专利名称：核酸的测定的制作方法
技术领域：
本发明涉及核酸的测定，具体地说涉及对核酸的性质或者参数的测定，或涉及通过化学或生物化学反应对核酸进行修饰的方法。特别是本发明涉及对溶液中核酸浓度的测定(定量)和对核酸分子的分子量测定(测定大小)。本发明也可应用于对核酸通过化学或生物化学修饰的反应的监控。
通常，DNA浓度是通过分光光度法测定的，这一方法依赖于DNA分子中核苷酸环结构对紫外线(约260nm)的特征吸收峰。为了测定分子量，通常将DNA分子通过琼脂糖凝胶电泳进行大小分离，然后使用溴化乙锭染料进行观察。DNA也可在琼脂凝胶上通过测量紫外线激发(约300nm)后产生的荧光并与已知的标准相比较进行定量。这两种方法均具有内在的缺点。紫外分光光度计是很贵重的仪器，需要使用贵重的石英杯并依赖较大体积样品的破坏性处理。使用溴化乙锭对DNA进行观察和定量，虽然价格较低廉，但由于其剧烈毒性和致癌性也不是所期望的。
本发明包括一种测定核酸材料的性质或参数的方法，或者包括一种通过化学或生物化学反应对核酸进行修饰的方法，所说的性质或参数是与核酸材料的导电性相关的，该方法包括测定核酸材料或含有所说的材料的反应混合物的导电率，并通过与预先确定的导电率与所说的性质或参数之间的关系相比较从所说的测定结果估测该材料的性质或参数。
本发明是基于这样一个发现，即核酸的一些经常需要定量的重要性质，可通过对核酸溶液的导电率的测定进行估测。这些性质的变化可从导电率的相应变化反映出来。溶液中核酸的浓度以及各种核酸的分子量是可按照本发明的方法进行测定的重要性质的例子。在酶处理过程中DNA或其它的核酸的分子量的变化可通过检测溶液中或反应混合物中导电率的变化来检测。
在本发明中，导电率可通过测定流经核酸材料的电流来测定。
本发明的主要关心的是单一种类的核酸的性质或性质的变化的测定。但该材料的绝对纯净并不总是需要的，本发明适用于含有少量其它材料的核酸，包括其它种类核酸。
DNA的浓度可通过在一个已知的交流电频率下测定电流/导电率来确定。已发现在任意一个固定的频率记录的电流与DNA的浓度成正比。例如，
图1显示了在2kHz记录到的电流/导电率是如何随DNA的浓度变化的。这一关系不仅适用于单一大小的核酸，也适用于很多不同大小的分子。在设计实施本发明的方法的仪器时，可容易地按照电流和核酸浓度之间的关系调整和校准导电率计。实际上通常需要将该仪器进行校准以处理均一的DNA样品而不是一个范围的分子量。因此通常首先对样品“测定大小”，然后选择用于浓度测定的适当的核酸参量。
DNA样品的分子量测定是通过测定这些分子对施加在电极之间变化的频率的响应来进行的。将记录到的电流/导电率(表1)以最大的电流/导电率响应的百分数(％响应)相对于施加在两个电极之间的交流电信号的频率作图，得到特征曲线，它根据所涉及的分子量而有所不同(图2)。
表1电流(μA)频率25聚体 puc18 lambda(λ)2.00E+036 62 934.00E+036 63 966.00E+036 64 988.00E+036 64 991.00E+047 64 992.00E+048 65 1004.00E+04 11 65 1026.00E+04 15 66 1028.00E+04 19 67 1021.00E+05 24 68 1042.00E+05 45 78 1094.00E+05 80 99 1206.00E+05 98 109 122对于单一DNA种类来说，分子量可通过首先计算响应对频率曲线的梯度(频率范围0-5×105Hz)来确定。然后可将该梯度值与画出的Log分子量相对于梯度的关系的校准曲线(图3)进行比较。对于所有检测的DNA分子来说，该梯度随着分子量变化，结果是梯度值越大，分子量越低。推测这种关系的基础是DNA分子的移动性随频率的变化而变化；当频率升高时，大分子对变化的响应比较小分子的要小。
本发明的DNA定量和分子量测定的方法避开了已有技术中的问题并且相对于那些常规的方法具有几个明显的优点。因而，本发明可使分子量和浓度得到快速和准确的测定，它更为敏感和准确，对操作者来说更为安全并且只需要小体积的样品。
上述的对DNA的表征已通过使用在两个细铂线电极(也可使用如铜，不锈钢的金属)之间通过含有DNA的溶液的交流电信号而得到，所述的交流电信号是调频的。通常在两个细金属丝导电极之间施加一个0和10伏之间的固定的交流电信号。将这一交流电信号的0和1MHz之间的范围内的频率施加在这些电极之间，并以通过该溶液的电流依次在每一频率记录相应的导电率。例如，将样品DNA以至少10μl的体积溶解于水或TE缓冲溶液中。为方便起见，可使用一个标准的500μl塑料管。将两个铂细丝电极置于溶液中并与一个在1V交流电操作的函数发生器(function generator)相接。使一系列的0-1MHz的频率通过该溶液，并使用一个电流计以mA测量所产生的电流。DNA浓度是将在2kHz的频率通过溶液的电流与标准曲线(与固定频率的电流相关的DNA浓度)相比较进行计算的，也可使用其它的频率。
具体实施例对溶液中的DNA分子的分子量可通过导电率方法测定的验证是通过制备四种在milli Q水和Tris EDTA(TE)缓冲液中的四种不同的DNA溶液〔25碱基的寡核苷酸，700碱基对片段，pUC18(＝2690碱基对)和Lambda(λ＝50000碱基对)〕和第五种含有未知分子量DNA的溶液(UN)来进行的。对这些溶液的导电率在2×104Hz至105Hz的频率范围内，以μA进行测量。在milli Q和TE缓冲液之间没有显著差异，表明DNA分子可在用于贮存DNA的最普通的缓冲液中被精确地测定大小。
为证实分子量和导电率之间的关系，将溶液配制三份进行检测。表2提供了这一验证结果，并且表明相互重复的样品之间的差异很小。表3显示了以μA计的平均导电率，并且也显示了作为最大导电性的％的数值。以％响应提供数据的主要原因为，虽然在实验中差异很低(如表1所示)电流探头系统的不稳定性造成不同的实验之间μA读数上的巨大差异。但导电率变化的趋势(如％响应所表示的)在不同的实验之间是一致的。
图4显示了用表3的平均％响应数据作出的图。在DNA溶液之间最明显的差异是斜线的梯度。当该梯度从在2×104和4×105的导电率计算时，在梯度和Log分子量之间观察到近似线性的关系(图5)。这样，梯度可被用于计算分子量。
从图5发现，样品UN的分子量为约1047碱基对，该结果与将同样的片段在琼脂糖凝胶上测定的大小有很好的一致性。
表2在一个频率范围内DNA溶液的导电率(μA)重复样品 平均(μA)频率大小12 3
表3在一个范围的频率内DNA溶液的导电率(以μA和％响应计)25碱基 700碱基对 un 2,690碱基对 50,000碱基对
上述关系适用于在静止条件下对DNA进行表征。这些关系的一种新的应用是实时监控反应和过程的进行，这些反应或过程中DNA通过酶促反应被修饰，例如聚合酶链式反应(PCR)，逆转录反应，DNA-DNA连接反应，或者DNA与不是酶的蛋白质相互作用，例如DNA-蛋白质相互作用。这一方法具有几个优点，即确定反应或过程的终点，确定反应或过程的关键性步骤，解决难题和自动化。例如，PCR是基础理论研究和医学诊断中主要的分子生物学工具，其中PCR被用于区分携带特定的遗传性状的个体。在医学诊断中遇到的一个主要的瓶颈是PCR产物的分析。这通常涉及一个需要精确地测定大小的单一的纯净的DNA产物。这通常是通过费力的凝胶电泳来进行的。
对导电率的测定已被应用于PCR。如上所述，将一个固定频率的交流电信号(0和1MHz之间-0至10伏)在两个细的铂金丝电极之间通过，并在反应进行的过程中测定通过PCR反应混合物的电流/导电率。测定可以在反应过程中固定的点进行，也可以连续地进行。在PCR过程中导电率的变化具有明显不同的形态，从而可实时对反应进行评估。在初始阶段具有一个导电率的下降，这可能由基因组模板DNA的解离和变性造成的。成功的反应随着反应循环的进行显示出一个快速的导电率上升，然后达到一个平台，表示反应达到了终点(图4)。不成功的反应随着反应循环的进行不显示导电率的上升。试验细节和得到的结果描述如下。
实时检测PCR反应得到相似的结果。对于产率低的反应示于图7的曲线是典型的。在起初的两个循环中，总的导电系数(a)稍微上升，然后导电系数下降(b)，然后上升(c)，在反应的最后阶段趋于水平成为平台(d)。
在反应的最后循环期间导电率的上升可能是由反应产物的增加造成的。在最初的循环中导电率的下降可能是由于小的导电物质，例如引物、核苷酸和无机离子的浓度的变化造成的，这种小的导电物质的运动在所使用的高的交流电频率下比大的DNA分子起着较大的作用。随着产物浓度的升高，它便开始影响溶液的总的导电率，因而在高的DNA浓度下，反应混合物的导电率升高。当反应到达终点时，DNA的浓度的升高趋于平缓，溶液的导电系数达到平台期。
在反应的终点加入单个反应成分应进一步提高反应的产率，这可在溶液的导电率的升高中显示出来。图8显示了Taq聚合酶(e)的加入提高了反应的导电率和反应的总的产率。这表明Taq可能是限制性的。探讨限制性组分的进一步的试验可包括引物，核苷酸和缓冲液的加入。
从上文的叙述可知，本发明提供了一种测定核酸材料的、或者其中核酸通过化学或生物化学反应被修饰的过程的性质或参数的方法，所说的性质或参数是与核酸材料的导电性相关的，该方法包括测定核酸材料或含有所说的材料的反应混合物的导电率，并通过与预先确定的导电率与所说的性质或参数之间的关系相比较从所说的测定结果估测该材料或过程的性质或参数。
所估测的参数可以是溶液中单一种类核酸的浓度。或者，所估测的性质可以是核酸的分子量，这是从预先确定的分子量和电流/频率响应的特征曲线之间的关系估测的。这一关系可以是分子量和频率响应的特征曲线下的面积。另外，所估测的性质是一个范围内的分子种类的分子量的总的指标。
这一测定可以用已经按照预先确定的关系校准的仪器来进行，这一关系可以是分子量/导电率关系和浓度/导电率关系。
如果估测的是一种方法的参数，所说的参数可以是核酸的酶促反应过程进行的程度，例如聚合酶链式反应，逆转录反应，或核酸连接反应。附录数据获得和系统设计PCR导电率的测定是通过将一个脉冲的、2kHz 1V的交流电通过反应混合物来进行的(图1.0)。这是通过一个变量获得放大器(1-25)进行放大的，并且这一信号通过一个微型计算机进行记录。信号脉冲的频率和数据获得也通过该微型计算机进行控制。一种测定PCR导电率的试验方案示于图9。
使用一个单一的I/O卡(PCL-812PG，Semaphore Systems Limited，London)来控制开关电路的类似控制的数字，和数字测定的类似值。起初，导电率数值是以固定的间隔获得的，但是最近一个较大的修改(需要额外的电路板设计)是用温度对获得性进行调节，从而当温度达到典型的退火值时，获得率被提高。在高的变性和延伸温度时，获得的次数提高(表4)。表4PCL-812PG I/O卡控制Gp Fn Parm1 Parm2 Parm3注01 21 1 2000 将D/A电压调整至2V(开关探头开)02 51 1等候1秒钟03 27 229 4预置内部卡片得到404 01读出A/D导电率探头05 27 229 0预置初始卡片得到006 01读出A/D导电率温度探头07 21 1 0预置D/A电压至0V08 51 1等候1秒钟09 51 $0 4 0.69 如果温度小于等于退火温度，则10如果不是则1310 57 1等候1秒钟11 52 1回到0112 58表述结束13 15 等候15秒钟14 00结束
权利要求
1.一种测定核酸材料的、或者其中核酸通过化学或生物化学反应被修饰的过程的性质或参数的方法，所说的性质或参数是与核酸材料的导电性相关的，该方法包括测定核酸材料或含有所说的材料的反应混合物的导电率，并通过与预先确定的导电率与所说的性质或参数之间的关系相比较从所说的测定结果估测该材料或过程的性质或参数。
2.按照权利要求1所述的方法，其中，被测定的参数是溶液中核酸的浓度。
3.按照权利要求2所述的方法，其中，该核酸材料主要由单一种类的核酸组成。
4.按照权利要求1所述的方法，其中，被测定的性质是核酸的分子量。
5.按照权利要求4所述的方法，包括使用一定范围内的不同频率的交流电测定含有核酸的溶液的导电率。
6.按照权利要求5所述的方法，其中核酸的分子量是从预先确定的分子量和电流/频率响应的特征曲线或其部分之间的关系测定的。
7.按照权利要求6所述的方法，其中，所述的关系是分子量和频率响应的特征曲线下面的面积之间的关系。
8.按照权利要求4至7中任意一项的方法，其中，所测定的性质是一定范围内的核酸种类的分子量的总体指标。
9.按照前述任意一项权利要求所述的方法，其中，所说的测量是使用已预先按照预先确定的关系校准的仪器进行的。
10.按照权利要求6所述的方法，其中，所述的仪器已相对于分子量/导电率关系和浓度/导电率关系校准。
11.按照权利要求1所述的方法，其中是对一个过程的参数进行测定，所述的参数是核酸的酶促过程已经进行的程度。
12.按照权利要求11所述的方法，其中该酶促过程是聚合酶链式反应，逆转录反应，或核酸连接反应。
13.按照前述任意一项权利要求所述的方法，其中导电率是通过测定流经核酸材料的溶液的交流电进行测定的。
14.按照前述任意一项权利要求所述的方法，其中的核酸是DNA。
15.用于实施前述任意一项权利要求所述的方法的设备，包括测量导电率的装置，和变化所施加的交流电的频率的装置。
全文摘要
一种测定核酸材料的、或者其中核酸通过化学或生物化学反应被修饰的过程的性质或参数的方法,所述的性质或参数是一种与核酸材料的导电率相关的性质或参数,包括测定核酸材料或含有该材料的反应混合物的导电率,并参照导电率和所说的性质或参数之间预先确定的关系从该测定结果估测该材料或过程的性质或参数。
文档编号G01N33/483GK1267336SQ9880816
公开日2000年9月20日 申请日期1998年8月21日 优先权日1997年8月22日
发明者本杰明·戴维·科布, 约翰·迈克尔·克拉克森 申请人:分子感应器有限公司