一种用于荧光分析体系的组合物的制作方法

专利名称：一种用于荧光分析体系的组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于荧光测定的组合物。本发明进一步涉及一种荧光测定方法以及该组合物在荧光测定中的应用。荧光测定在测定和分析领域、尤其是在生物学中已经越来越多地使用。例如，酶免疫分析(EIA)，基于酶作为标记物的测定，已经在生物分析领域广泛地应用(T.Portmann和S.T.Kiessig，免疫方法杂志(J.Immunol.Method)(1992)，150，5，和M.Oellrich，J.Clin.Chem.Clin.Biochem.，(1989)，22，895)，这归因于EIA的高感度和确定性，许多酶标记物的可获得性，以及标记试剂长时间的稳定性和操作安全性。最常用的EIA的酶标记物为碱金属磷酸酶，辣根过氧化酶，和半乳糖苷酶。大部分的酶标记物由分光光度法(H.Labrousse，J.L．Guesdon，J.Ragimbeau，S.Avrameas，免疫方法杂志(J.Immunol.Method)(1982)，48，133)，分光荧光法(E．Ishikawa，Clin.Biochem.，(1987)，20，375)，化学发光法(H．Sasamoto，M.Maeda和A.Tsuji，Anal.Chim.Acta(1995)，306，161)和电化学[K.P.Wehemeyer，H．B.Halsall和W.R Halsall，Anal.Chem.，(1995)，31，1546]来测试。
碱金属磷酸酶作为EIA标记物已经广泛使用，并且在分光光度法中使用对-硝基苯磷酸酯(PNPP)[C.S.Chiang，T.Grove，M.Cooper等，Clin.Chem.(1989)，35，946]，在分光荧光法中使用4-甲基7-羟基香豆素磷酸酯(4MUP)，在化学发光法中使用金刚烷-1，2-二氧杂环芳基磷酸酯(AMPPD)及其衍生物(I.Bronstein，B.Edwards和J.C.Voyta，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)(1989)，4，99)，在电化学中使用苯基磷酸酯[K.R.Wehemeyer，H．B.Halsall，W.R.Volle和I.W.Chen，分析化学(Anal.Chem.)(1986)，58，135)和对-氨基苯基磷酸酯(PAPP)[D.A.Palmer，T.E．Edmonds和N.J.Seare，Analyst，(1992)，117，1679]作为被测试物。
碱金属磷酸酶的已知的荧光分析底物是4-甲基7-羟基香豆素磷酸酯和荧光黄二磷酸酯。这些底物(4-甲基7-羟基香豆素磷酸酯和荧光黄二磷酸酯)被碱金属磷酸酶水解，成为4-甲基伞形酮和荧光黄，分别在大约450nm和525nm发出荧光。萘并荧光黄磷酸酯(NFP)是以上提到的碱金属磷酸酶底物的一种替代，它有诸多优点。NFP被碱金属磷酸酶水解得到萘并荧光黄，其激发态分光光谱特征值为595nm，发射光谱的为660nm，明显落入到电磁波谱的长波长/近红外区域。在长波长区域工作的优点最近已经回顾(J.N.Miller，荧光光谱(Fluorescence Spectroscopy)，(1993)，5/2，34)。这些优点包括a)较低的背景散射性-Raman和Rayleighb)更少的光分解c)具有很少的明亮的荧光团，带来更少的背景荧光d)紧凑的亮光光源容易获得e)好的固态检测器。
最近我们的研究小组已经证实测试或使用碱金属磷酸酶可以通过使用萘并荧光黄磷酸酯，环糊精或表面活性剂和一种固态激光二极管检测器来确定。在荧光团领域发展的同时，检测器也相应地有所进展。
我们最近开发出一种检测装置，尤其是，使用荧光检测器来分析液流中的试样。我们这种新检测器其中的一个独特的优点是其对单一试样中多于一个荧光团进行分析的能力。这要求在一个试样中每个荧光团与检测器中的特定的激光相匹配，即最大吸收基本在激光的窄带宽的最大激发波长处。有许多荧光团可以与市售易得的激光相匹配，因而这样的荧光团的数目正在不断增多。
本发明的目的是提供一种用于荧光检测方法的新组合物。
本发明的第一方面是提供一种包含酶底物的组合物，这种酶底物是荧光团的一种非荧光衍生物，以及一种使自然状态下最大值为大于450nm的荧光团的最大吸收波长移动的移动试剂，移动试剂以一预定的量存在，以将该最大值移动到预设定值。
在将存在的荧光团与可获得的光源相匹配时，控制吸收最大值的能力大大增强了潜在的酶底物。最大值的移动值可以不同，一般通过改变组合物中移动试剂的量来改变。在这种方式中，分析含有匹配的荧光团的试样与分析不匹配的荧光团的试样相比更为简单，因为匹配荧光团的光谱更清楚。
优选地，荧光团选自由呫吨染料，聚次甲基菁染料(polymethinecyanine dyes)，酚噁嗪染料，噻嗪染料，藻胆蛋白组成的组，及其混合物。
许多这样的实例中荧光团是a)选自由荧光黄，萘并荧光黄和荧光黄，萘并荧光黄的荧光衍生物，其他呫吨染料，以及蒽类染料组成的组的呫吨染料；b)选自由Cy3，Cy5，Cy7和吲哚菁绿组成的组的聚次甲基菁染料；c)选自由尼耳蓝，尼耳红和噁嗪750组成的组的酚噁嗪染料；d)噻嗪染料为亚甲蓝；以及e)以上的混合物。
例如一些优选的呫吨染料如维它蓝和其它的荧光黄的荧光衍生物，在Lee，L.等，Cytometry 10151-164(1989)和Menchen，S.等的US5，188，934中有描述。
一般，在合适的溶剂中，例如在缓冲剂中，移动试剂的量少于10％w/v，优选地，移动试剂的量为该合适的溶剂的5％w/v以下。
移动试剂从以下组中选取有利环糊精，取代的环糊精，表面活性剂；去污剂；-(3-[(3-胆胺丙基)二甲基氨基]-1-丙烷磺酸酯(CHAPS)；-(3-[(3-胆胺丙基)二甲氨基]-2-羟基-1-丙烷磺酸酯(CHAPSO)；辛基-β-葡萄糖苷，辛基-β-吡喃硫葡糖苷；钠十二烷基硫酸盐(SDS)；以上的衍生物，和以上的混合物。
尤其优选的是底物是磷酸酯的衍生物和酯的衍生物，酰亚胺衍生物，酰胺衍生物或其它的可以与荧光团裂解的衍生物。
为了分析试样中的两种未知物，该组合物进一步包括一种第二底物，它包含第二荧光团的非荧光衍生物，其中，在移动试剂的存在下，第二荧光团的最大吸收波长与第一荧光团的最大值不同。第二荧光团的最大值可由移动试剂移动。
为了分析试样中的多种未知物(多组分-分析测定)，组合物包含多种底物，包括多种荧光团的非荧光衍生物，其中每种荧光团在移动试剂存在下的最大吸收波长与其它荧光团的最大值不同。在此情况下，相应的荧光分子中一些或每一种的最大值可以被移动试剂移动。
该组合物一般用于分析体系，该分析体系可以从所有使用酶分析的类型中选取，例如，从以下组中选取免疫分析，酶免疫分析，与酶相连的免疫吸附分析，和酶抑制分析。
优选地，分别提供该组合物，将第一荧光团的衍生物，和，如果有的话，其它荧光团的衍生物，以及移动试剂一起混合在将分析的试样中，或者在测试设备中。
依据本发明的第二方面，这里提供了一种测试试样中所要产物的方法，包括以下步骤a)将试样和一种底物、移动试剂混合，该底物是荧光团的非荧光衍生物，而该移动试剂是一种用来移动荧光团的最大吸收波长的试剂；b)使用一种光源产生指示索要产物的荧光光谱，其中光源在已知激发波长具有最大的强度，移动试剂以一预定的量存在，以将最大吸收波长移动到与已知激发波长基本上相一致。
一般，作为本发明第一方面的组合物将作为本发明第二方面的方法a)步骤中的移动试剂和酶底物。
有利地是步骤a)包括将试样与多种酶底物混合，每种底物是一种荧光团的非荧光衍生物，在移动试剂的存在下，每一种荧光团具有一个与其他荧光团或其他一些荧光团不同的最大吸收波长；步骤b)包括使用一种光源产生指示所要产物的荧光光谱，其中光源在多种已知激发波长具有最大的强度，这些波长分别与每一种荧光团的最大吸收波长相一致。
在优选的实施方案中，该方法用来测试多种所要的产物。
优选的光源是LED或低能量的激光二极管，因为它能提供窄带宽的激发态光束，避免需要使用滤光片，也可以使用经滤光的低于光源的能量来产生窄带宽。
优选地是，试样中另外所要的产物也被测试，其中步骤a)中合并了另外的酶底物，该酶底物是另外的荧光分子的非荧光衍生物。
依据本发明的第三方面，提供了在测试体系中移动荧光团的最大吸收波长的试剂的应用。有利地是，该试剂包括了本发明第一方面所定义的移动试剂。
本发明将参照随后的图进行描述，其中

图1描述了由萘并荧光黄合成萘并荧光黄磷酸酯的方法。
图2描述了萘并荧光黄二磷酸酯(A)和单磷酸酯(B)的纯化的图。
图3描述了萘并荧光黄(A)和萘并荧光黄(B)的吸收光谱图。
图4描述了(萘并荧光黄磷酸酯)(A-激发)和(B-发射)和萘并荧光黄(C-激发)和(D-发射)的激发和发射光谱；图5描述了时间对萘并荧光黄磷酸酯被碱金属磷酸酶水解的影响。
图6描述了碱金属磷酸酶在22℃作用25分钟后，由图2(A)和(B)得到萘并荧光黄产物的比较；图7描述了萘并荧光黄二磷酸酯和单磷酸酯由碱金属磷酸酶水解的顺序。
图8描述了三种碱金属磷酸酶底物的有效性。
图9描述了三种呫吨化合物；图10描述了萘并荧光黄在移动试剂(CHAPS 3％w/v)存在和不存在时的激发和发射光谱；图11描述了Cy5在移动试剂(CHAPS 3％w/v)存在和不存在时的激发和发射光谱；图12说明了使用本发明的方法同时筛选多种目标；图13说明了使用固态荧光检测器的一种典型标准曲线；图14描述了碱金属磷酸酶与不断提高的茶叶碱浓度的抑制作用；图15描述了使用研究级(research grade)荧光计的茶叶碱抑制作用分析的标准曲线；图16描述了使用固态荧光计的茶叶碱抑制作用分析的标准曲线；图17描述了一种流体注射装置；图18描述了图17显示的检测器的一个放大图；图19描述了图17和18设备的激光的时序控制；图20描述了图19荧光发射时获得的数据；图21描述了萘并荧光黄琥珀酰亚胺酯(NFSE)(A-激发，B-发射)和与白蛋白结合的NFSE的激发和发射光谱(C-激发，D-发射)；图22描述了萘并荧光黄琥珀酰亚胺酯(NFSE)(A-激发，B-发射)和与α-酪蛋白结合的NFSE的激发和发射光谱(C-激发，D-发射)；图23描述了萘并荧光黄琥珀酰亚胺酯(NFSE)(A-激发，B-发射)和与卵清蛋白结合的NFSE的激发和发射光谱(C-激发，D-发射)；图24描述了保温时间对萘并荧光黄-白蛋白结合物被碱金属蛋白酶水解成为萘并荧光黄琥珀酰亚胺的影响；图25描述了EDTA对萘并荧光黄-白蛋白结合物EDTA被碱金属蛋白酶水解成为萘并荧光黄琥珀酰亚胺的影响(37℃保温10分钟)。
在后面要描述的本发明的一个实施方案使用萘并荧光黄作为荧光分子。萘并荧光黄是可以在本发明中使用的荧光呫吨染料的一个代表。其他呫吨荧光团的实例是4，10-二溴萘并荧光黄和维它蓝(图9)。
萘并荧光黄的一个特别有优势的酶底物是以下将要描述的取代萘并荧光黄外部苯环的羟基所得到磷酸酯。
1)萘并荧光黄磷酸酯(NFP)的合成萘并荧光黄磷酸酯的合成依照Z.Huang，N.A.Olson，W.You和R.P.Haugland，免疫方法杂志(J.Immunol.Methods)(1992)，149，261对荧光黄所描述的步骤进行。反应步骤见图1。
方法在0℃氮气氛下向0.25mmol萘并荧光黄(0.1067g)中加入4毫升无水吡啶。在0℃氮气氛下向该溶液加入10.7mmol存在于4ml无水干燥的吡啶中的氯化氧磷(1ml)。反应混合物在30分钟以内变得完全，如同在TLC中显示的持续的点(用7∶1∶1∶1的乙酸乙酯∶甲醇∶水∶乙酸，NFP的Rf=0.2，萘并荧光黄的Rf=0.8)。倒入40ml的冷水，然后用氢氧化铵中和到pH=7.0，反应中止。吡啶用过量的氯仿萃取。水相被冷冻干燥。
使用Sephodex G-10用大约在100-700分馏范围的尺寸排阻色谱法(SEC)[Pharmacia提供]对萘并荧光黄磷酸酯纯化。可以观察到两个分辨良好的峰(图2)，很有可能是萘并荧光黄单磷酸酯(NFMP)和萘并荧光黄二磷酸酯(NFDP)。这些峰被收集并且冷冻干燥。250ml未纯化的NFP得到69.2mg怀疑是NFMP和89.1mg的NFDP，即总产率为63.3％。
NFP的特点a)结构红外光谱在1000-1500cm-1远红外(KBr)区域有磷酸酯的一个强吸收带，显示了磷酸酯的链接和多磷酸酯键的存在。
质谱质谱显示母离子在593区域，提供了结合成功的证据，即NFP已经生成。
b)光谱UV-VIS吸收光谱典型地，NFP水解前在大约500nm显示最大吸收峰，而水解后的最大吸收位置在600nm附近(图3)。
荧光光谱NFP是非荧光的底物。使用碱金属磷酸酶水解时，它能在660nm显示荧光(当在600nm激发时)。图4显示NFP和其水解产物萘并荧光黄的典型激发和发射图。
c)对NFP，NFMP，NFDP和4MUP(为了说明的目的，一种常规的碱金属磷酸酶荧光团底物)的酶的比较研究。
图5表明保温时间对萘并荧光黄磷酸酯被碱金属磷酸酶水解成萘并荧光黄的影响。NFMP，NFDP作为NFP的纯化部分其动力学参数被估计，并且和4MUP(一种作为碱金属磷酸酶的常规的荧光团酶底物)的相当的性能进行比较。
NFMP被发觉对碱金属磷酸酶来说与NFDP相比是更有效的底物(图6)。对该发现的一种可能的解释是NFDP水解经NFMP发生，因此需要更长的时间将所有的NFDP完全水解成萘并荧光黄(即水解是两个步骤的过程)，如图7所示。在三种被研究的底物中，对于碱金属磷酸酶而言，发现4MUP是比NFMP或NFDP更好的酶底物(图8)。4MUP比NFMP和NFDP具有更快的初始反应速度。对4MUP，NFMP和NFDP来说，每ng碱金属酶每分钟形成的产物的量分别是0.36，0.038和N/A。
以上提到的酶底物的Michaelis Menten常数(Km)(作为底物效率的指示)被确定。底物的Km值越小，作为底物的效率越高。发现4MUP、NFMP和NFDP的Km分别为0.092，0.22mM和N/A。虽然4MUP的酶动力常数比NFMP和NFDP的有优势，但NFMP适合用作在酶测试中的底物。而NFDP因为其水解包括两个步骤(图7)而受到影响。
其它的呫吨荧光团可以类似地被磷酸化。例如4，10-二溴萘并荧光黄，维它蓝和图9所示的蒽衍生物能够被磷酸化而形成非荧光化合物(底物)，当用碱金属磷酸酶水解后能发荧光。蒽衍生物能够用类似图1所示的方法来制备，并且对于4，10-二溴萘并荧光黄，维它蓝也相似。蒽衍生物一般被衍生或者通过常规技术，使之在水性介质中更易溶解。
移动试剂对环糊精，去污剂和表面活性剂对一些基于蒽的荧光团(萘并荧光黄和二溴萘并荧光黄)的荧光强度的影响的研究，导致发现了在一些环糊精和表面活性剂的存在下这些化合物的吸收波长进一步移动到电磁波的红端。
已经发现有用的移动试剂包括环糊精，取代环糊精；表面活性剂；去污剂；-3〔(3-胆胺丙烷)二甲基胺)-1-丙烷磺酸酯(CHAPS；)-3((3-胆胺丙烷)二甲基胺)-2-羟基-1-丙烷磺酸酯(CHAPSO)；辛基-β-葡糖苷；辛基-β-吡喃硫葡糖苷；十二烷基硫酸钠(SDS)；或其衍生物。
以不同浓度使用一定范围的环糊精，表面活性剂和去污剂，发现呫吨荧光团的吸收和发射波长移动了4和46nm，如表1和2以及图10所示。(0.1M氢氧化钠代表对照)。
萘并荧光黄琥珀酰亚胺酯(NFSE)与白蛋白，卵清蛋白，α-酪蛋白的结合，导致萘并荧光黄的吸收、激发和发射波长移动到电磁波谱的红端。萘并荧光黄一般具有600nm的最大吸收和激发波长，以及660nm的最大发射波长。白蛋白，卵清蛋白，α-酪蛋白与萘并荧光黄结合，其吸收、激发和发射波长的移动显示在表3及图21-23中。这种红移现象与和萘并荧光黄一起使用环糊精，去污剂和表面活性剂时观察到的现象类似。萘并荧光黄蛋白结合物的过多的标记导致萘并荧光黄的荧光的淬灭。用特殊的酶处理的结合物能够使得萘并荧光黄结合物的荧光重新产生，这是因为蛋白被裂解成为更小的萘并荧光黄肽片断的缘故。因此将大过量标记的萘并荧光黄与白蛋白，卵清蛋白，α-酪蛋白的结合物(染料与蛋白的初始比例为50∶1和100∶1)用于HTS筛选分析的开发之中。
结果表1萘并荧光黄和4，10-二溴萘并荧光黄吸收波长的移动
表2萘并荧光黄的吸收和发射波长的移动
表3萘并荧光黄蛋白结合物的吸收和发射波长的移动
CHAPS同样被发现能够增强Cy5(一种基于花青素的荧光团，特征光谱是648nm激发峰和670nm发射峰)的荧光强度，增强因子大约为10。发现吸收/发射图由649nm到654nm的一个约5nm的较小的波长移动，以及发射图由664nm到671nm(图11)的约7nm的移动。
CHAPS，环糊精和其它类似的化合物移动萘并荧光黄和类似化合物的最大吸收的能力，提供了一种最大匹配窄带激光输出的方法，这样为分析提供了很清晰的光谱。这种匹配的荧光团尤其适用于与在1997年8月12日递交的英国专利申请9717021.1的关于多分析物荧光检测器中所描述的检测器一起使用，该专利申请的内容引入本文作为参考，并将在后面加以简要的描述。但是，本发明的组合物在任何一种用于检测特定物质存在的检测器中均可以使用。
优选的检测器设备图17描述了WO97/29376的一种流体注射系统中的多分析物检测器30的优选的实施方案的一些主要单元。如图18所示，控制单元34通过个人电脑或其它的装置与使用者界面相连。这种连接一般采用软件界面形式。在试样之间和/或在对每个试样进行测试之间，软件界面从使用者或者从检测器30的上游接收信息。控制单元依据获得的信息，操作检测器30的组件，下面将更详细地介绍。
在一些情况下，无论目标底物是否被探测到，即有任何或由于荧光团的存在而有多于一定量的荧光，定性测试可以较简单。
1．使用两个或更多的激发波长该体系提供了两个或更多的波长选择，优选地由激光二极管31提供。激光二极管与常规的激发光源相比具有以下的几个优点a．无需提供高能量，并且能量消耗低b．固定的波长和稳定的光输出c．数字控制的小型单元d．为波长选择的替换比较容易在该检测体系中，两个或更多的激光二极管31，32，33(或别的光源)作为激发光源使用，其中的每一个均由激光驱动器控制，产生如图19所示的连续间隔的光脉冲。当然对某些实施方案来说可能只需要一个激光器，例如只要测试单个分析物时。激光器排列起来，照射荧光分子(荧光团)可能存在的测试池27，得到的荧光发射被引导到传感器阵列35。选择这些荧光荧光团是因为它们所具有的光谱性能与特定的激光器的光谱性能相匹配，而且每个激光器31，32，33具有与至少一个特定的和单独的荧光团对象。在这个匹配过程中本发明尤其有优势。
脉冲速度可以通过一种可编程的微处理器或控制软件来计算并控制，这样激光驱动器的速度和脉冲的间隔时间与传感器阵列的需要相匹配，以捕捉由每个荧光团发出的荧光，进入合适的数据通道。激光器可以连续操作或一个激光在另一个激光操作后重复操作(脉冲)。
2．多通道时间选通方法使用脉冲激光源意味着传感器阵列35接收来自流动池27的脉冲光信号，其中包括来自流动池27中的荧光团的荧光，没有来自存在的任何其他分子的特定荧光，也没有来自激光源的任何散射光。在传统的荧光计中非特定或背景荧光连同散射光，通过使用滤光片或单色仪一起被去掉，或者被大大地减弱。这里描述的荧光计能够得到特定的荧光测定，而无需使用滤光片或单色仪。
被人们所熟知的是在近红外(NIR)区域(约600-900nm之间的区域)测定荧光有一个主要的优点这里有很少的内源的NIR荧光分子。因此从非特定的内源的荧光背景干扰大大降低。传统荧光计中从宽带激发光源发出的散射光经常是一个问题，因为为了获得最大测定敏感度，需要使用宽带通过框架，经常达到20nm。这样保证了最大量的光落在要被分析的试样上，但是代价是大大增加的Rayleigh散射，常常会将特定的荧光信号淹没。使用激光二极管光源，可以在很窄的带宽(2-4nm)发出大量的光，因而减少了在短光谱范围中Rayleigh散射的影响。进一步地，该散射信号的强度随着波长4次方的倒数变化，因此在NIR区域操作大大减少了散射光的量级。尽管在NIR区域工作有优势，一些非特定的信号仍然被传感器探测到，包括一些其它的荧光团共激发发出的信号，因此一种多通道时间选通方法(MCTG)与传感器阵列一起使用，来选取所感兴趣的荧光。使用MCTG从每个激光脉冲发出的荧光信号由传感器35收集，并且存储在为激光器31设置的特定的数据通道中。通过这种方式，两个或更多个从该测试池中的两个或多个的荧光团发出的发射脉冲，能够被如果需要的两个或多个的激光二极管的使用所控制。每个激光二极管31，32，33轮流发出脉冲，用匹配的光谱性能连续地激发荧光团。每个激光脉冲具有其自身的特定间隔时间，并且具有相关的发射脉冲。因此对特定激光产生的发射脉冲进行时间选通，导入到数据获取的通道，并且反馈数据来控制传感器阵列是可能的。
通过这种方式，荧光测定可以如下地进行。对所有过程全部的时间选择由系统的时钟控制(图20a)，在给定的时间频率激光1点燃具有确定时间和强度的光脉冲(图20b)。荧光团1依据其浓度以一定强度与类似的时间段的荧光响应(图20c)。另一对激光/荧光团以类似的方式(图20d-20h)顺序操作，并且发射脉冲从传感器采集进入到它们的相应的数据通道中(图20i)。为了消除不同荧光衰减的影响，数据收集在激光脉冲结束前分级停止。
除了可以以连续脉冲方式使用激光器之外，还可以以等幅波方式驱动这些激光器，其中每一个激光器连续操作，并且在样品整个被测试时间照射样品。如果两个或更多的激光以该方式操作，并且与合适的荧光团匹配，这样才能对于每个激光源有可识别的荧光反应，然后可以进行多分析物测量。使用检测器将得到一种光谱，其中，例如，三种荧光团的激发峰1，2，3是荧光团被固定波长的激光1，2，3分别激发后发射形成的。发散的激光为了清楚起见已经省去。混合的激光信号现在可以以两种方式处理，第一种是如下面在评价脉冲发射信号时所述的方式，其中可以使用多变量分析软件以产生纯的发射光谱。另一种方法是传感器可以设计为在对每一个标记物设定的即△λ1，△λ2，△λ3，特定的窄的波长范围收集数据，这样避免了散射光，并且每个峰的强度代表了在溶液中的荧光强度，可以用强度来进行定量测量。
使用等幅波长的激光和二维CCD检测器和光谱仪来采集从两个或多个激光二极管的荧光光谱，可以提供脉冲激光的一种替代方案。使用取自流动池不同部分的荧光信号的光纤偶合，可以在空间上实现在光谱仪输入方面对检测器的时间选通，即，光谱分离。液体光导提供了一种偶合的替代方式，因为与光束相比它们具有更高的光通量。
虽然优选地是使用单独的光源，也可以使用滤光片，仅允许所需要的荧光团的发射波通过。不同波长的滤波片可以用来调整激发光，同样也可以用于发射的荧光。但是，改变的或者固定的滤光片与单独光源相比不是优选的，因为用来产生同样程度的信号时需要更多的能量。
3．波长在用来数据采集的传感器阵列器件上的色散从流动池发出的荧光发射为一个很宽的光谱范围，因此需要将光谱色散到传感器阵列上的器件。一种优选的方式是将荧光发射的脉冲聚焦到多色仪然后在传感器阵列35上进行色散，以显示其发射光谱。另外一种方式是使用单色仪，快速地扫描发射光束，这样在传感器上产生发射光谱。因为每种荧光团的光谱性能已知，将一种纯的参照样品首先对用于每一种激光/荧光团对的传感器阵列进行波长校正，并且光谱数据存储在计算机的相关数据通道中。当进行样品测量时，在数据通道中收集到的发射图可以与预想的图形进行分析研究，多变量分析软件用来去除非特定的组分，包括由荧光团共激发形成的那些重叠光谱。传感器阵列35可以设计为对每种标记物的特定的窄波长范围进行数据采集，并且每个信号的强度表明了在溶液中荧光的强度，可以用该强度进行定量测量。
对于该应用优选的是使用高感度和快速的传感器来捕捉在流动池中溶液发出的荧光。一种合适的传感器是CCD光电器件，可以以一种快速的自扫描方式操作，以优异的信噪比特性量化地捕捉到发射的光子，这主要是由于在器件中存在着很低的暗电流。CCD有其自身的驱动组件，通过该驱动组件，扫描时间可以设定到与发射脉冲的速度相匹配。控制装置包括一种可编程的微处理器，以及一种对从传感器阵列得到的数据进行数字控制的界面。
另外的一种可能的方式是，使用可调谐的滤光片，如一种声光调谐(acousto-optic)滤光片，替代光谱仪。单个的检测器单元如光电倍增管或光检测器可以替代CCD阵列。在此情形，使得光源脉冲，然后对荧光光谱按顺序聚集是通常做法，方式是在数据存储器件的不同的数据通道之间转换检测器的输出，同时系统时钟与电压的斜波器(ramp)(例如，示波器，瞬时数字交换器，多通道自动计数器)同步驱动调谐滤光片。合适的调谐滤光片可以从Brimrose Corp.购得。制造这样的设备可以比CCD为基础的系统少一些花费。或者，滤波器可以被切换。
检测器可以用来分析在比色杯中或其它的固体支持体上的测试的样品。但是当本发明的检测器用作如1997年2月6日申请的、要求为1996年2月9日的优先权的国际专利WO97/29376所描述的流体分析系统的检测器时(其内容这里引入作为参考)尤其有优势，尤其是与流体分析系统相关的类型可以优选地采纳。可以溶解在水相介质中的本发明的组合物在流体系统的这种类型尤其适用。
实施例1由于萘并荧光黄在5％w/v CHAPS存在时最大的吸收为约630nm，可以使用635nm的激光二极管作为激发光源进行测定。同样可能使用如上已经描述了的端点检测系统与萘并荧光黄磷酸酯结合，进行碱金属磷酸酶的测试，同样也可用免疫分析法和酶抑制测试方法进行许多分析，例如茶叶碱分析。该方法另外的一种重要的应用是在组合法生成的化合物的筛选领域，以分析它们对与某些疾病状态相关的酶或受体的作用。
结论以下的数据是使用一种手提式固态长波长荧光检测器得到的。荧光检测器由一种2mW的635nm的激光二极管光源(PowerTechnology Ltd.)，RS Components Ltd.的一种高速、大面积的硅光二极管，一种在635nm具有透过率10％，在680nm为88％的Optosigma短波截止滤光片(D50.8/WL640)，一种低噪音线性放大器和各种组成材料而构成。检测器的输出用数字万用表以毫伏进行测量。萘并荧光黄溶液在有或没有2％w/v CHAPS和羟丙基-β-环糊精时的输出显示在图13中。
实例应用制药公司的一个主要的活动是寻找治疗感染后有很长潜伏期的RNA-病毒例如人类免疫缺乏病毒(HIV)的药物。逆转录酶抑制剂是成功地用来治疗艾滋病的第一组化合物中的一种。最初的筛选分析被开发用来测试大范围的已经开发的用来治疗艾滋病的候选药物对这种酶的抑制作用。正在由British Biotechnology Plc开发的Marimastat，一种癌症的治疗药，正在考虑通过抑制某些金属酪蛋白酶来抵御多种类型的癌症(例如胰腺癌)。
可以使用上述的端点检测系统与上面已经提及的萘并荧光黄磷酸酶，以及其它的潜在长波长的酶底物(图9)结合对组合法生成的化合物进行高通过量的筛选(HTS)。HTS可以采取接受器结合测试法，ELISAS和酶抑制方法的形式。另外的应用是在传统的酶底物测试法中使用。
两种使用萘并荧光黄的基于药物或其他分析物对酶的抑制作用的筛选分析模式将在以下进行描述。在第一个实施例中，碱金属磷酸酶是酶，萘并荧光黄磷酸酯是酶底物，茶叶碱是酶抑制剂。在第二个实施例中，碱金属蛋白酶是酶，萘并荧光黄-白蛋白是结合物，EDTA是酶抑制剂。
一种实例性的方法100μl的NFMP(50μlg/ml)被加入到20μl的碱金属磷酸酶中(10μlg/ml)，使用0.05M、pH为9.1、含有2％w/v的CHAPS的Tris缓冲液使体积达到2ml。混合物在22℃保温20分钟。使用一种光谱范围是650-840nm、激发单色器设在635nm处(即，在CHAPS存在时萘并荧光黄的最大激发)的常规研究荧光计对水解产物萘并荧光黄产物的荧光光谱进行测定。以上的过程在保温的混合物中在茶叶碱的治疗范围引入不同的量时重复进行。茶叶碱对碱金属磷酸酶活性的抑制作用显示在图14中。一个在茶叶碱治疗范围的标准曲线显示在图15中。
在使用以上和国际专利申请号PCT/GB98/02394中也已经描述的固体检测器时，重复以上的分析法。结果显示在图16中。
这种抑制分析测试方法可以在HTS模式中使用，用于筛选几十种或上百种潜在的同时抵抗多种酶的药物。采用其最简单的方式可以筛选出抵抗与不同疾病状态相关的多种酶的使用精确构效关系(SAR)组合法生成药物。每种酶具有一种特定的酶底物，其荧光性能与萘并荧光黄磷酸酯类似，例如是非荧光物，但是一种特定的酶将其水解后能够得到一种发出长波长荧光的产物(最大激发/发射波长大于635/680)。例如如果一种药物用四种酶筛选，并且每种酶的水解产物在光谱上与下一个分开，就有可能使用在专利PCT/GB97/00334描述的流体注射的多分析物检测系统的一种略微改变的结构，图17为筛选对四种酶具有抑制作用的药物。每种酶的水解产物的最大激发波长必须与可以获得的二极管激光器的操作波长相匹配。使用图12方案和图17到19设备的典型方法将在下面描述组合法制备的潜在的药物将被装在2中，同时将目标分子固定在珠子上或在溶液中(如酶)，它们的底物装在3内的不同的间隔间中。载体缓冲剂由蠕动泵驱动，装在1中。因为与某些疾病状态有关联的目标分子、受体和酶一般都是很有限的供应，将这些试剂固定在珠子上更加经济。
涉及一种药物和4种不同的酶的筛选规程的初始化导致从2中将已知体积的潜在的药物引入到载体流中。同时四种已知体积的固定在珠子上的酶的混合物从3引入到载体流中。然后将来自2和3的试剂合并，并且在4中完全混合。在此间隔之后，已知体积的酶的特异底物将在A从3引入，与药物-酶混合物合并。最终得到的潜在的药物-酶-底物混合物将在5中保温一段固定的时间，在此之后流体将转向到隔离板6。基于药物的作用将发荧光的酶水解产物将通过阻挡器6流向流动池8，到荧光检测器9上，同时包含固定酶的珠子将被保留。然后，用从7流出的洗涤溶液洗涤这些珠子。从酶产物得到的荧光强度将指示潜在药物在所研究的特定的酶上的作用。药物对酶的抑制作用将导致酶活性降低(即，很少的或无荧光)，同时酶的活性由药物增强，导致荧光信号的增强。使用以上的规程可以同时筛选出一批具有一种或多种潜在药物的一些酶和其它的目标分子，如图12的图所示。设想的是酶互相之间以及与其它的酶底物不发生干扰。
最近使用的相反的方案是一次筛选所限定的成千上万或数万的评价低的潜在药品相对于一种酶/受体的活性。使用Kalibrant的技术有可能筛选出和或对于一组与特定疾病或各种不同疾病状态相关的酶的上百的评价好的潜在药物。
所述的使用萘并荧光黄和萘并荧光黄磷酸酯的筛选过程可以在使用4，10-二溴萘并荧光黄，维它蓝和与其相应的磷酸酶下进行。萘并荧光黄和4，10-二溴萘并荧光黄的最大吸收/激发将分别被CHAPS移动40和46nm。因此，与4，10-二溴萘并荧光黄一起使用655nm的激光二极管是可能的。例如如果维它蓝的最大吸收/激发将被移动相当的量，即从633nm到约679nm，与该荧光团一起使用670nm的激光二极管也是可能的。其它的萘并荧光黄，4，10-二溴萘并荧光黄，维它蓝底物可以用来筛选其它的酶，如酯酶，糖苷酶，肽酶/蛋白酶，激酶，硫酸酯酶。
实施例215μl的碱金属蛋白酶(0.57U/ml)加入到10μl的在pH值为9.6的碳酸盐缓冲液(浓度)的萘并荧光黄-白蛋白结合物中，使用相同的缓冲液，将体积增加到1.2ml。该混合物在37℃保温10分钟。由酶导致萘并荧光黄结合物水解所增加的荧光发射分别在激发和发射波长640nm和685nm处得以监测(见图4)。在另一次研究中，在酶中引入EDTA，则结合物反应混合物由酶产生的酶底物的水解减少。图5显示了一种典型的使用以上试剂和EDTA作为抑制剂的抑制作用的测试。其它酶和酶抑制剂已经与萘并荧光黄-白蛋白结合物进行了研究。这些包括a)蛋白酶K(酶)，三氨基苯基硼酸，单水合物(蛋白酶K的抑制剂)b)胰凝乳蛋白酶(酶)，4-(2-氨基乙基)-苯磺酰氟化物盐酸盐(胰凝乳蛋白酶的抑制剂)。
可以将实施例2所述的测试过程程式化，在基于静态和流动的筛选中使用。尤其在基于流动的方法中使用这样的程式，在药物(由组合化学制作的)的HTS中测定相对与目标如受体和酶的活性。
权利要求
1．一种组合物，包括一种底物，该底物是一种荧光团的非荧光酶衍生物，以及一种移动试剂，该移动试剂用来移动自然状态下最大值为大于450nm的荧光团的最大吸收波长，移动试剂以一预定的量存在，以将该最大值移动到预设定值。
2．如权利要求1所述的组合物，其中，荧光团选自由呫吨染料，聚次甲基菁染料，吩噁嗪染料，噻嗪和藻胆蛋白组成的组，及其混合物。
3．如权利要求2所述的组合物，其中的荧光团是a)选自由荧光黄，萘并荧光黄和荧光黄、萘并荧光黄的荧光衍生物，其他呫吨染料，以及基于蒽类的染料组成的组的呫吨染料；b)选自由Cy3，Cy5，Cy7和吲哚菁绿组成的组的聚次甲基菁染料；c)选自由尼耳蓝，尼耳红和噁嗪750组成的组的酚呫吨嗪染料；d)噻嗪染料为亚甲蓝；以及e)以上的混合物。
4．如权利要求1到3之一的组合物，其中，在合适的溶剂，如缓冲剂中，移动试剂的量为小于10％w/v。
5．如权利要求4的组合物，其中移动试剂的量少于溶剂量的5％w/v。
6．如权利要求1到5之一的组合物，其中移动试剂选自由环糊精，取代环糊精；表面活性剂；去污剂；-(3-〔(3-胆胺丙烷)二甲基胺)-1-丙烷磺酸酯(CHAPS)；-(3-〔(3-胆胺丙烷)二甲基胺)-2-羟基-1-丙烷磺酸酯(CHAPSO)；辛基-β-葡糖苷；辛基-β-吡喃硫葡糖苷；十二烷基硫酸钠(SDS)；其衍生物；白蛋白，α-酪蛋白，卵清蛋白组成的组，及其混合物。
7．如上所述的任何一项权利要求的组合物，其中底物是磷酸酯的衍生物，酯的衍生物，酰亚胺衍生物，酰胺衍生物或其它可以与荧光团裂解的衍生物。
8．如上所述的任何一项权利要求的组合物，进一步包括一种包含第二荧光团的非荧光衍生物的第二底物，其中，在移动试剂存在下，第二荧光团的最大吸收波长与第一荧光团的最大值不同。
9．如权利要求8所述的组合物，其中，第二荧光团的最大值被移动试剂移动。
10．如权利要求8或9之一的组合物，包括包含多种荧光团的非荧光衍生物的多种底物，其中，在移动试剂存在下，每种独立的荧光团的最大吸收波长与其它荧光团的不同。
11．如权利要求10的组合物，其中的这个、某些或每个独立的荧光团的最大值被移动试剂移动。
12．如权利要求1到11之一的组合物，其中，组合物用在分析系统中。
13．如权利要求12所述的组合物，其中，该分析系统选自免疫分析，酶免疫分析，与酶连接的免疫吸附剂分析，和酶抑制分析。
14．如权利要求12或13所述的组合物，其中第一荧光团的衍生物，如果存在的其它的荧光团的衍生物和移动试剂与存在的试样一起混合分析或者在分析设备中进行分析。
15．一种分析试样中的所需的产物的方法，包含以下步骤a)将试样和底物和移动试剂混合，该底物是一种荧光团的非荧光酶衍生物，移动试剂用来移动荧光团的最大吸收波长；b)使用一种光源用于产生指示所需产物的荧光光谱，其中光源的最大强度在已知的激发波长处，移动试剂以将吸收波长的最大值移动到与已知的激发波长相匹配的预定量使用。
16．如权利要求15所述的方法，其中，权利要求1-14的任一项组合物形成步骤a)中的底物和移动试剂。
17．如权利要求15或16所述的方法，其中步骤a)包括将试样与多种底物组合，每种底物是一种荧光团的非荧光衍生物，在移动试剂存在下，每种荧光团的最大吸收波长与其它荧光团的不同；步骤b)包括使用一种光源用于产生指示所需产物的荧光光谱，其中，光源的最大强度在多种已知的波长处，这些波长与每种荧光团的各自最大吸收波长相匹配。
18．如权利要求17所述的方法，其中，该方法用于分析多种所需的产物。
19．如权利要求15-18之一的所述的方法，其中，光源是激光器或多个激光器。
20．如权利要求15-17之一的所述的方法，其中在试样中也分析了另外的所需产物，其中，另外的底物在步骤a)中被组合，该另外的底物是另外的荧光团的非荧光衍生物。
21．一种试剂在检测系统中使荧光团的最大吸收波长移动的用途。
22．如权利要求21所述的用途，其中，该试剂包括权利要求1-14之一所述的移动试剂。
23．一种如在此以前参照附图所描述的和/或如附图所示的组合物。
24．一种如在此以前参照附图所描述的和/或如附图所示的方法。
25．一种试剂在移动在此以前参照附图所描述的和/或如附图所示的荧光团的最大吸收波长的用途。
全文摘要
本发明涉及一种用于荧光测定的组合物,一种荧光测定方法以及荧光测定中一类新试剂的使用方法。该组合物包含一种底物,它是荧光团的非荧光衍生物,和移动试剂,该移动试剂使自然状态下最大值为大于450nm的该荧光团的最大吸收波长移动,该移动试剂可以一预定量存在,以将该最大值移动到预设定值。
文档编号G01N33/543GK1284170SQ9881343
公开日2001年2月14日 申请日期1998年12月15日 优先权日1997年12月24日
发明者德里克·阿迪米·帕尔默, 马丁·托马斯·弗伦奇 申请人:卡利布兰特有限公司