专利名称：用于激活沉默转基因的方法和物质的制作方法
技术领域：
本发明涉及控制遗传序列表达的物质及其使用方法。更具体地，本发明涉及诱导特异灭活靶基因表达的反义核酸序列的表达。
灭活基因表达的现有技术的基本问题在于使用组成型启动子，始终启动所引入转基因(或基因片段)的表达。这样，接受所引入转基因的转化细胞也立即受到其表达的影响。在引入的转基因能抑制必需内源基因表达的情况下，所有转化细胞在转化之后很快被杀死。因此，对导入DNA序列的表达进行可诱导的控制是人们所希望的。
然而，在全株植物中仍未能实现对导入基因表达的严格而可诱导的控制。这种控制可以有多种用途，包括应用方面例如调节基因以控制丰产，更多的是基础方面，例如通过敲除新基因以探查其功能。
许多正转录调节因子是由DNA结合域和与启动子处装配的转录机构成分相互作用的激活域构成的模块(Ptashne，1988；Swaffield等，1995)。融和来自不同生物界的上述元件，已产生了对所述靶生物具有特定DNA结合特性和转录激活功能的各种不同杂合因子。例如，在烟草原生质体的瞬时表达实验中，来源于酵母GAL4转录激活因子的转录因子显示出能激活由含有多个GAL4 DNA结合位点和植物细胞识别性启动子来源的TATA元件的合成启动子控制的报告基因的转录(Ma等，1988)。杂合转录激活因子和激活因子突变体的功能还通过高速微粒传递将基因打入玉米种子的糊粉层来进行研究。当反式激活蛋白基因和报告基因均通过微粒导入时，与单纯疱疹病毒VP16蛋白或功能相关的玉米调节蛋白C1的酸性激活域融合的GAL4 DNA结合域显示出刺激GAL4依赖的报告基因的表达(Goff等，1991)。当瞬时导入烟草原生质体时，由434噬菌体的DNA结合域融合VP16激活域组成的嵌合转录激活蛋白显示能激活由包含融合的35S最小启动子和434操纵子的合成启动子启动的报告基因表达(Wilde等，1994)。这些研究共同证明，异源因子的DNA结合域能可与在导入植物细胞的裸露DNA模板上含有合适结合位点的合成启动子结合，而且，当与DNA结合域共价连接时非植物激活域能有效地与植物的转录机构相互作用。
尽管分析瞬时导入宿主细胞的转基因有益于初步确定基因功能，但稳定转化将是研究植物基因表达的更广泛的应用系统。然而椐报道，GAL4 DNA结合域在植物中表达效率很低(Reichel，C．等，(1995)“在转基因植物中GAL4 DNA结合域的低效表达(InefficientExpression of the DNA-Binding Domain of GAL4 inTransgenic Plants)”植物细胞通讯(Plant Cell Reports)14(12)773-776)。在植物中控制转基因表达的理想的调控系统在缺乏功能转录因子时应只有很低或没有背景表达，而在存在功能转录因子时则有高表达。
因此，所需要的是对在稳定转化植物中提供导入DNA序列的可诱导表达有用的物质和方法。
本发明提供用于稳定导入植物杂合转录因子和合成启动子以诱导可激活DNA序列如转基因的表达的方法、物质和含有异源DNA序列的转基因植物，从而满足了本领域长期悬而未决的需要。重要的是，本文所述发明有效地将转基因的插入与其活性分离，从而允许挽救本会致死的转化体，之后再激活它们。本发明可应用于研究基因功能，例如鉴定对植物生长、发育和存活重要的基因。本发明的一个特别重要的特征是能在稳定转化植物中诱导反义DNA序列或显性抑制因子的表达，如能破坏基因功能的可翻译或不可翻译的有义序列，以正向鉴定对植物正常生长发育必需的一个或多个基因。
本发明包括杂合转录因子基因、合成启动子、可激活DNA序列和含有这些基因、启动子和DNA序列的细胞、组织和植物，及使用它们鉴定植物基因功能的方法。选择或设计杂合转录因子基因和合成启动子，以便杂合转录因子的DNA结合域能特异结合合成启动子以激活合成启动子启动的可激活DNA序列的表达。
更具体地，本发明包括含有激活合成启动子所必需的杂合转录因子编码序列的第一种细胞或组织，优选植物细胞或植物组织、或植物，和含有合成启动子的第二种细胞或组织，优选植物细胞或植物组织、或植物，其中通过操作第一种和第二种细胞、组织或植物，能产生含有编码所述杂合转录因子和合成启动子二者序列的细胞、组织或植物。最好是，第二种细胞、组织或植物含有可操作地连接了可激活DNA序列的合成启动子，当杂合转录因子激活启动子时，合成启动子启动可激活DNA序列的表达。在另一实施方案中，设计或选择杂合转录因子以便能被一独立因子如雌激素所控制。
本发明的方法包括合并第一种和第二种细胞、组织或植物以形成含有杂合转录因子基因和合成启动子的稳定转基因植物以便可激活DNA序列在植物中的表达。本发明的一个实施方案允许本领域技术人员通过有性导入特异激活合成启动子控制的目的基因表达的转录因子编码基因，来激活本为沉默的目的基因(或基因片段)如反义基因的表达。当目的基因能够灭活内源基因的表达时，含有目的基因的植物与效应植物之间的有性杂交后代将不能正常表达该内源基因。正常生长或发育必需的植物基因可用这种方式鉴定。这些基因的鉴定提供了从化合物文库中筛选有效除草剂的有用靶标。
本文所述发明证明在稳定转化植物中杂合转录因子可有效地发挥作用控制基因表达。下面详细描述了第一个证据，即杂合转录因子可在全株植物中有效地激活基因功能，从而提供了正向鉴定植物生长必需基因的有用系统。
本发明提供了在植物中研究基因功能的一种重要新方法。本发明对鉴定生长、发育或生存必需或重要的植物内源DNA序列是特别有用的。这些DNA序列的鉴定为合理有效开发安全、有效、经济上可行和环境上合理的产品以解决重要农业问题提供了重要信息。在一个实施方案中，本发明可用于通过敲除内源基因表达以测定其功能。具体地，通过确定目的基因对植物的生长发育是否必需，本发明可用于验证可能的除草剂靶基因。这就在筛选和开发链中提供了的早期而重要的连接，并提供了安排资源和指导努力方向的动力以鉴定和测试最有效的化合物，从而为公众提供直接利益。
为了提供所申请发明的全面、清楚、简洁和准确的描述，将本文所用术语定义如下。可激活DNA结构-指一种DNA序列或含有该DNA序列和合成启动子的重组结构，其导入细胞，最好是植物细胞时是不表达的，即为沉默的，除非存在能结合和激活合成启动子的完整杂合转录因子。随后将所述可激活DNA结构导入细胞、组织或植物形成能表达该可激活DNA序列的稳定转基因系，下文将作更全面的描述。可激活DNA序列-指在基因组(最好是植物基因组)中调节基因表达的DNA序列。可激活DNA序列与基因组中的内源靶DNA序列互补。当可激活DNA序列导入细胞并在其中表达时，会抑制所述靶DNA的表达。本发明中有用的可激活DNA序列包括那些编码或充当显性抑制因子的DNA序列，如在稳定转化植物中能破坏基因功能的可翻译或不可翻译有义序列，以正向鉴定植物生长发育必需的一个或多个基因。优选的可激活DNA序列是反义DNA序列。反义序列的作用机制尚不清楚，推测是反义RNA结合靶基因RNA抑制了靶DNA基因产物的表达。可能这种RNARNA复合物抑制了翻译机构的结合或功能，也可能是这种RNARNA复合物被迅速降解。可能还有其它机制。所述靶基因最好是编一种蛋白质，如植物生长或生存必需的生物合成酶、受体、信号转导蛋白、结构基因产物或转运蛋白。反义RNA序列与靶基因RNA的相互作用导致靶DNA序列表达的实质性抑制，以至于杀死该植物或抑制正常植物生长或发育。表达-指植物内源基因或转基因的转录和／或翻译。例如对于反义结构，表达可仅指反义DNA转录。基因-指编码序列和相关调节序列，其中编码序列转录成RNA例如mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、有义RNA或反义RNA。调节序列的例子如启动子序列、5’和3’非翻译序列和终止序列。其它可能存在的元件是内含子等。目的基因-指当转入植物时，赋予该植物所期望特性的任何基因，所述特性为例如抗生素抗性、病毒抗性、昆虫抗性、疾病抗性、或其它有害生物的抗性、除草剂耐受性、改善的营养价值、工业加工中改良的品质或改变的繁殖能力。“目的基因”也可以是为了在植物中生产有商业价值的酶或代谢物而转入植物的基因。异源DNA序列-指与其导入的宿主细胞非天然相关的DNA序列，包括天然存在DNA序列的非天然多拷贝。标记基因-指编码可选择或可筛选性状的基因。可操作地连接／联合-如果调节性DNA序列和编码RNA或蛋白质的DNA序列的位置使调节性DNA序列影响编码DNA序列的表达，我们就说该调节性DNA序列“可操作地连接”或“联合”该编码DNA序列。最小启动子-指在无上游激活存在时没有活性或活性大大降低的启动子元件，特别是TATA元件。在适当转录因子存在时，最小启动子能发挥功能引起转录。植物细胞-指包括原生质体和细胞壁的植物结构和生理单位。植物细胞的形式可以是分离的单个细胞或培养细胞，或作为更高级组织单元例如植物组织或植物器官的一部分。植物-指任何植物，特别是种子植物。植物材料-指植物的叶、茎、根、花或花的部分、果实、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、卵细胞、合子、胚胎、种子、插条、细胞或组织培养物、或植物的任何其它部分或产品。启动子-启动相关DNA序列转录的DNA序列。启动子区也可包括充当基因表达调节子(regulator)的元件，如激活子、增强子和／或阻遏子(repressor)。重组DNA-指用重组DNA技术连接在一起的DNA序列分子。重组DNA技术-指用于将DNA序列连接在一起的方法，参见例如Sambrook等，1989，冷泉港(Cold Spring Harbor)，NY冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)。选择性标记基因-指在植物细胞中表达时赋予细胞一种选择性优势的基因。转化了选择性标记基因的细胞所拥有的选择性优势可以是由于与非转化细胞相比，它们能在负选择剂如抗生素或杀虫剂存在时生长。与非转化细胞相比，转化细胞所拥有的选择性优势也可以是由于它们具有增强的或新的利用添加化合物如营养物质、生长因子或能源的能力。选择性标记基因也指在植物细胞中表达时赋予该细胞正向和负向两种选择性优势的基因或基因组合。稳定转化-指含有至少一种异源DNA序列的细胞，最好是植物细胞，其中所述异源DNA序列在细胞中持续存在，在适合其预定用途的条件下发挥功能，并能遗传给后代。具体地，该术语包括异源DNA序列无论通过何种方法最初导入的那些细胞，以及随后衍生的含有异源DNA序列的细胞、组织、植物或种子。后者也称作稳定转基因系。合成-指含有在天然序列中不存在的结构特征的核甘酸序列。例如，更类似双子叶植物和／或单子叶植物G+C含量和正常密码子分布的人工序列称为是合成的。转化-指将核酸导入细胞。特别是指DNA分子稳定整合至目的生物的基因组中。
正如下文更全面的描述，本发明包括杂合转录因子基因、合成启动子、可激活DNA序列和含有这些基因、启动子和DNA序列的细胞、组织和植物、及其使用方法。选择或设计杂合转录因子基因和合成启动子以便杂合转录因子的DNA结合域能特异结合合成启动子以打开由该合成启动子启动的可激活DNA序列的表达。
在一个实施方案中，本发明基于有性杂交来实现可诱导的基因激活，依靠转录效应系激活在可激活合成启动子控制下的沉默转基因的表达。可用该系统控制表达的性状包括非植物基因，即编码转录控制元件如内源启动子或转录后控制元件的可翻译或不可翻译的有义基因，和用于敲除内源基因表达的反义基因(如下文所述AdSS)。在一个方案中，如下文所详述，含有编码杂合转录因子的DNA序列的转录效应系，与含有可操作地连接可激活DNA序列的合成启动子的细胞、组织或植物系杂交。在另一个方案中，转录效应系含有编码部分杂合转录因子的DNA序列，从而使其中编码的蛋白能通过与该杂合转录因子结合部分的肽-肽相互作用形成杂合转录因子。而合成启动子、可激活DNA序列和编码杂合转录因子相应结合部分的DNA序列包含在另一个分开的株系中。而在另一个方案中，杂合转录因子被抑制剂灭活，从而阻止其激活合成启动子，例如阻断杂合转录因子与合成启动子的功能性结合。因此，只有去除杂合转录因子抑制剂，可激活DNA序列才会表达。
基于本公开，本领域技术人员会理解任何目的DNA序列或基因都能用这种方法来控制。
本系统对允许表达用其它方法可能不可挽救的性状如组成型启动的转基因，是特别有用的。例如有潜在致死效果的外源基因、或设计成消除必需基因功能的反义基因或显性负向突变，尽管在植物生物学的基础研究中很有意义，但存在固有的实验问题。低转化频率经常被引用作为组成型启动的特定转基因相关致死性的证据，但这类阴性结果充满了各种无意义的解释。本文所描述的这种系统允许被测转基因的稳定存在和增殖与其表达分离。这种将转基因插入与表达分离的能力对于得到关于基因功能重要性的可靠结论是关键的。因此，本发明对本领域有实质性的贡献。
表型损伤程度(severity of phenotype)的变化情况可通过检查与一个单一激活因子杂交的多个独立可激活系的表型来获得。通过依赖位置效应提供不同转基因座位的各种水平的表达能力，有可能获得特定性状的等位基因系列的拟表型。参见下文实施例2，实施例2显示设计成敲除一个必需代谢基因的反义基因的各种不同表达水平，产生了具有不同表型损伤程度的植物株系。同样，独立株系中的其它性状也可不同程度地失活。
选择性地，特定性状的表达可通过进一步控制具有合适启动子(如在发育的时间或空间中受调节的启动子)的杂合激活因子基因的表达来实现。根据所讨论启动子控制的严谨性，有可能评价在特定细胞、组织或器官中或在特定发育时期目的基因的功能。例如，胚胎发育对某一基因功能的需求可通过用已知在发育的种子中高表达的启动子启动的因子激活反义转基因来测试。在果蝇(Drosophila)中这种方法已被广泛应用，通常是随机插入GAL4效应物结构以获得与在不同类型细胞和组织中指导表达的各种基因组增强子的融合物(Brand and Perrimon，1993)。同样，本发明的DNA结构通过使用可化学诱导的启动子提供了另一种对基因表达的控制，如Schena等所示类固醇诱导的基因表达(Proc．Natl．Acad．Sci．，USA，Vol．88，pp 10421-10425，December1991)。
表达的进一步调节可通过为特定应用选择适合强度的激活域来实现。最近，用酵母功能性筛选鉴定了带有净正电荷或负电荷的植物转录激活域(Estruch等．1994)。当这些结构域与GAL4的DNA结合域均通过微粒导入玉米或烟草细胞时，二者相融合产生了可激活GAL4依赖性启动子基因的蛋白质。这样，各种不同激活域可通过直接的功能或结构筛选来鉴定。
尽管本文所描述的工作是以阿布属(Arabidopsis)为例，但所述反式激活本身并不限于这一物种。采用合适的启动子，本文所述系统可在任何物种中起作用，它们包括商业上重要的植物，包括但不限于玉米、水稻、小麦、甜菜、大麦、黑麦、棉花、油菜、燕麦、高粱、粟、草坪草和观赏植物。杂合转录因子基因杂合转录因子基因包含编码1)DNA结合域和2)与启动子处组装的转录机构成分相互作用的激活域的DNA序列。连接基因片段，典型地是DNA结合域在5’末端而激活域在3’末端，以形成表达杂合转录因子的杂合基因。本领域技术人员可按常规方法将各种编码DNA结合域的DNA序列与各种编码激活域的DNA序列连接起来，从而形成多种组合的杂合转录因子基因。
可用于产生本发明有用的杂合转录因子的DNA序列的例子包括，但不限于编码GAL4、噬菌体434、lexA、lad和λ噬菌体阻遏蛋白DNA结合域的序列。
可用于产生本发明有用的杂合转录因子的DNA序列的例子包括，但不限于单纯疱疹VP16、玉米C1和P1的酸性激活域编码序列。另外，可通过将来自所选有机体的DNA片段与合适的DNA结合域融合然后直接进行功能选择的方法来分离合适的激活域(Estruch等，1994，以参考文献方式完全并入本文)。不同来源的转录激活蛋白之间可相互交换结构域(Brent and Ptashne(1985)细胞(Cell)，43729-736)。
一种有利的杂合转录因子基因含有编码与玉米C1激活域融合的GAL4DNA结合域的DNA序列。本领域技术人员可采用常规分子生物学和重组DNA技术产生期望的转录因子基因。合成启动子合成启动子包含至少一个杂合转录因子DNA结合域识别的DNA结合位点，和一个最小启动子，优选来自植物细胞识别的启动子的TATA元件。更具体地，TATA元件来自合成启动子将要转入的植物细胞类型所识别的启动子。最好是DNA结合位点在合成启动子中多次重复以便最小启动子可被更有效地激活，这样与合成启动子相连的可激活DNA序列就可获得更有效的表达。
可用于产生本发明合成启动子的DNA结合位点的例子包括但不限于GAL4 DNA结合蛋白识别的上游激活序列(UASG)、lac操纵子、和lexA结合位点。植物细胞识别的启动子TATA元件的例子包括那些来自如下启动子的TATA元件CaMV 35S、玉米Bz1启动子、UBQ3启动子、农杆菌属(Agrobacterium)胭脂碱合成酶或甘露碱合成酶启动子如SuperMAS、蔬食芥(Brassica oleracea)的hsp80和阿布属肌动蛋白-2启动子。
一种有利的合成启动子包含具有TATA元件(相对转录起始位置-59到+48位核苷酸)的截短的CaMV 35S序列，其5’末端融合了GAL4结合域所识别的上游激活序列(UASG)的约10个串联同向重复。本领域技术人员可采用常规分子生物学和重组DNA技术来产生期望的合成启动子。可激活DNA序列可激活DNA序列包括任何期望稳定导入植物细胞并表达的DNA序列。特别期望的可激活DNA序列是有义或反义序列，其表达导致其对应内源基因表达的降低，从而抑制植物正常的生长或发育。
可激活DNA序列可操作地与合成启动子连接，形成可激活DNA结构。在转基因系中，可激活DNA结构中的可激活DNA序列不表达，即它是沉默的，除非同时还存在可结合并激活合成启动子的杂合转录因子。随后将可激活DNA结构导入细胞、组织或植物，形成表达可激活DNA序列的稳定转基因系，下文将作更全面的描述。含有杂合转录因子，或合成启动子和可激活DNA序列的细胞、组织或植物本发明还包括分别含有杂合转录因子基因和可激活DNA结构的第一种和第二种细胞或组织，优选植物细胞或植物组织，或植物。选择第一种细胞、组织或植物和第二种细胞、组织或植物以便通过操作它们能形成含有杂合转录因子基因并表达杂合转录因子、同时还含有并激活可激活DNA结构的合成启动子以表达该启动子启动的可激活DNA序列的植物细胞、植物组织或植物。
将上述杂合转录因子基因和可激活DNA结构导入细胞、组织或植物，可采用本领域熟知的常规方法，包括但不限于杂交、农杆菌介导的转化、Ti质粒载体、直接DNA摄取如微粒轰击、脂质体介导的摄取、显微注射等。
例如，可采用农杆菌介导的转化产生含杂合转录因子基因的转基因植物株系。通过瞬时转化报告基因结构，筛选能激活相应合成启动子(即可被杂合转录因子激活的合成启动子)引导表达的初级转化体(T1代)。采用常规RNA凝胶印迹分析确证转化体表达杂合转录因子基因。在自交后T2代中通过单一座位的卡那霉素抗性(或插入DNA携带的其它合适选择性标记基因)的分离来进一步检测株系的转基因性质。单一T-DNA插入的存在可通过在表现3∶1分离的株系中进行基因组DNA凝胶印迹分析来证实。可以采用RNA凝胶印迹法进一步分析这些株系中杂合转录因子的表达。将若干T2植株自交产生T3后代，从中筛选插入的杂合转录因子基因的纯合体。
采用类似的方法通过农杆菌介导的转化制备含有可被期望的杂合转录因子激活的合成启动子的转基因系。采用标准方法制备含有合成启动子和可激活DNA序列(可激活DNA结构)以及可选择含有的选择性标记的转基因株系。选择性地，可利用该标记筛选转基因株系以确证可激活DNA结构的存在。含有杂合转录因子和可激活DNA结构的F1植株含有杂合反式激活因子基因和可激活DNA结构的F1植株通过异花受粉产生并利用合适标记如卡那霉素的存在来筛选。与仅含有可激活DNA结构的植株比较，F1植株产生了高水平的可激活DNA序列表达产物，其可与使用强组成型启动子如CaMV 35S获得的表达相比。
本发明一个有用的分析方法包括a) 将含有杂合转录因子基因的第一种稳定转化植株，其中所述杂合转录因子基因编码的杂合转录因子在合成启动子存在于该植株中时可激活该合成启动子，而且对于该杂合转录因子而言该植株是纯合的；与b) 含有可激活DNA序列和可被所述杂合转录因子激活的合成启动子的第二种稳定转化植株杂交，其中DNA序列在杂合转录因子存在时可获得表达，所述杂交产生表达该DNA序列的F1植株；和c) 测定F1植株中该DNA序列的表达效果。
所述方法优选，其中杂合转录因子基因编码酵母GAL4基因来源的DNA结合域和玉米C1基因来源的转录激活域。
所述方法进一步优选，其中最小启动子选自CaMV 35S最小启动子、玉米的Bzl启动子和UBQ3启动子。
所述方法优选，其中合成启动子序列包括含有TATA元件的CaMV 35S最小启动子，其在5’末端融合了GAL4 DNA结合域识别的上游激活序列的10个串联拷贝。
所述方法优选，其中杂合转录因子基因编码酵母GAL4基因来源的DNA结合域和玉米C1基因来源的转录激活域，而且其中可激活DNA结构包含具有CaMV 35S最小启动子的合成启动子序列，该含有TATA元件的CaMV 35S最小启动子5’末端融合了GAL4 DNA结合域识别的上游激活序列10个串联拷贝。
本发明的另一个有用的方法提供了鉴定必需的植物基因如植物AdSS基因的抑制剂的方法，其包括，a) 在植物AdSS酶功能的可疑抑制剂存在时将AdSS酶与AdSS底物反应；和b) 将可疑抑制剂存在时AdSS酶反应速率与可疑抑制剂不存在时同样条件下的AdSS酶反应速率比较，以确定该可疑抑制剂是否抑制了AdSS。
本发明的一个优选实施方案包括含有杂合转录因子基因和可激活DNA结构的植物，其中杂合转录因子基因编码的杂合转录因子能激活可激活DNA结构的合成启动子以诱导可操作连接的反义DNA序列的表达，其中该植物稳定转化了杂合转录因子和可激活DNA结构。
优选的所述植物，其中杂合转录因子基因包含来自选自酵母GAL4基因、噬菌体434、lexA、lacI和λ噬菌体阻遏子的基因的DNA结合域；来自选自单纯疱疹VP16、玉米C1和P1的基因的转录激活域；可激活DNA结构包括选自CaMV 35S最小启动子、玉米Bz1启动子和UBQ3启动子的最小启动子。
所述植物进一步优选，其中合成启动子序列包括5’末端融合了GAL4DNA结合域识别的上游激活序列的10个串联拷贝的CaMV 35S最小启动子，该CaMV 35S最小启动子含有TATA元件。
所述植物进一步优选，其中杂合转录因子基因编码酵母GAL4基因来源的DNA结合域和玉米C1基因来源的转录激活域，并且其中可激活DNA结构包括含有5’末端融合了GAL4 DNA结合域识别的上游激活序列的10个串联拷贝的CaMV 35S最小启动子的合成启动子序列，CaMV 35S最小启动子含有TATA元件。
所述植物进一步优选，其中可激活DNA序列是AdSS反义序列。
从已显示分别具有DNA结合和转录激活功能的GAL4和C1基因的成分，构建杂合转录因子基因。(用于植物转化的结构pAT 53依次含有左边界序列、35S启动子、与35S启动子可操作连接的含有GAL4 DNA结合域和C1激活域的杂合转录片段、35S 3’终止序列和pNOS／NPT／nos 3’选择性标记盒，之后连接右边界序列)。所编码蛋白质的N端147个氨基酸来自GAL4，C端101个氨基酸来自C1羧基端173-273氨基酸。过去已显示类似的组合在瞬时表达实验中起作用(Goff等，1991)。
设计成可被该因子激活的合成启动子采用在5’端融合了GAL4蛋白识别的上游激活序列(UASG)的1O个串联拷贝的Bz1 TATA元件(也可选择地采用含有TATA元件(相对转录起始点-59到+48位核苷酸)的截短的CaMV 35S启动子)来构建。(pAT 73结构依次含有左边界序列、35S启动子、与35S启动子可操作连接的二氢叶酸还原酶编码序列、35S 3’终止序列、含有TATA元件的10个串联GAL4结合位点结构、可操作连接的GUS报告基因元件、35S 3’终止序列和右边界序列)。为了在稳定转化体中评价该系统的效率，选择一个报告基因作为可激活DNA序列，如UASG／TATA合成启动子启动的修饰的大肠杆菌uidA(β-葡糖醛酸糖苷酶；GUS)编码序列。GUS基因被认为是表达的模式报告基因，因为其基因产物容易检测和定量。
含有杂合转录因子基因的转基因阿布属植物系采用农杆菌介导的转化来产生。通过瞬时转化荧光素酶报告基因结构，筛选能激活UASG／TATA合成启动子引发表达的初级转化体(T1代)。微粒轰击后大约一半被测T1转化体显示荧光素酶活性。RNA凝胶印迹分析证实这些转化体表达GAL4／C1基因。通过自交后T2代中单一座位的卡那霉素抗性(T-DNA携带的选择性标记基因)的分离来进一步检测这些株系。单一T-DNA插入的存在通过在表现3∶1分离的株系中进行基因组DNA凝胶印迹分析来确证(数据未显示)。采用RNA凝胶印迹法进一步分析这些株系中GAL4／C1基因的表达。RNA印迹分析显示两个株系均表达可检测水平的转基因的稳定RNA。选取一个效应系，命名为pAT53-103，用于进一步实验。若干T2植株自交产生T3转基因后代，从中筛选T-DNA插入的纯合体。
含有UASG／TATA／GUS基因的转基因阿布属植物株系采用农杆菌介导的转化来产生，并通过氨甲蝶呤选择来筛选纯合体。选取两个株系，命名为pAT73-309和pAT73-346，用于GUS活性分析，发现GUS活性非常低，与实验本底没有显著差异(表1)。通过异花受粉产生含有杂合反式激活因子基因和可激活报告基因的F1代植株，然后用卡那霉素筛选。与仅含有报告基因的植株相比，F1代植株产生了非常高的GUS活性，其可与使用强启动子如CaMV 35S获得的表达水平相比(表1)。表1．F1代植株的β-葡糖醛酸糖苷酶活性。
GUS活性*转化体(nmol MU／min／mg蛋白)35S／GUS 株系7 17．6±4．3株系105 19．1±7．2株系115 12．1±3．7非转化Nossen 0．03±0．O1pAT53-103 0．01±O．0pAT73-309 0．01±0．01pAT73-309×pAT53-103 F1 4．97±3．41pAT73-346 0．01±0．0pAT73-346×pAT53-103 F1 6．02±2．3*每个株系或F1杂交后代测量20株植物的GUS活性(平均值±标准差)实施例2-在稳定转基因植物中表达沉默反义DNA序列此外，本发明可通过诱导特异灭活被测基因表达的反义基因的表达来研究基因功能。本发明用于启动反义基因表达以消除基因功能。腺苷酸琥珀酸合成酶(AdSS)编码基因，将IMP转化成AMP的嘌呤从头生物合成的两个步骤之一，被用作可激活DNA序列。最近AdSS被认为是天然的有效除草产品hydantocidin的作用靶标(Cseke等，1996；Fonne-Pfister等，1996；Siehl等，1996)。AdSS活性可用本领域熟知的标准酶学分析测定，例如通过将AdSS酶与AdSS底物反应，AdSS酶能催化该底物形成一种测量上与底物显著不同的产物，然后测定底物转化成产物的催化转化速率。该转化可通过确定不同时间反应中存在的底物、产物或两者的量来直接测定，或者通过确定只与底物或产物相关的标记的量，如放射性或颜色指示剂，来间接测定。Southern印迹分析揭示本文用于反义基因结构的全长cDNA是阿布属基因组中的一个单一基因。
基于反义DNA序列在实施例1的稳定转化植株中的成功表达，推测在含有杂合转录因子基因和启动AdSS反义序列表达的合成启动子的稳定转基因植物中AdSS反义序列的成功表达，将导致内源AdSS基因表达的灭活。还推测，如果AdSS反义序列成功表达，那么将会导致与hydantocidin除草剂效果类似的植物致死。但是，在进行这些实验之前，本领域技术人员并不清楚在稳定转化植物中反义序列的表达是否会发生，是否导致AdSS基因的失活。正如下面所详述，在稳定转基因植物中成功表达了AdSS反义序列，而且内源AdSS酶的表达也被抑制。
用农杆菌转化产生了15个含有UASG／TATA／反义AdSS结构的转基因植株。(结构pJG261AntiAdSS依次含有左边界序列、pNos／BAR／基因73’选择性标记盒、含有TATA元件的10个串联GAL4结合位点结构、AdSS反义编码序列、35S 3’终止序列和右边界序列。)将初级转化体的花和反式激活因子纯合系pAT53-103的花粉杂交。F1代种子于含卡那霉素的平板上生长，以选择异型杂交后代。这些初级转化体是所导入T-DNA(含有反义基因)半合的，其在大多数情况下将按单一孟德尔性状分离。因此，反义基因应该与始终含有半合状态反式激活因子基因的背景(除了罕见的自交产生的污染种子，其可在选择性标记如卡那霉素存在下发芽而得以选择)按1∶1分离。在6个株系中，大约50％幼苗生长严重迟缓，在有些情况下完全不能发芽。5个其它株系存活至真叶扩展，但转入土中之后显示出各种生长异常。最后4个株系显示很少或没有异常表型。
为了确证观察到的严重生长迟缓和致死是由于存在所述反义转基因而引起的，设计引物进行聚合酶链式反应以扩增AdSS cDNA 5’末端和最小35S启动子之间的区域。凝胶电泳显示，在异常幼苗和反义基因之间存在一对一的一致性。为了检查不同反义株系之间表型的变化，我们在不同反义株系的F1代进行了RNA凝胶印迹杂交。用AdSS探针与含有来自非转化Col-0植株、pAT53-103植株和pAT53-103×反义AdSS杂交F1代植株的RNA的凝胶印迹杂交，显示在具有严重异常表型的株系中很少检测到AdSS RNA。(分析中必须略去最严重的幼苗致死株系，因为可用于RNA抽提的组织太少。)这些实施例可考虑如下技术描述来进一步理解。重组质粒pSGZL1通过将pGALC1(Goff等，1991)的GAL4-C1 EcoRIⅠ片段连接到pIC20H的EcoRⅠ位点来构建。pSGZL1的GAL4-C1片段用BamHⅠ-BglⅡ酶切，然后插入pCIB770(Rothstein等，1987)的BamHⅠ位点以产生pAT53。
作为EcoRⅠ-PstⅠ片段从pGALLuc2(Goff等，1991)切下10个UASG位点和最小35S启动子(-59到+1)，插入pBluescript的相应位点，产生pST52。pAT66用pAT52的HindⅢ-PstⅠ片段、pCIB1716(含有35S非翻译引导序列、GUS基因和35S终止序列)的PstⅠ-EcoRⅠ片段和pUC18的HindⅢ-EcoRⅠ酶切片段之间的三方连接来构建。pAT66的35S引导序列用PstⅠ-NcoⅠ酶切并用PCR产生的+1到+48的35S引导序列来替代，以产生pAT71。
在pCIB710(Rothstein等，1987)的BamHⅠ位点插入二氢叶酸还原酶(dhfr)植物选择性标记基因产生pCIB921。pCIB921的35S启动子／dhfr基因盒用XbaⅠ-EcoRⅠ切下，插入到pCIB730(Rothstein等，1987)的相应位点，产生pAT58。将含有10个UASG位点／最小35S启动子／GUS／35S终止序列的pAT71的EcoRⅠ片段插入pAT58的EcoRⅠ位点，以构建pAT73。
质粒pBS SK+(Stratagene，LaJolla，CA)用SacⅠ线性化，然后用绿豆核酸酶处理去除SacⅠ位点，再用T4连接酶重新连接，以产生pJG201。用KpnI从pAT71中分离UASG／CaMV 35S最小启动子／GUS基因／CaMV终止序列盒，克隆至pJG201的KpnⅠ位点，产生pJG304。用限制性内切酶Asp718部分消化pJG304，分离全长线性片段。将该片段与过量摩尔数的寡核苷酸5’GTA CCT CGA GTC TAG ACT CGA G 3’连接。用限制性酶分析鉴定所述接头插入该位点5’端的克隆，这种质粒命名为pJG304ΔXhoⅠ。
用寡核苷酸引物5’GATTCGAGCTCATGTCTCTCTCTTCCCTC 3’和5’GATTCCCATGGTGGACCTGAACCAACTC 3’PCR扩增已描述过的AdSS合成酶cDNA克隆(Fonne-Pfister等，1996)(GenBank accession#U49389)的一个片段。用SacⅠ和NcoⅠ消化载体pJG304ΔXhoⅠ，以切下GUS基因编码序列。AdSS PCR片段用SacⅠ和NcoⅠ消化，连接到pJG304ΔXhoⅠ中，产生pJG304AntiAdSS。
用EcoRⅠ和HindⅢ消化载体pGPTV(Becker等，1992)去除胭脂碱合成酶启动子／GUS盒。同时，用EcoRⅠ和HindⅢ从pSE380切下超级接头，克隆至EcoRⅠ／HindⅢ线性化的pGPTV，产生pJG261。
用XhoⅠ消化pJG304AntiAdSS，以切下含有UASG／35S最小启动子／反义AdSS／CaMV终止序列融合物的盒子。该盒子连接到XhoⅠ消化的pJG261，以便该转录与bar选择性标记的转录背驰，产生pJG261AntiAdSS。转基因植物将pJG261AntiAdSS电转化至根瘤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101(pMP90)株(Koncz和Schell，1986)中，并用得到的菌株浸润转化(Bechtold等，1993)阿布属植物(Columbia生态型)。浸润转化植物种子在含有15毫克／升glufosinate(Basra，AgrEvo)的琼脂发芽培养基(4．3克／升Murashige-Skoog盐，0．5克／升MES，1％蔗糖，10微克／升维生素B1，5微克／升维生素B6，5微克／升尼克酸，1毫克／升肌醇，pH 5．8)上选择。
按Valvekens等(1988)所述用pAT53转化阿布属根外植体(Nossen生态型)。
将15株含有UASG／最小CaMV 35S启动子／反义AdSS结构的转基因植物移植到土中，在温室中生长至成熟。将初级转化体的花与纯合GAL4／C1反式激活因子系pAT53-103的花粉杂交。F1代种子生长在含有50毫克／升卡那霉素的发芽培养基上。核酸分析按Lagrimini等(1987)所述，用酚／氯仿抽提、LiCl沉淀分离RNA。RNA凝胶印迹按Ward等(1991)所述进行。杂交探针采用PrimeTime试剂盒(International Biotechnologies，Inc．，New Haven，CT)用随机引物法用32P-dCTP标记。杂交条件是7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0．5M NaPO4(pH7．0)、1mM EDTA、1％牛白蛋白，65℃。杂交过夜后，用1％SDS、50mM NaPO4、1mM EDTA于65℃洗膜(Church和Gilbert，1984)。
权利要求
1．一种分析方法，其包括a) 将含有杂合转录因子基因的第一种稳定转化植株，其中所述杂合转录因子基因编码的杂合转录因子在合成启动子存在于该植株中时可激活该合成启动子，而且对于该杂合转录因子而言该植株是纯合的；与b)含有可激活DNA序列和可被所述杂合转录因子激活的合成启动子的第二种稳定转化植株杂交，其中可激活DNA序列在杂合转录因子存在时可获得表达，所述杂交产生表达该DNA序列的F1植株；和c) 测定F1植株中该可激活DNA序列的表达效果。
2．权利要求1的分析方法，其中杂合转录因子基因编码酵母GAL4基因来源的DNA结合域和玉米C1基因来源的转录激活域。
3．权利要求1的分析方法，其中最小启动子选自CaMV 35S最小启动子、玉米Bz1启动子和UBQ3启动子。
4．权利要求1的分析方法，其中合成启动子序列包括5’末端融合了GAL4DNA结合域识别的上游激活序列10个串联拷贝的含TATA元件的CaMV35S最小启动子。
5．权利要求1的分析方法，其中杂合转录因子基因编码酵母GAL4基因来源的DNA结合域和玉米C1基因来源的转录激活域，并且其中可激活DNA结构含有含CaMV 35S最小启动子的合成启动子序列，该含有TATA元件的CaMV35S最小启动子5’端融合了GAL4 DNA结合域识别的上游激活序列10个串联拷贝。
6．一种鉴定AdSS除草性抑制剂的方法，其包括a)在植物AdSS酶功能的可疑除草性抑制剂存在时，将植物AdSS酶与AdSS底物进行反应；和b)将可疑抑制剂存在时AdSS酶反应速率与可疑抑制剂不存在时同样条件下的AdSS酶反应速率比较，以确定该可疑抑制剂是否抑制了植物AdSS。
7．含有杂合转录因子基因和可激活DNA结构的植物，其中所述杂合转录因子基因编码的杂合转录因子能激活可激活DNA结构的合成启动子以诱导可操作连接的反义DNA序列的表达，其中所述植物稳定转化了杂合转录因子和可激活DNA结构。
8．权利要求7的植物，其中杂合转录因子基因包含a)选自酵母GAL4基因、噬菌体434、lexA、lacI和λ噬菌体阻遏子的基因来源的DNA结合域；b)选自单纯疱疹病毒VP16、玉米C1和P1的基因来源的转录激活域；c)含有选自CaMV 35S最小启动子、玉米Bz1启动子和UBQ3启动子的最小启动子的可激活DNA结构。
9．权利要求7的植物，其中所述合成启动子序列包括5’端融合了GAL4DNA结合域识别的上游激活序列10个串联拷贝的含TATA元件的CaMV35S最小启动子。
10．权利要求7的植物，其中所述杂合转录因子基因编码来自酵母GAL4基因的DNA结合域和来自玉米C1基因的转录激活域，并且其中所述可激活DNA结构包含含有CaMV 35S最小启动子的合成启动子序列，其中该含TATA元件的CaMV 35S最小启动子5’端融合了GAL4 DNA结合域识别的上游激活序列10个串联拷贝。
11．权利要求7的植物，其中可激活DNA序列是AdSS反义序列。
全文摘要
在表达杂合转录因子的稳定转化植物中诱导目标DNA序列表达的物质和方法,所述杂合转录因子包括融合的DNA结合域和转录激活域,是合成启动子控制的目标DNA序列表达的效应物,所述合成启动子优选包含与一启动子融合的所述杂合转录因子DNA结合域识别的顺式作用位点的串联拷贝。
文档编号G01N33/50GK1280623SQ98811629
公开日2001年1月17日 申请日期1998年11月24日 优先权日1997年11月26日
发明者E·R·沃德, C·D·古耶, S·L·沃尔拉茨, J·格拉科 申请人:诺瓦提斯公司