专利名称：大片段脱氧核糖核酸芯片及其制造方法
技术领域：
本发明涉及一种用于生命信息储存和处理的DNA(脱氧核糖核酸)芯片(DNAchip)的结构改进及其制造方法，具体地说，是一种将10K～200K核苷酸对、天然的、已知其在生物体基因组的物理图谱上的精确位置的DNA片段固化在一基底(硅片、玻璃或云母片)上的DNA芯片。
20世纪90年代中期，美国Affymatrix公司等发明的高密度DNA芯片(DNAchip)，即又称基因芯片(Gene chip)，它是寡聚核苷酸(Oligonucleotide)探针的高密度阵列，是在一基底上人工合成小片段DNA芯片，参见美国第5,445,934号专利，这一类DNA芯片以玻璃或硅片为基底，将约1平方厘米的基底划分为成千上万个方格，然后覆盖一层光敏基团。在选定的方格内，进行光照后去掉光敏感基团对此点的保护，然后加上带有相同光敏基团的核苷酸进行在位合成；重复以上操作，即可任意定位合成所需的寡聚核苷酸系列直至制成整个芯片。参见美国第5,571639号专利，核苷酸阵列的制作也可利用计算机的参与来完成。由此可见，上述专利所公开的技术方案，其优点是可合成高密度的寡聚核苷酸(小片段DNA，或称DNA探针)阵列，例如，已达到40万种阵列芯片，可以最大程度地体现平行处理的原则，因此，它获得的信息也很丰富。但是，它也有其不足之处，概述如下1.生物体基因组中存在着大量的重复序列，且每个基因均由成千上万个核苷酸对组成，而作为小片段DNA芯片中每一组成单元DNA探针，其所含核苷酸对小于20个，因此，用它去探测一个基因则可能导致误差；2.由于芯片中相邻小片段DNA之间没有足够的间隔空间，因此，无法进行拉直分子操纵，难以对DNA探测作出精确定位；3.使用小片段DNA探针，无法寻找完整的新基因，科学实验已表明，通过信使核糖核酸(mRNA)及其互补DNA(cDNA，即基因中表达为蛋白质的那部分DNA序列)确实可找到DNA的表达区，但将这一段基因插入质粒(一种载体DNA)载体，再转移至大肠杆菌中，但并不一定能表达，非得把与该基因相关的非表达区域一起转移才能表达，因此寻找完整的新DNA不能简单地从mRNA出发，必须从天然的大片段DNA链中去找。
4.某一基因的突变，往往会影响几个基因，这就是许多常见病或癌症与多基因相关的道理，因此，必须从基因组的观念上从整体上去研究，已有的小片段DNA芯片无法胜任。
本发明的目的是提供一种大片段DNA芯片及制造方法，系将含有10K～200K核苷酸对天然片段DNA固化在一基底上，形成大片段DNA芯片。
本发明的另一目的是提供一种可使DNA分子拉直操纵的大片段DNA芯片。
根据本发明大片段DNA芯片的制作方法，其步骤包括a.芯片基底的表面处理将玻璃或云母或云母片表面用1％的3-氨基丙基硅烷(APS)水溶液处理活化，b.将光生物素(PHOTOBIOTIN)试剂均匀覆盖上述经处理的基底表面，c.芯片基底的表面生物素化取经过表面活化的基底(2×2平方厘米)，在基底中间区利用虚线状结构的掩膜(MASK)作光刻曝光处理，定位在大小为2微米×25微米的单元内将芯片基底生物素化，随后清洗掉未曝光区间的光生物素，同一行单元之间的距离为25微米；每行共200个单元，行间距为100微米，共100行，整个芯片上共有100×200个单元；每个单元地址以AB来标记，其中A为行数，B为列数，d.加入抗生物素蛋白(AVIDIN)和末端带有生物素的大片段DNA；用自动高速微量点滴仪器在芯片的已经结合生物素的单元上与浓度为1纳克/微升、末端共价结合生物素的大片段DNA以及抗生物素蛋白相互作用20分钟，采用“生物素—抗生物素蛋白—生物素—DNA”的方法固定DNA，e.重复步骤b～d，在芯片基底的每个单元固定不同的大片段DNA，f.用水清洗芯片，至此，完成了1型大片段DNA芯片的制作，g.分子操纵处理I型芯片经拉直操纵方法拉直其上的DNA，完成了II型大片段DNA芯片的制作。
按照本发明方法制成的大片段DNA芯片，包括基底和以阵列有序集成固接在其表面的片段DNA，其特征在于该每一片段DNA系为10Kb-200Kb的天然的大片段DNA，该大片段DNA的地址与细菌人工染色体库或酵母人工染色体库的地址存在确定的对应关系，在芯片中的大片段DNA阵列单元，其每一行上置设的大片段DNA形成一虚线结构，且相邻行上的大片段DNA位置成相交错布设，而同一列相邻单元之间的距离至少等于大片段DNA的分子拉直长度，并且DNA分拉直操纵系沿与该虚线垂直朝下方向。具体地说，本发明之大片段DNA芯片的面积为2×2平方厘米，其分成100×200个单元，每个单元为2微米×25微米，同一行单元之间的距离为25微米，每行共200个单元，行距为100微米，共100行，也即在每一平方厘米基底上固化2×104种大片段DNA，最后，还要指出，根据本发明对大片段DNA芯片的检测方法，系采用纳米显微术，包括采用原子力显微镜和扫描近场光学显微镜来探测大片段DNA芯片上的分子标记或荧光信号的分布及定量分析。
本发明与已有技术相比具有实质性的进步1.本发明大片段DNA芯片，其每一大片段DNA探针含10K-200K碱基对，而已有技术中的芯片DNA探针含＜20碱基，因此，大大扩展其应用范围及达到更高的层次，例如，可用于完整新DNA定位、寻找；用于单个核苷酸多态性位点(SNPS)系统搜索寻找和监视；用于DNA组遗传作图、DNA组物理图谱补缺，DNA测序有序化探索；2.在芯片的制造工艺上，除了喷墨法，点滴法外，特别是与DNA分子操纵相结合，经拉直操纵方法将芯片上的大片段DNA拉直，从而可作精确测量定位；3.制成的芯片可用荧光显微镜和能对大样品精确定位的纳米显微镜(原子力显微镜AFM、扫描近场光学显微镜SNOM系统)予以检测。
本发明的
如下图1是本发明的制造方法流程示意图。
图2是本发明的大片段DNA芯片结构示意图。
图3是本发明的大片段DNA芯片特定DNA阵列大小示意图。
图4是本发明的I型DNA芯片结构示意图，显示其未作DNA拉直操纵，其可由荧光信息定性显示单个核苷酸多态性(SNP)的分布情况。
图5是本发明的II型大片段DNA芯片中特定单元结构示意图。
图6是对本发明II型大片段DNA芯片自动大规模拉直的DNA的原子力显微镜照片，线条即为拉直的DNA。
图7是对本发明II型大片段DNA芯片带分子标记的拉直的DNA的原子力显微镜照片，DNA为线性的，其上的亮点为分子标记。
根据图1～图5给出本发明较好的实施例。
实施例一参阅图1，如图所示，本发明的大片段DNA芯片的制作方法，先提供表面极其平整的基底如硅片、玻璃或云母片进行硅烷化处理，并且用生物素进行处理，再根据生物素(Biotin)-抗生物素蛋白(Avidin)的强烈的专一性相互作用，在基底—生物素上接上抗生物素蛋白，将某个生物体DNA组(例如水稻的DNA组)的大片段DNA(10,000～200,000核苷酸对)末端也接上生物素，采用喷墨法或定位点滴的方法，将不同DNA片段有序地集成在基底上。
另又如图2、图3所示，本发明的大片段DNA芯片，每一DNA阵列大小为25微米×2微米，在1厘米×1厘米的芯片上，将有200×100个不同阵列，其上可固化20,000种不同的大片段DNA。
如图4所示，本发明之I型大片段DNA芯片，未作DNA拉直操纵，由荧光信息，可知单个核苷酸多态性(SNP)的分布情况，而本发明之II型大片段DNA芯片中的特定单元，例如地址(Add1)之特定单元，由原子力显微镜(AFM)成像和检测，如图5所示，精确测定了单个核苷酸多态性(SNP)的位置，依如下公式计算离端点的碱基对D＝d(微米)×K(碱基对/微米)，其中d-物理距离，D-碱基对(bps)数目，K-拉直系数，约等于2000。
本实施例的制作过程是
云母表面用1％的3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APS)水溶液处理3分钟，真空干燥。将每毫升10毫克的生物素-N-羟基丁二酰亚胺酯(BNHS)的二甲亚砜(DMF)与等体积每升0.2摩尔的碳酸氢钠(NaHCO3)水溶液的混合，取经APS处理的云母2平方厘米，在云母上利用点滴方法滴加上述混合溶液；20分钟后，用蒸馏水冲洗云母表面，再与每毫升1毫克的抗生物素蛋白水溶液相互作用20分钟，用蒸馏水冲洗；接着与浓度为每微升1纳克、末端共价结合生物素的DNA相互作用20分钟。将比较DNA样品和荧光标记的单个核苷酸多态性(SNP)酶与云母表面DNA相互作用，在荧光显微镜下，根据其荧光分布及强弱，可发现其单个核苷酸多态性(SNP)酶的分布，也即SNPS的分布情况。
实施例二云母表面用1％的3-氨基丙基硅烷(APS)水溶液处理3分钟，真空干燥。将每毫升10毫克的生物素-N-羟基丁二酰亚胺酯(BNHS)的二甲亚砜(DMF)与等体积每毫升0.2摩尔每升的碳酸氢酸氢钠(NaHCO3)水溶液的混合，取经APS处理的云母表面，在云母上利用点滴方法滴加上述混合溶液。20分钟后，用蒸馏水冲洗云母表面，再与每毫升1毫克的抗生物素蛋白水溶液相互作用20分钟，用蒸馏水冲洗；接着与浓度为每微升1纳克、末端共价结合生物素的DNA相互作用20分钟。用水冲洗，然后经“动态分子梳”方法拉直在云母片上的DNA。将比较DNA样品和荧光标记的单个核苷酸多态性(SNP)酶与云母表面上拉直的DNA相互作用，然后经原子力显微镜成像，并精确测定单个核苷酸多态性(SNP)酶在拉直的DNA链上离DNA末端固定点的距离。
实施例三1.云母表面用1％的3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APS)水溶液处理活化。光生物素(PHOTOBIOTIN)试剂均匀皙盖上述经处理的云母表面。
2.然后进行有序化分区，整个1×1平方厘米的云母上共分100×200个单元；同一行单元之间的距离为25微米，每行共200个单元；行间距为100微米，共100行。每个单元的地址以AB来标记，其中A为行数，B为列数。
3.取上述经过表面活化并分区的云母，利用虚线状结构的掩膜(MASK)作光刻曝光处理，定位地在大小为2微米×25微米的单元内将芯片基底生物素化。随后清洗掉未曝光区的光生物素。
4.加入抗生物素蛋白(AVIDIN)和末端带有生物素的大片段DNA用自动高速微量点滴仪器在芯片的已经结合生物素的单元(即已经与光生物素相互作用的单元)上与浓度为1纳克/微升、末端共价结合生物素的大片段DNA以及抗生物素蛋白相互作用20分钟，采用“生物素—抗生物素蛋白—生物素—DNA”的方法固定DNA；5.重复2-4步骤，从而使芯片的每个单元均固定上不同的大片段DNA。这些DNA可以来自细菌人工染色体(BAC)或酵母人工染色体(YAC)库，其在芯片上的位置按照AB的方式确定的，而每一个地址上的DNA均与其细菌人工染色体(BAC)或酵母人工染色体(YAC)库中的DNA有序地联系起来了；用水清洗芯片，并经拉直操纵方法拉直其上的DNA；将上述芯片与样品DNA、SNPS酶相互作用，利用原子力显微镜及扫描近场光学显微镜精确测定SNP位点。本实施例的结果如图6和图7所示。
权利要求
1.一种大片段DNA芯片的制作方法，其步骤包括a.基底表面处理将玻璃或云母或云母片表面用1％的3-氨基丙基硅烷水溶液处理活化，b.将光生物素试剂均匀覆盖上述经处理的基底表面，c.基底表面生物素化取经过表面活化的芯片在基底中间区利用虚线状结构的掩膜作光刻曝光处理，定位在大小为2微米×25微米的单元内将芯片基底生物素化，随后清洗掉未曝光区间的光生物素，同一行单元之间的距离为25微米；每行共200个单元，行间距为100微米，共100行，整个芯片上共有100×200个单元；每个单元地址以AB来标记，其中A为行数，B为列数，d.加入抗生物素蛋白和末端带有生物素的大片段DNA用自动高速微量点滴仪器在芯片的已经结合生物素的单元上与浓度为1纳克/微升、末端共价结合生物素的大片段DNA以及抗生物素蛋白相互作用20分钟，采用“生物素—抗生物素蛋白—生物素—DNA”的方法固定DNA，e.重复步骤b～d，在芯片的每个单元固定不同的大片段DNA，f.用水清洗芯片，至此，完成了1型大片段DNA芯片的制作。
2.根据权利要求1所述的大片段DNA芯片的制作方法，其特征在于还有分子操纵处理1型芯片经拉直操纵方法拉直其上的DNA，完成了II型大片段DNA芯片的制作。
3.按照权利要求1所述的大片段DNA芯片的制作方法制成的大片段DNA芯片，包括基底和以阵列有序集成固接在其表面的片段DNA，其特征在于该每一片段DNA系为10Kb-200Kb的天然的大片段DNA。
4.根据权利要求3所述的大片段DNA芯片，其特征在于芯片中的大片段DNA的地址与细菌人工染色体库或酵母人工染色体库的地址存在确定的对应关系。
5.根据权利要求3所述的大片段DNA芯片，其特征在于芯片中的大片段DNA阵列单元，其每一行上置设的大片段DNA形成一虚线结构，而相邻行上的大片段DNA位置成相交错布设。
6.根据权利要求5所述的大片段DNA芯片，其特征在于芯片中同一列相邻单元之间的距离至少等于大片段DNA的分子拉直长度。
7.根据权利要求6所述的大片段DNA芯片，其特征在于芯片中的大片段DNA分拉直操纵系沿与该虚线垂直朝下方向。
8.根据权利要求3所述的大片段DNA芯片，其特征在于芯片的面积为2×2平方厘米，其分成100×200个单元，每个单元为2微米×25微米，同一行单元之间的距离为25微米，每行共200个单元，行距为100微米，共100行。
9.根据权利要求8所述的大片段DNA芯片，其特征在于每一平方厘米基底上固化2×104种大片段DNA。
10.一种检测大片段DNA芯片的方法，采用纳米显微术，包括采用原子力显微镜和扫描近场光学显微镜来探测大片段DNA芯片上的分子标记或荧光信号的分布及定量分析。
全文摘要
一种大片段DNA芯片及其制造方法,其制作步骤主要是先对基底作硅烷化处理,再行生物素处理、和对基底上的生物素接抗生物素蛋白,并将某个生物体基因组的大片段DNA末端也接上生物素,采用喷墨法或定位点滴法将不同DNA片段有序地集成在基底上。本发明的DNA芯片,其每一片段DNA系为10K～200K核苷酸对,每一行上的DNA片段呈虚线状且相邻行上的DNA片段成交错布设,同一列上相邻单元的间隔空间为DNA分子操纵拉直空间。
文档编号G01N33/53GK1242430SQ9811096
公开日2000年1月26日 申请日期1998年7月17日 优先权日1998年7月17日
发明者李民乾, 胡钧, 欧阳振乾, 张益 , 徐元森, 郑养鉥, 赵建龙, 陈海宝 申请人:中国科学院上海原子核研究所, 中国科学院上海冶金研究所, 中国科学院上海有机化学研究所