，而其它类型的PDE是非选择性的或降解环AMP。优选地，合乎需要的化合物基本上不抑制其它类型的磷酸二酯酶。
本发明优选的实施方案包括测定给定化合物的环加氧酶抑制活性，测定所述化合物的PDE5抑制活性。通过评估试验化合物的活性与特定截断值而直接地或通过将受试化合物的活性与用于治疗肿瘤损伤的已知化合物的活性加以比较而间接地，来评价试验化合物治疗肿瘤损伤的能力。已知可有效治疗肿瘤损伤而不会引起胃刺激的标准化合物是5-氟-2-甲基-1-(对-甲基磺酰基亚苄基)-3-茚基乙酸(exisulind)。其它可用于比较目的的有用的化合物包括已知抑制COX的那些化合物，如消炎痛和舒林酸5-氟-2-甲基-1-(对-甲基磺酰基亚苄基)-3-茚基乙酸的硫化物代谢物(舒林酸硫化物)。其它用于比较目的的有用化合物包括已知抑制PDE5的那些化合物，如1-(3-氯苯胺基)-4-苯-2,3-二氮杂萘(MY5445)。
如果试验化合物好于exisulind或可与exisulind相比，并且不抑制COX，显然就可确定该化合物是一种有前途的候选化合物。通常，合乎需要的化合物是抑制PDE5并抑制细胞生长，以及诱导细胞程序死亡，但在药物学可接受的剂量下不抑制COX的化合物。
文中所用术语“前癌损伤”包括以异常肿瘤形成为代表的综合征，包括异型增生、组织改变。实例包括结肠、乳腺、前列腺或肺组织内的异型增生，或如异型增生痣综合征、皮肤恶性黑素瘤的前体等病症。除异型增生痣综合征外，实例还包括息肉病、结肠息肉、子宫的前癌损伤(即子宫异型增生)、食管、肺、前列腺异型增生、前列腺内肿瘤、乳腺和/或皮肤以及相关疾病(如actinic keraosis)，不论所述损伤在临床上是否是可鉴定的。
文中所用术语“癌”或“癌症”指癌性损伤。实例包括恶性黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌和结肠癌。文中所用术语“肿瘤”和“瘤”指癌性的和前癌性损伤。
文中所用缩写PG指前列腺素；PS指前列腺素合成酶；PGE2指前列腺素E2；PDE指磷酸二酯酶；COX指环加氧酶；RIA指放射性免疫检测。
文中所用“PDE5”指表现出cGMP特异性水解酶活性和高cGMP结合亲和性的酶和其任何异构体。
在本发明的另一方面，提供了对需要肿瘤治疗的患者进行治疗的方法，该方法包括鉴定在可药用剂量下表现出PDE5抑制活性的化合物，给患有对所述化合物敏感的肿瘤的患者施用一种或多种所述化合物。筛选方法提供下列筛选方法和其它方案以有助于理解用于筛选试验化合物的优选方法，所述方法用于测定所述化合物治疗或预防肿瘤，特别是前癌损伤的潜力。1 测定COX抑制活性可用两种方法中的任一种测定COX抑制作用。一种方法包括将完整HL-60细胞与待筛选化合物接触，然后测定HL-60细胞分泌PGE2的量。另一种方法包括在存在所述化合物的条件下，测量纯化的环加氧酶(COX)的活性。这两种方法涉及在以前的文献中描述过的操作方案。
1.A．PGE2分泌按照本领域已知的方法，评估本发明的化合物，以确定其是否可抑制前列腺素E2(PGE2)的生产。例如。通过采用用于PGE2的酶免疫检测(EIA)试剂盒(如从Amersham,Arlington Heights,IL USA购买的)测量细胞分泌的PGE2。适宜的细胞包括产生丰富PG的那些细胞，如HL-60细胞。HL-60细胞是在成熟粒细胞中，用DMSO分化的人早幼粒细胞。(参见Collins,S.J.Ruscetti,F.W.,Gallagher,R.E.and Gallo,R.C.,“Normal Fuctional Characteristics of Cultured Human PromyelocyticLeukemia Cells(HL-60)After Induction of Differentiation ByDimethylsulfoxide”,J.Exp.Med.,149:969-974,1979)。在用钙离子载体A23187刺激后这些分化的细胞产生PGE2(参见Kargman,S.,Prasit,P.and Evans,J.F.,“Translocation of HL-60 Cell 5-Lipoxygenase”,J.Biol.Chem.,266:23745-23752,1991)。HL-60细胞可从美国典型培养物保藏中心得到(ATCC:CCL240)。在37℃,5％CO2下，它们可在补加有20％热灭活胎牛血清、50U/ml青霉素和50μg/ml链霉素的RPMI1640培养基中生长。为了诱导骨髓分化，将细胞与1.3％DMSO接触9天，然后洗涤并将之以3×106细胞/ml重悬在Dulbecco’s磷酸盐缓冲液中。
在存在所需浓度的受试化合物的条件下，于37℃将分化的HL-60细胞(3×106细胞/ml)保温15分钟。然后用A23187(5×10-6M)对细胞刺激15分钟。按上述测量分泌到外部培养基中的PGE2。
1.B 纯化的环加氧酶已经报道有两种不同形式的环加氧酶(COX-1和COX-2)可调节前列腺素合成。已知COX-2代表COX的可诱导形式，而COX-1代表构成形式。采用按Boopathy&Balasubramanian所述(“Purification AndCharacterization Of Sheep Platelet Cyclooxygenase”(Biochem.J.,239:371-377,1988,该文献引入本文作为参考))从公羊精囊纯化的COX-1，通过Mitchell等描述的方法(“Selectivity of NonsteroidalAnti-inflammatory Drugs as Inhibitors of Constitutive and InducibleCyclooxygenase”Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:11693-11697,1993，该文献引入本文作为参考)可测量COX-1的活性。按Mitchell等所述(1993，同上文)，用从羊胎盘中纯化的COX-2可测量COX-2的活性。
用本领域已知的方法可测定药物的环加氧酶抑制活性。例如，Boopathy&Balasubramanian(1988，同上文)描述了一种方法，其中在37℃将前列腺素H合酶1(Cayman Chemical,Ann Arbor,Michigan)与100μM花生四烯酸(Sigma Chemical Co.)、辅因子(如1.0mM谷胱甘肽、1.0mM氢醌、0.625μM血红蛋白和1.25mM CaCl2,在100mMTris-HCl中，pH7.4)和待测药物一起保温20分钟。保温后，用三氯乙酸终止反应。通过加入硫代巴比土酸和丙醛终止反应后，可在530nm通过分光光度计测量酶活性。
显然，相对于其较大的PDE5抑制活性而言，表现出最小COX-1和COX-2抑制活性的化合物不是完全不合乎需要的。
1.C．分析结果通过比较在存在和不存在试验化合物的条件下环加氧酶的活性，来确定抑制量。在约100μM的浓度下残留的或没有COX抑制活性(即低于约25％)，表明应进一步评估所述化合物用于治疗肿瘤的用途。对于需进一步考虑其潜在用途的化合物，优选其IC50浓度应大于1000μM。
2．测定磷酸二酯酶(PDE5)抑制活性用从任何肿瘤细胞系如HT-29或SW-480分离的酶，或重组HS-PDE5，或测量完整细胞中环核苷酸水平，通过对磷酸二酯酶的抑制作用来筛选化合物。
2.A．酶检测用本领域已知的方法，如用放射性3H环GMP(cGMP)(环3’,5’-鸟苷单磷酸)作为PDE5酶的底物来测定磷酸二酯酶活性。(Thompson,W.J.Teraski,W.L.,Epstein,P.M.,Strada,S.J.,Advances in Cyclic NucleotideResearch,10:69-92,1979，该文献引入本文作为参考)。简言之，在共400μl体积中，将确定底物3H-cGMP比活性的溶液(0.2μM；100,000cpm；含40mM Tris-HCl(pH8.0)、5mM MgCl2和1mg/ml BSA)与待测药物混合。将混合物与从HT-29细胞分离出的部分纯化的PDE5一起在30℃保温10分钟。例如通过将反应混合物煮沸75秒钟来终止反应。在冰上冷却后，加入100μl 0.5mg/ml蛇毒(可从Sigma得到的O.Hannah蛇毒)，然后在30℃保温10分钟。然后通过加入例如1ml 100％甲醇来终止反应。将检测样品施加到阴离子色谱柱(1ml Dowex，来自Aldrich)上，用1ml 100％甲醇洗涤。然后用闪烁计数器测量背景和柱洗涤物中的放射性量。通过计算药物处理反应中的放射性量，然后与对照样品(不含试验化合物的反应混合物)进行比较来确定PDE5抑制的程度。
2.B．环核苷酸测量另外，通过在与待筛选化合物接触的肿瘤细胞中cGMP的增加来反映化合物抑制PDE5的能力。用放射性免疫检测(RIA)，通过检测被处理细胞提取物中环GMP的量来确定PDE5的量。用该方法，将HT-29或SW-480细胞铺板，并使之生长至汇合。然后将试验化合物以约200μM-约200pM的浓度与细胞培养物一起保温。约24-48小时后，将细胞与培养基分开，然后溶解细胞。用0.2N HCl/50％MeOH终止反应。取样进行蛋白质检测。用阴离子交换色谱，如Dowex柱，从细胞的酸/醇提取物中纯化环GMP。按照公开的方法如用溶于三乙胺中的乙酸酐(Steiner,A.L.Parker,C.W.,Kipnis,D.M.,J.Biol.Chem.,247(4):1106-13,1971，该文献引入本文作为参考)干燥并乙酰化cGMP。用放射性免疫检测法(Harper,J.Brooker,G.,Advances in Nucleotide Research,10:1-33,1979，该文献引入本文作为参考)确定乙酰化cGMP的量。在存在抗血清和适宜缓冲液的条件下，将衍生的环GMP的碘化配体(酪氨酸甲酯)与标准或未知物一起保温。可用环核苷酸-半抗原指导的技术产生抗血清。抗血清来自用琥珀酰-cGMP-白蛋白结合物注射的羊，并以1/20,000稀释。如前述(Seibert,A.F.,Thompson,W.J.,Taylor,A.,Wibourn,W.H.,Bamard,J.and Haynes,J.,J.Applied Physiol.,72:389-395,1992，该文献引入本文作为参考)使用标准曲线进行剂量插入和误差分析。
另外，可将培养基酸化、冷冻(-70℃)并分析cGMP和cAMP。
除观察到由所需的试验化合物引起的cGMP含量的增加外，还观测到cAMP含量的降低。已观察到特别理想的化合物(即可在肿瘤细胞内选择性诱导细胞程序死亡，而在正常细胞内基本上无该作用的化合物)遵循与PDE5抑制相一致时间过程，该化合物最初的作用导致cGMP含量在数分钟内增加。其次，用理想的抗肿瘤化合物处理肿瘤细胞可导致cAMP含量在24小时内减少。对药物作用的细胞内靶正在进行进一步的研究，但目前的资料支持，cGMP含量最初的增加以及随后cAMP含量的降低均发生于与理想化合物接触的肿瘤细胞的细胞程序死亡之前。
两种环核苷酸间比例的变化是评估试验化合物PDE5抑制活性的更精确的方法，而不是仅仅测量cGMP的绝对值、仅仅测定PDE5抑制作用、或仅仅测定cGMP的绝对值。在未用抗肿瘤化合物处理的肿瘤细胞中，cGMP含量/cAMP含量的比值为0.03-0.05(即300-500 fmol/mg蛋白质cGMP含量/6000-8000fmol/mg蛋白质cAMP含量)。在与合乎需要的抗肿瘤化合物接触后，由于环GMP最初的增加以及随后环AMP的降低，而使比率增加数倍(优选增加至少约3倍)。
具体地说，特别理想的化合物使处理过的肿瘤细胞内，最初的cGMP增加到大于约500fmol/mg蛋白质的cGMP水平。另外，特别理想的化合物使处理过的肿瘤细胞内，随后的cAMP含量降低到约4000fmol/mg蛋白质的水平。
为了测定环AMP的含量，使用与用于cGMP相似的放射性免疫检测技术。简单地说，用阴离子交换色谱从细胞的酸/醇提取物中纯化环核苷酸、按照公开的方法干燥、乙酰化所述的环核苷酸，然后用放射性免疫检测法定量分析。将衍生的环AMP和环GMP的碘化配体在存在特异抗血清和适宜缓冲液的条件下与标准物或未知物保温。
通过测定完整细胞中环核苷酸的更新或积累可确定环核苷酸的含量。为了测量完整细胞中的cAMP，按照公开的方法(Whalin M.E.,R.L.Garrett Jr.,W.J.Thompson,and S.J.Strada,“Correlation of cell-free braincyclic nucleotide phosphodiesterase activities to cyclic AMP decay in intactbrain slices”,Sec.Mess.and Phos.Protein Research,12:311-325,1989，该文献引入本文作为参考)使用3H-腺苷预标记。该方法测量被标记的ATP到环AMP的流量，并根据具体的方法，可用其估算完整细胞腺苷酸环化酶或环核苷酸磷酸二酯酶的活性。按照公开的方法(Reynolds,P.E.,S.J.Strada and W.J.Thompson,“Cyclic GMP Accumulation in pulmonarymicrovascular endothelial cells measured by intact cell prelabeling,”LifeSci.,60:909-918,1997，该文献引入本文作为参考)，采用完整细胞预标记，环GMP积累量太低而无法研究。
2.C．组织样品检测还可测定组织样品中试验化合物的PDE5抑制活性。从与试验化合物接触的主体中收集组织样品，如哺乳动物(优选大鼠)肝。简言之，在500μl 6％TCA中将组织样品匀浆。取出已知量的匀浆物进行蛋白质分析。将剩余的匀浆物在冰上放置20分钟以使蛋白质沉淀。接着在4℃，将匀浆物以15,000g离心30分钟。回收上清液，除去沉淀。用5倍体积的水饱和的乙醚将上清液洗涤4次。在每次洗涤前弃去上层醚层。在speed真空器中干燥含水醚提取物。干燥后，将样品冷冻以备进一步使用，或立即使用。将干燥的提取物溶解在500μl检测缓冲液中。用酶免疫检测(EIA)，如Biotrak EIA系统乙酰化方法(可从Amersham,ArlingtonHeights,IL,USA得到)，通过检测环核苷酸的量来测定PDE5抑制的量。另外，也可采用上文详述过的RIA方法。
2.D．分析结果通过比较在存在和不存在试验化合物的条件下PDE5的活性来确定抑制量。PDE5活性的抑制表明所述化合物可用于治疗肿瘤。在浓度为10μM或该浓度以下，抑制活性明显大于基准exisulind的，优选大于50％的显著抑制活性表明应进一步评估所述化合物是否有抗肿瘤特性。优选PDE5的IC50值应小于50μM，这样就可以进一步考虑所述化合物的潜在用途。
3．确定化合物是否可减少肿瘤细胞的数量在另一实施方案中，本发明的筛选方法还包括确定所述化合物是否可降低肿瘤细胞的生长。根据所试验的组织，可使用各种细胞系。例如这些细胞系包括SW-480-结肠腺癌；HT-29-结肠腺癌；A-427-肺腺癌；MCF-7-乳腺癌；和UACC-375-黑素瘤系；以及DU145-前列腺癌。用这些细胞系得到的细胞毒性数据表明了对肿瘤损伤的抑制作用。这些细胞系的特征是非常清楚的，而且美国国家癌症研究所将这些细胞系用于新的抗癌药物的筛选。
3A．在HT-29细胞系中的肿瘤抑制作用可用从ATCC(Bethesda,MD)得到的HT-29人结肠癌细胞系测量化合物抑制肿瘤细胞生长的能力。已将HT-29细胞表征为相关结肠肿瘤细胞培养物模型(Fogh,J.,and Trempe,G.In:Human Tumor Cells in Vitro,J.Fogh(eds.),Plenum Press,New York,pp.115-159,1975)。在95％空气和5％CO2的湿润空气下,将HT-29细胞保持在补加有5％胎牛血清(GeminiBioproducts,Inc.,Carlsbad,CA)和2mM谷胺酰胺以及1％抗菌病-抗生素的RPMI培养基中。总之，将HT-29细胞以500细胞/孔的密度铺在96孔微滴定板中，在加入化合物前于37℃保温24小时。每次确定细胞数用6个重复。培养6天后，通过加入冷的三氯乙酸至10％的终浓度来固定细胞，然后按照Skehan,P.,Soreng,R.,Scudiero,D.,Monks,A.,McMahon,J.,Vistica,D.,Warren,J.T.,Bokesch,H.,Kenney,S.,and Boyd,M.R.,“New Colorimetric Assay For Anticancer-Drug Screening,”J.Natl.Cancer Inst.82:1107-1112,1990(该文献引入本文作为参考)所述，用sulforhodamine B(SRB)比色蛋白质斑检测法测量蛋白质水平。
除SRB检测法外，也可用其它许多方法测量生长抑制并可用其代替SRB检测法。这些方法包括在锥虫蓝染色后计数活细胞、用BrdU或放射性标记的胸苷对能够进行DNA合成的细胞进行标记、活细胞的中性红染色、或活细胞的MTT染色。
3.B．分析结果在100μM或更低剂量下大于50％的显著的肿瘤细胞生长抑制表明所述化合物可用于治疗肿瘤损伤。优选确定IC50值并用于比较。该值等于所需药物相对于对照对肿瘤细胞生长的抑制达到50％的浓度。优选IC50值应小与100μM，这样就可进一步考虑该化合物可能可用于治疗肿瘤损伤。
4．确定化合物是否诱导细胞程序死亡在第二种实施方案中，本发明的筛选方法还包括确定所述化合物是否可诱导肿瘤细胞培养物的细胞程序死亡。
可通过以形态学和生物化学标准来描述两种不同的细胞死亡坏死和细胞程序死亡。坏死伴随有胞质膜通透性的增加；细胞膨胀以及质膜在数分钟内破裂。细胞程序死亡的特征是膜起泡、胞质浓缩以及内源核酸内切酶激活。
其中，细胞程序死亡是真核细胞死亡的最常见形式。它天然发生在组织更新和器官和四肢的胚胎发育过程中。通过细胞毒T淋巴细胞和中性杀伤细胞、离子化照射和特定的化疗药物也可诱导细胞程序死亡。人们认为不适当的细胞程序死亡调节在包括癌症、AIDS、老年性痴呆等的许多病理学疾病中起了重要作用。可用在上述条件下保持的肿瘤细胞培养物筛选诱导细胞程序死亡的化合物。用试验化合物进行的细胞处理包括汇合前或汇合后的培养，并以不同浓度处理2至7天。在培养物的粘附和“飘浮”区中，均测量细胞程序死亡的细胞。通过除去上清液、胰蛋白酶消化粘附的细胞并在离心洗涤步骤(10分钟，2000rpm)后合并这两种制备物来集合上述的两种区。在文献中已描述了用舒林酸和相关化合物处理肿瘤细胞培养物以达到显著量细胞程序死亡的方法。(参见Piazza,GA.,et al.,Cancer Research,55:3110-16,1995，该文献引入本文作为参考)。新的特征包括收集飘浮的和粘附的细胞，确定最佳处理时间和观察到细胞程序死亡的剂量范围，确定最佳细胞培养条件。
4.A．细胞程序死亡的形态学观察用试验化合物处理后，在用吖啶橙和溴化乙锭标记后，通过荧光显微镜检测培养物的细胞程序死亡和坏死情况。已由Duke&Cohen(“Morphological And Biochemical Assays Of Apoptosis,”CurrentProtocols In Immunology,Coligan et al.,eds.,3.17.1-3.17-16,1992，该文献引入本文作为参考)描述了测量细胞程序死亡细胞数的方法。
例如可通过胰蛋白酶消化和用PBS洗涤3次来收集飘浮的和粘附的细胞。可将细胞样品等份离心。将沉淀重悬在培养基和含用PBS制备的吖啶橙和溴化乙锭的染料混合物中，然后缓慢混合。然后可将所述混合物置于显徽镜载玻片上并观察之。
4.B．通过DNA片段化分析细胞程序死亡通过测量已用试验化合物处理的细胞中，DNA片段化的增加来定量测量细胞程序死亡。测光的EIA(Cell Death Detection ELISAokys,Cat.No,1,774,425,Boehringer Mannheim)是可购买到的，其用于体外定量确定胞质组蛋白相关-DNA-片段(单和寡聚核小体)。Boehringer Mannheim检测法是基于分别使用小鼠抗DNA和组蛋白单克隆抗体的夹心酶免疫检测原理。这样可以特异性地确定细胞溶解产物中胞质部分的单和寡聚核小体。
按照制造商的说明，用下列方法测量细胞程序死亡。将样品(细胞溶解产物)放在链霉亲和素包被的微滴定板(MTP)中。随后，加入抗-组蛋白-生物素和抗DNA过氧化物酶结合物的化合物，保温2小时。在保温过程中，抗组蛋白抗体与核小体的组蛋白组分结合，同时经其生物素化，将免疫复合物固定在链霉亲和素包被的MTP上。另外，抗-DNA过氧化物酶抗体与核小体的DNA组分发生反应。通过洗涤步骤除去未结合的抗体后，通过在免疫复合物中保留的过氧化物酶来确定核小体的量。用ABTS7(2,2’-叠氮基-[3-乙基苯并噻唑烷-磺酸酯])作为底物进行光测定以确定过氧化物酶。
例如，将SW-480结肠腺癌以10,000细胞/孔的密度铺在96孔MTP上。然后用试验化合物处理细胞，然后在37℃保温48小时。保温后，离心MTP，除去上清液。然后将各孔中的细胞沉淀重悬在溶解缓冲液中30分钟。然后将溶解产物离心，然后将上清液等份(即胞质部分)转移到链霉亲和素包被的MTP中。小心不要振荡在MTP中溶解的沉淀(即含高分子量的、未片段化的DNA的细胞核)。然后分析样品。
在给定的浓度确定各试验化合物的刺激倍数(FS=ODmax/ODveh)，作为细胞程序死亡反应的标志。也可通过评估试验化合物的一系列浓度来确定EC50值。
4.C．分析结果细胞程序死亡的统计学显著增加(即在100μM的浓度下大于2倍的刺激)是化合物可用于治疗肿瘤损伤的另一标志。对于需进一步评估的有可能用于治疗肿瘤损伤的化合物而言，优选其细胞程序死亡活性的EC50应小于100μM。本文将EC50定义为相对于载体处理，对细胞程序死亡的诱导达到50％的浓度。
5 证实-乳腺器官培养模型试验可通过在乳腺器官培养系统中检测用上述方法筛选出的试验化合物抑制前肿瘤损伤发病率的能力，来测试所述化合物的抗肿瘤活性。其他研究人员已将该小鼠乳腺器官培养技术成功地用于研究已知的抗肿瘤剂如NSAID、维生物A类物质、他莫昔芬、硒和某些天然产物的效果，并且该技术可用于证实本发明的筛选方法。
例如，为体外诱导腺体对激素作出反应，可每日联用雌二醇和黄体酮来治疗雌性BALB/c小鼠。杀死动物，麻醉切下胸乳腺，然后使之在补加有胰岛素、促乳素、氢化可的松和醛甾酮的生长培养基中培养10天。施用DMBA(7,12-二甲基苯并蒽)以诱导前期恶性损伤的形成。然后使完全发育的腺体得不到促乳素、氢化可的松和醛甾酮，导致腺体退化而不是前期恶性损伤。
将试验化合物溶解在DMSO中，然后加入用于培养期间的培养基中。在培养期结束时，用10％福尔马林固定腺体，用矾胭脂红染色，然后固定在载玻片上。形成乳腺损伤的发病率是带有乳腺损伤的腺体和不带损伤腺体间的比值。将用试验化合物处理的腺体的乳腺损伤的发病率于未处理腺体的进行比较。
通过将腺体的图象发射到数字盘上来定量测定乳腺损伤所占据的面积范围。将由腺体覆盖的面积画到盘上，作为100％面积。将由各未退化结构覆盖的空间也画在数字盘上，然后由计算机进行定量分析。
实验部分以各种方法对大量试验化合物进行了测试，以筛选其在肿瘤治疗中的潜在用途。这些试验的结果如下。下文将试验化合物用字母代码表示，所述字母所对应的化合物如下A-外消旋-苏-(E)-1-(N,N’-二乙基氨基乙硫基)-1-(丁-1’,4’-交酯基(olido))-[3’,4’:1,2]-6-氟-2-甲基-3-(对甲基磺酰基亚苄基)-2,3-二氢化茚；B-(Z)-5-氟-2-甲基-1-(3,4,5-三甲氧基亚苄基)-3-乙酸；C-(Z)-5-氟-2-甲基-1-(对氯亚苄基)-3-乙酸；D-外消旋-(E)-1-(丁-1’,4’-交酯基)-[3’,4’:1,2]-6-氟-2-甲基-3-(对甲基磺酰基亚苄基)-1S-2,3-二氢化茚基-N-乙酰半胱氨酸；E-(Z)-5-氟-2-甲基-1-(3,4,5-三甲氧基亚苄基)-3-茚基-N-苄基乙酰胺；F-(Z)-5-氟-2-甲基-1-(对甲基磺酰基亚苄基)-3-茚基-N,N’-二环己基乙酰胺；G-ribo-(E)-1-三唑并-[2’,3’:1＂,3＂]-1-(丁-1’,4’-交酯基)-[3’,4’:1,2]-6-氟-2-甲基-3-(对甲基磺酰基亚苄基)-2,3-二氢化茚；和H-外消旋-(E)-1-(丁-1’,4’-交酯基)-[3’,4’:1,2]-6-氟-2-甲基-3-(对甲基磺酰基亚苄基)-1S-2,3-二氢化茚基-谷胱甘肽。实施例1-COX抑制作用分析按照上文1.B．部分关于COX分析的方法分析参考化合物和试验化合物的COX抑制活性。图1表明各种浓度的舒林酸硫化物或exisulind对纯化的环加氧酶(1型)活性的影响。如前所述用从公羊精囊中纯化的环加氧酶测定环加氧酶活性(Mitchell等，见上文)。计算得出舒林酸硫化物的IC-50值为约1.76μM，而exisulind的IC-50值大于10000μM。这些数据表明，舒林酸硫化物是COX抑制剂而exisulind则不是。使用COX-2同工酶得到了相似的数据。(Thompson等，Journal of the NationalCancer Institute,87；1259-1260,1995)。
图2说明试验化合物B和E对COX的抑制作用。按照图1所用方法，测试化合物的COX活性。数据表明，试验化合物B和E均不能显著抑制COX-Ⅰ。
表1一系列化合物的环加氧酶抑制活性参考化合物100μM下的抑制％吲哚美辛 95MY5445 94舒林酸硫化物 97Exisulind ＜25试验化合物 100μM下的抑制％A＜25B＜25C 87D＜25E＜25按照上文1.B．部分的方法，评估化合物A-E的COX抑制活性，结果如上表1所示。发现化合物C在100μM下对COX的抑制大于25％，因此，不对其进行进一步的筛选。实施例2-PDE5抑制作用分析按照上文2.A．部分的检测方法分析参考化合物和试验化合物的PDE5抑制活性。图3表明各种浓度的舒林酸硫化物或exisulind对PDE-4或PDE5活性的影响，如前所述，所述PDE-4或PDE5从人结肠HT-29培养的肿瘤细胞纯化而得(W.J.Thompson等，见上文)。舒林酸硫化物抑制PDE4的IC50值为41μM，抑制PDE5的IC50值为17μM。exisulind抑制PDE4的IC50值为181μM，抑制PDE5的IC50值为56μM。这些数据表明，舒林酸硫化物是和exisulind均抑制磷酸二酯酶活性。两种化合物均对PDE5同工酶具有选择性。
图4表明按照上文2.B．的检测方法，用培养的HT-29细胞测定的舒林酸硫化物对cGMP或cAMP生产的影响。将HT-29细胞用舒林酸硫化物处30分钟，然后通过常规的放射免疫分析方法测定cGMP或cAMP。结果表明，舒林酸硫化物使cGMP的水平增加50％以上，其EC50值为7.3μM(上方)。cAMP的水平不受处理的影响，而已知的PDE4抑制剂咯利普兰可以增加cAMP(下方)。这些数据证明了相对于PDE4而言抑制PDE5的药理学显著性。
图5说明所示剂量的试验化合物B对磷酸二酯酶的PDE5或PDE4同工酶的影响。计算出的IC50值对于PDE5而言为18μM，对于PDE4而言为58μM。
图6说明所示剂量的试验化合物E对磷酸二酯酶的PDE4或PDE5的影响。计算出的IC50值对于PDE5而言为0.08μM，对于PDE4而言大于25μM。
表2一系列化合物的PDE5抑制活性参考化合物 10μM下的抑制％吲哚美辛 34MY544586舒林酸硫化物 97Exisulind 39试验化合物10μM下的抑制％A ＜25B ＜25C ＜25D36E75按照上文2.A．部分的方法，评估上述表2中化合物的PDE抑制活性。在不抑制COX的化合物中，发现仅化合物E在10μM的浓度下引起50％以上的抑制。如图11所示，化合物B在20μM的剂量下表现出50％以上的抑制作用。因此，根据单一剂量试验中所用的剂量水平，可能会筛除某些在稍高剂量下具有活性的化合物。所用的剂量是主观的，当在某剂量水平下发现活性化合物后，可降低剂量以鉴定更有效的化合物。实施例3-细胞程序死亡分析按照上文4.A．和4.B．部分的检测方法，分析参考化合物和试验化合物的PDE5抑制活性。根据4.A．的检测方法，图7表明舒林酸硫化物和exisulind对细胞程序死亡和坏死性细胞死亡的影响。将HT-29细胞用所示剂量的舒林酸硫化物或exisulind处理6天。先前曾测定过细胞程序死亡和坏死性细胞死亡(Duke and Cohen,Current Protocols in Immunology,3.17.1-3.17.16,New York,John Wiley and Sons,1992)。数据表明，舒林酸硫化物和exisulind均可以诱导细胞程序死亡而不引起坏死。所有数据均来自同一试验。
根据4.B．的检测方法，图8表明舒林酸硫化物和砜对肿瘤生长抑制和细胞程序死亡诱导的影响(后者通过DNA片段化进行测定)。上图exisulind的生长抑制(空心符号，右轴)和DNA片段化(实心符号，左轴)。下图舒林酸硫化物的生长抑制(空心符号)和DNA片段化(实心符号)。生长抑制通过处理6天后的SRB检测进行确定。DNA片段化在处理48小时后测定。所有数据均来自同一试验。
图9表明化合物E诱导细胞程序死亡的特性。将HT-29结肠腺癌细胞用所示浓度的化合物E处理48小时，然后通过DNA片段化分析测定细胞程序死亡。计算出的EC50值为0.05μM。
图10表明化合物B诱导细胞程序死亡的特性。将HT-29结肠腺癌细胞用所示浓度的化合物B处理48小时，然后通过DNA片段化分析测定细胞程序死亡。计算出的EC50值为175μM。
表3一系列化合物诱导细胞程序死亡的活性参考化合物 100μM下的诱导倍数吲哚美辛＜2.0MY5445 4.7舒林酸硫化物7.9Exisulind＜2.0试验化合物 100μM下的诱导倍数A＜2.0B 3.4C 5.6D＜2.0E 4.6按照上文4.B．部分的方法，评估化合物A-E诱导细胞程序死亡的活性，结果如上表3所列。化合物B、C和E在100μM的剂量下表现出显著的诱导细胞程序死亡的活性，大于2.0倍。在这三种化合物中，在该剂量下仅有B和E不抑制COX而抑制PDE5。
测定了一系列磷酸二酯酶抑制剂诱导细胞程序死亡的活性。数据如下表4所示。将HT-29细胞用各种磷酸二酯酶抑制剂处理6天。按照上文4.A.部分的检测方法用吖啶橙和溴乙啶标记后，按形态学标准测定细胞程序死亡和坏死。数据表明，PDE5对于筛选可诱导HT-29细胞发生细胞程序死亡的化合物是有用的。
表4PDE抑制剂诱导细胞程序死亡的数据抑制剂报道过的选择性 细胞程序死亡％ 坏死％载体 8 68-甲氧基-IBMX PDE1 2 1米力农PDE3 18 0RO-20-1724PDE4 11 2MY5445PDE5 80 5IBMX 无选择性 413实施例4-生长抑制分析按照上文3.A．的检测方法分析参考化合物和试验化合物的PDE5抑制活性。图11表明各种浓度的舒林酸硫化物和exisulind对HT-29细胞的生长抑制作用。如图所示，将HT-29细胞用各种剂量的exisulind(三角)或硫化物(方块)处理6天。通过上述的sulforhodamine检测方法(Piazza等，癌症研究，55:3110-3116,1995)测定细胞数量。硫化物的IC50值为约45μM，砜的IC50值为200μM。这些数据表明，舒林酸硫化物和exisulind均能够抑制肿瘤细胞的生长。
图12说明舒林酸硫化物的生长抑制和诱导细胞程序死亡的活性。所示的时间进程试验包括将HT-29细胞用载体、0.1％DMSO(空心符号)或用舒林酸硫化物、120μM(实心符号)处理。通过锥虫蓝染色后计数活细胞来测定生长抑制(上图)。通过用吖啶橙和溴乙啶按照上述方法(Dukeand Cohen,Current Protocols in Immunlogoy,3.17.1-3.17.16,New York,John Wiley and Sons,1992)染色后进行形态学鉴定来测定细胞程序死亡(下图)。数据表明，舒林酸硫化物可以抑制肿瘤细胞生长，并且该作用伴有细胞程序死亡的增加。所有数据均来自同一试验。
图13表明试验化合物E的生长抑制活性。将HT-29结肠腺癌细胞用所示浓度的化合物E处理6天，然后通过SRB检测来确定细胞数量。计算出的IC50值为0.04μM。
表5一系列化合物的生长抑制活性参考化合物 100μM下的抑制％吲哚美辛 75MY544588舒林酸硫化物 88Exisulind ＜50试验化合物 100μM下的抑制％A 68B 77C 80D 78E 62按照上文3.A部分的筛选方法，检测化合物A-E的生长抑制活性，结果如上表5所示。所有试验化合物均在100μM的单一剂量试验中表现出超过基准exisulind的活性。
测定了一系列磷酸二酯酶抑制剂的生长抑制活性。数据如下表6所示。将HT-29细胞用各种磷酸二酯酶抑制剂处理6天。按照上文3.A．部分通过SRB检测方法测定细胞生长。数据表明，PDE5的抑制剂可有效地抑制肿瘤细胞生长。
表6PDE抑制剂的生长抑制数据抑制剂 报道过的选择性 生长抑制作用(IC50,μM)8-甲氧基-IBMX PDE1 ＞200μM米力农PDE3 ＞200μMRO-20-1724 PDE4 ＞200μMMY5445 PDE5 5μMIBMX无选择性 ＞100μM为了说明该筛选方法对各种形式肿瘤的效果，用大量细胞系对化合物进行试验。确定舒林酸硫化物和exisulind对各种细胞系的作用。在下列表7中列出了数据。用SRB检测法确定IC50值。数据表明这些化合物对许多肿瘤有广泛的作用，它们在可比的剂量范围内有效。因此，由本发明鉴定的化合物应该可以应用于治疗多种形式的肿瘤。
表7各种细胞系的生长抑制数据
实施例5-在乳腺器官培养模型中的活性图14说明舒林酸代谢物在乳腺器官培养中，对前期恶性损伤的抑制作用。按照前述(Mehta and Moon,Cancer Research,46:5832-5835,1996)完成乳腺器官培养试验。结果表明舒林酸和exisulind可有效地抑制前期恶性损伤的形成，而舒林酸硫化物却无效。所述数据支持下列假设，即对环加氧酶的抑制作用对于所需化合物的抗肿瘤特性不是必需的。
分析为了确定可用于治疗肿瘤的化合物，本发明提供了用于比较几种方法的试验化合物的试验数据的基本原理。在本发明范围内，可按照其用于治疗人肿瘤的潜在用途将试验化合物进行分类。筛选出具有所需效果的那些化合物，以进行更费时费力的动物研究，这是在得到许可开始人临床试验前必须进行的。
下列表8中列出了各种试验化合物和数种方法的定性数据。这些数据表明，exisulind、化合物B和化合物E具有适宜的活性，通过了下列4种检测COX抑制作用缺乏、PDE抑制作用、生长抑制作用和细胞程序死亡诱导作用。这些化合物在乳腺器官培养物中的活性证实了本发明的效果。筛选方法的定性评估结果为，将化合物E列为最好、然后依次是化合物B和exisulind。
表8 各种化合物的活性图谱
表8的符号化合物的活性是基于涉及最大活性和效力的一系列试验的评估。
-无活性+弱活性++中等活性+++强活性++++前所未有的最大活性显然，参照上述教导，对本发明做出许多修改和改变是可能的。因此，应理解为在所附权利要求的范围内，用本文具体描述以外的方法也可实施本发明。
权利要求
1．具有治疗肿瘤可能性的化合物的鉴定方法，包括测定化合物对环加氧酶(COX)的抑制活性；和测定化合物对PDE5的抑制活性；其中，低的COX抑制活性和高的PDE5抑制活性表明所述化合物具有治疗肿瘤的可能性。
2．权利要求1的方法，还包括测定化合物是否抑制培养液中的肿瘤细胞的生长；其中对肿瘤细胞生长的抑制进一步表明所述化合物具有治疗肿瘤的可能性。
3．权利要求1的方法，其中，化合物对COX的抑制活性通过如下方法测定将化合物与纯化的环加氧酶接触；然后测定环加氧酶的活性的变化，如果有变化的话；其中，在约100μM的浓度下对COX的抑制活性低于25％，表明应对所述化合物治疗肿瘤的可能性进行进一步的评估。
4．权利要求1的方法，其中，化合物对COX的抑制活性通过如下方法测定将化合物与分泌PGE-2的细胞接触；然后测定细胞分泌出的PGE-2的减少，如果PGE-2的分泌量有减少的话；其中，PGE-2分泌的减少与前列腺素合成酶活性的降低有关。
5．权利要求1的方法，还包括测定化合物是否诱导肿瘤细胞的细胞程序死亡；其中，对细胞程序死亡的诱导进一步表明所述化合物具有治疗肿瘤的可能性。
6．权利要求5的方法，还包括测定化合物是否抑制样品中的肿瘤细胞的生长；其中，对肿瘤细胞生长的抑制进一步表明所述化合物可用于治疗肿瘤。
7．权利要求5的方法，其中，PDE的活性通过如下方法测定将化合物与细胞培养液接触；然后测定细胞内的环GMP浓度；其中，在10μM的浓度下对PDE的抑制活性高于50％，表明应对所述化合物治疗肿瘤的可能性进行进一步的评估。
8．权利要求5的方法，其中，PDE的活性通过如下方法测定测定细胞内环GMP/环APM浓度的比；其中，在10μM的浓度下上述比例增加3倍，表明应对所述化合物治疗肿瘤的可能性进行进一步的评估。
9．权利要求5的方法，其中，细胞程序死亡通过如下方法测定将化合物与细胞培养液接触；然后测定化合物是否使胞质中片段化的DNA含量增高；其中，在100μM的浓度下细胞程序死亡增加2倍以上，表明应对所述化合物治疗肿瘤的可能性进行进一步的评估。
10．可能用于治疗肿瘤的化合物的筛选方法，包括测定化合物的生长抑制活性；测定化合物的PDE5抑制活性；然后筛选出具有生长抑制活性和PDE5抑制活性的化合物。
11．权利要求10的方法，还包括鉴定其生长抑制活性的IC50值低于约100μM的可用于治疗肿瘤的化合物。
12．权利要求10的方法，还包括测定化合物是否诱导细胞的细胞程序死亡；然后筛选出诱导细胞程序死亡的化合物。
13．权利要求12的方法，还包括筛选出其细胞程序死亡活性的EC50值低于约100μM的化合物。
14．权利要求10的方法，还包括测定化合物的COX抑制活性；筛选出相对于PDE5抑制活性，COX抑制活性低的化合物。
15．权利要求14的方法，其中，化合物的COX抑制活性通过如下方法测定将化合物与环加氧酶接触；然后测定环加氧酶的活性的变化，如果有变化的话；其中，环加氧酶活性的降低与前列腺素合成酶活性的降低有关。
16．权利要求14的方法，其中，化合物的COX抑制活性通过如下方法测定将化合物与分泌PGE-2的细胞接触；然后测定细胞分泌出的PGE-2的减少，如果PEG-2的分泌量有减少的话；其中，PGE-2分泌的减少与前列腺素合成酶活性的降低有关。
17．鉴定化合物的方法，所述化合物可用于向需要对肿瘤进行预防性和慢性治疗的患者给药，该方法包括如下步骤测定化合物对环加氧酶(COX)的抑制活性；测定化合物对PDE5的抑制活性；如果化合物表现出PDE5抑制活性，鉴定可用于患者以治疗肿瘤的这些化合物。
18．权利要求17的方法，其中对化合物抑制PDE5同工酶的选择性进行测定。
19．权利要求17的方法，还包括测定化合物的生长抑制活性；然后，鉴定在表现出基本生长抑制活性的浓度下，磷酸二酯酶的抑制活性基本上大于COX抑制活性的那些化合物。
20．权利要求19的方法，其中，生长抑制活性通过样品中细胞数量的减少进行测定。
21．权利要求17的方法，其中，生长抑制活性通过样品中细胞程序死亡的诱导水平进行测定。
22．权利要求17的方法，其中，如果诱导细胞程序死亡的水平基本上大于诱导坏死的水平，则进一步鉴定可用于患者以治疗肿瘤的化合物。
23．具有治疗肿瘤可能性的化合物的筛选方法，包括测定化合物的PDE5抑制活性并筛选出其抑制活性大于预定值的化合物。
24．权利要求23的方法，还包括测定所筛选出的化合物是否诱导细胞的细胞程序死亡，并进一步筛选出其细胞程序死亡的诱导活性大于预定值的化合物。
25．权利要求24的方法，还包括测定所筛选出的化合物是否抑制前列腺素合成，并进一步筛选出其抑制活性低于预定值的化合物。
26．权利要求24的方法，其中，PDE5活性的测定是通过测定细胞内的环GMP和环AMP，并测定环GMP与环AMP的比是否增加而进行的。
27．具有治疗肿瘤可能性的化合物的鉴定方法，包括测定化合物对COX-Ⅰ的抑制活性；测定化合物对PDE5的抑制活性；其中，低的COX-Ⅰ抑制活性和高的PDE5抑制活性表明所述化合物具有治疗肿瘤的可能性。
28．具有治疗肿瘤可能性的化合物的鉴定方法，包括将肿瘤细胞用浓度为约200μM-200pM的待评估化合物进行处理；测定被处理细胞的细胞内cGMP含量；测定被处理细胞的细胞内cAMP含量；其中，被处理细胞的cGMP/cAMP的比值比未经处理的肿瘤细胞的cGMP/cAMP增加约3倍或3倍以上，表明所述化合物具有治疗肿瘤的可能性。
29．权利要求28的方法，其中被处理细胞的细胞内cGMP含量大于500fmol/mg蛋白，表明所述化合物具有治疗肿瘤的可能性。
30．权利要求28的方法，其中被处理细胞的细胞内cAMP含量低于4000fmol/mg蛋白，表明所述化合物具有治疗肿瘤的可能性。
31．权利要求30的方法，其中被处理细胞的细胞内cAMP含量低于4000fmol/mg蛋白，表明所述化合物具有治疗肿瘤的可能性。
32．潜在地可用于治疗肿瘤的化合物的筛选方法，包括将化合物的生长抑制活性与化合物的PDE5抑制活性进行比较；然后筛选出具有生长抑制活性和PDE5抑制活性的化合物。
全文摘要
本发明提供鉴定可用于治疗哺乳动物肿瘤的化合物的方法。测定化合物的磷酸二酯酶抑制活性和COX抑制活性。还测定对培养的肿瘤细胞的生长抑制作用和诱导细胞程序死亡的作用。具有磷酸二酯酶抑制活性、生长抑制活性和细胞程序死亡诱导活性但基本没有前列腺素抑制活性的化合物是治疗肿瘤的理想化合物。
文档编号G01N33/50GK1224761SQ9810204
公开日1999年8月4日 申请日期1998年6月1日 优先权日1997年5月30日
发明者里佛特·帕穆克库, 加里·A·皮亚扎, W·约瑟夫·汤普森 申请人:细胞途径公司