畜禽疫病快速诊断试纸条的制作方法

专利名称：畜禽疫病快速诊断试纸条的制作方法
技术领域：
本发明涉及畜禽疫病诊断器具，特别是涉及一种畜禽疫病快速诊断试纸条。众所周知，随着科学技术的不断发展和人民物质生活水平的不断提高，畜牧业的集约化经营、工厂化养殖蓬勃发展，大批的畜禽集中饲养，一旦传染病爆发和蔓延，将给养殖企业或公司造成巨大的危害和经济损失，轻者造成畜禽免疫力和生产性能(产蛋、产肉和产奶)下降及饲料报酬降低，重则大批畜禽死亡，造成养殖企业和公司的破产倒闭。我国每年因畜禽疫病造成的经济损失以百亿元计。对畜禽疫病的发生若不能及时确诊，采取控制和治疗措施，后果不堪设想，将严重影响畜牧业发展。
当前由于有关畜禽疫病病原高度变异，血清型众多，使许多疫病呈现新的流行特点，其症状及病理变化逐渐趋向非典型化，给疫病临床诊断带来较大困难，根据临床症状及病理变化难以进行确诊。目前，国内外采用的畜禽疫病诊断技术主要有琼脂扩散试验(AGP)，对流免疫电泳，病毒血清中和试验(VN)，酶联免疫吸附试验(ELISA)，免疫荧光抗体技术(IF)，SPA协同凝集试验，聚合酶链反应(PCR)和核酸探针等等。上述这些方法和技术虽然可以定性诊断畜禽疫病，但试验操作时间长、复杂，且需有关特定仪器设备及技能，有的甚至需要较昂贵的设备，如荧光显微镜、酶标仪及PCR仪等，常限于实验室内进行，很难在基层普及和推广，无法及时迅速做到确诊，有效控制疫病发展。事实上，我国目前对畜禽疫病临床诊断仍旧以临床症状及病理变化为主，很少人采用上述方法进行诊断或确诊，因需要相当的经验和技能，有时还不能确诊。抗体水平监测则仅在一些大型养殖场(厂)开展，并且仅能监控有限几种疫病，如鸡新城疫、鸡传染性法氏囊病等。
国内已研制成功旋毛虫病、鸡新城疫、鸡传染性法氏囊病等畜禽疫病ELISA快速诊断盒，用于检测上述有关疫病病原和其抗血清，其灵敏度分别比AGP高数十倍。这种诊断盒外包装一般为长方形纸盒，内装4-8条反应板，4种试剂及取样用的小塑料管。检测时需将待检样品用小塑料管加入反应板的各孔中，然后顺序以1、2、3、4号液进行反应，各反应程序需充分洗涤，显色反应需在2-3分钟内完成，并依显示颜色的深浅程度判定阴性或阳性结果，整个操作需10分钟。这种诊断盒对常规的ELISA检测规程作了一定的简化，具有相对简便，快速的特点，但尚未达到“一步法”的简便、快捷，且用颜色深浅判定阴、阳性结果，不够准确可靠，有时会出现假阴性和假阳性的错判结果。
本发明的目的是研制出适用于各种畜禽疫病快速诊断的系列试纸条，简便快捷，准确诊断各种畜禽疫病，成本低，操作简单，容易在临床推广应用。
本发明是这样实现的一种畜禽疫病快速诊断试纸条，含有支撑层，反应试剂载体吸附层，支撑层为不吸水薄片条，反应试剂载体吸附层粘贴在支撑层上，从样品端起依次为纤维层、吸附待测某种畜禽疫病相应的金标抗体(Wi)纤维层，纤维素膜层，手柄端为吸水材料层，用某种待测畜禽疫病标准抗原溶液(Xi)和用相应的某种畜禽疫病包被抗体溶液(Yi)分别在纤维素膜层上印制出阴性显示印迹“-”或“|”，和阳性显示印迹“|”或“-”。
不吸水支撑层薄片条可用硬质塑胶片条，或不吸水硬纸片条、纤维层可用玻璃棉，吸水材料层可用吸水纸，纤维素膜层可用硝酸纤维素膜，金标抗体纤维层可用金标抗体(Wi)玻璃棉，在玻璃棉，金标抗体玻璃棉及吸水纸层上覆盖有保护膜，阴性显示印迹和阳性显示印迹其组合可为“+”、“‖”、“＝”、
“”、
印迹，选用“+”、“‖”这两种组合印迹较好，在玻璃棉和金标抗体(Wi)玻璃棉交界处对应的保护膜偏向玻璃棉一侧约0.5cm处印制出标记线。
吸附有待测某种畜禽疫病金标抗体(Wi)玻璃棉，用某种畜禽疫病标准抗原(Xi)印制阴性显示印迹和用某种相应畜禽疫病包被抗体(Yi)印制的阳性显示印迹可为下列畜禽疫病中的一种口蹄疫(FMD)金标抗体玻璃棉，FMD标准抗原印迹和相应FMD包被抗体印迹，狂犬病金标抗体玻璃棉，狂犬病标准抗原印迹和相应的狂犬病包被抗体印迹，伪狂犬病金标抗体玻璃棉，伪狂犬病标准抗原印迹和相应伪狂犬病包被抗体印迹，猪瘟(SF)金标抗体玻璃棉，SF标准抗原印迹和相应SF包被抗体印迹，猪生殖和呼吸系统综合症(PRRS)金标抗体玻璃棉，PRRS标准抗原印迹和相应PRRS包被抗体印迹，马传染性贫血(EIA)金标抗体玻璃棉，EIA标准抗原印迹和相应EIA包被抗体印迹，牛病毒性腹泻—粘膜病(BVD-MD)金标抗体玻璃棉，BVD-MD标准抗原印迹和相应的BVD-MD包被抗体印迹，羊蓝舌病(BT)金标抗体玻璃棉，BT标准抗原印迹和相应的BT包被抗体印迹，鸡传染性法氏囊病(IBD)金标抗体玻璃棉，IBD标准抗原印迹和相应IBD包被抗体印迹，鸡新城疫病(ND)金标抗体玻璃棉，ND标准抗原印迹和相应ND包被抗体印迹，鸡马立克氏病(MD)金标抗体玻璃棉，MD标准抗原印迹和相应MD包被抗体印迹，鸡减蛋综合症(EDS)金标抗体玻璃棉，EDS标准抗原印迹和相应EDS包被抗体印迹，鸡传染性支气管炎(IB)金标抗体玻璃棉，IB标准抗原印迹和相应IB包被抗体印迹，鸡传染性喉气管炎(ILT)金标抗体玻璃棉，ILT标准抗原印迹和相应ILT包被抗体印迹，鸭病毒性肝炎(DVH)金标抗体棉，DVH标准抗原印迹和相应DVH包被抗体印迹，小鹅瘟(GP)金标抗体玻璃棉，GP标准抗原印迹和相应GP包被抗体印迹，禽流感(AI)金标抗体玻璃棉，AI标准抗原印迹和相应AI包被抗体印迹，炭疽金标抗体玻璃棉，炭疽标准抗原印迹和相应炭疽包被抗体印迹，大肠杆菌病金标抗体玻璃棉，大肠杆菌病标准抗原印迹和相应的大肠杆菌病包被抗体印迹，沙门氏菌病金标抗体玻璃棉，沙门氏菌病标准抗原印迹和沙门氏菌病包被抗体印迹，巴氏杆菌病金标抗体玻璃棉，巴氏杆菌病标准抗原印迹和相应巴氏杆菌病包被抗体印迹，布氏杆菌病金标抗玻璃棉，布氏杆菌病标准抗原印迹和相应布氏杆菌包被抗体印迹。
本发明的积极效果1、畜禽疫病快速诊断试纸条具有下列各项优点(1)特异性和敏感性好。快速诊断试纸条是以胶体金标记高亲和力的单克隆抗体为基础制备出来的，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无共价键形成，二者通过异性电荷的范德华力相结合，胶体金标记对单克隆抗体的特异性和亲和力影响很小，且具有较高的标记率。因此，快速诊断试纸条具有较高的特异性和敏感性。
(2)操作简便、快速。使用快速诊断试纸条无需其它任何试剂，只要将试纸条样品端插入待检样品5秒左右，在2分钟内即可检测出结果。
(3)显示判断结果形象、直观、准确。快速诊断试纸条以显“-”、“+”或“ |”、“‖”分别表示疫病阴性及阳性结果，这样显示与人们平常思维判断习惯相同，形象、逼真、直观、简单明了，准确，不会出现假阴性和假阳性错判。
(4)成本低，投资少。使用快速诊断试纸条，不需另配仪器设备，节约大量投资，成本低，操作极为简单，不需培训，人人都可操作使用。
(5)容易推广应用。易于在疫病发生地现场检测。
快速诊断试纸条，广泛适用于农村畜禽养殖个体户，大、中、小型养殖厂(或公司)，兽医站、防疫站及专业化化验室等各层次的需求，具有广阔的市场前景和较大经济、社会效益。


图1畜禽疫病快速诊断试纸条结构示意图(侧视结构)图2畜禽疫病快速诊断试纸条俯视结构示意图之一；图3畜禽疫病快速诊断试纸条俯视结构示意图之二。
实施例畜禽疫病快速诊断试纸条可广泛应用于多种畜禽疫病的临床快速诊断，如口蹄疫(Foot and mouth disease，FMD)，狂犬病(Rabies)，伪狂犬病(Pseudorabies)，猪瘟(Swine fever，SF)，猪生殖和呼吸系统综合症(Porcine reproduuive andrespiratory syndrome，PRRS)，马传染性贫血(Equine infection anemia，EIA)，牛病毒性腹泻—粘膜病(Bovine viral diarrhea-mucosal disease，BVD-MD)，羊蓝舌病(Blue tongue BT)，鸡传染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)，鸡新城疫病(Newcastle disease ND)，鸡马立克氏病(Marek′s disease，MD)，鸡减蛋综合症(Egg drop syndrome，EDS)，鸡传染性支管炎(Infections bronchitis，IB)，鸡传染性喉气管炎(Infectious laryngotracheitis，ILT)，鸭病毒性肝炎(Duck virus hepatitis，DVH)，小鹅瘟(Gosling plague，GP)，禽流感(Avianinfluenza，AI)，炭疽(Anthrax)，大肠杆菌病(CoIibacillosis)，沙门氏菌病(Salmonellosis)，巴氏杆菌病(Pasteurellosis)，布氏杆菌病(Brucellosis)等等。
要制出某种畜禽疫病快速诊断试纸条，首先要制出某种畜禽疫病的标准抗原，用于阴性显示印迹，进而制出相应的某种畜禽疫病的包被抗体用于阳性显示印迹和相应的畜禽疫病金标抗体(用于金标抗体纤维)。
(1)当前国内外对各种畜禽疫病的标准抗原(Xi)制备工艺大体分为三种(1.1)用细胞培养病毒制备某种畜禽疫病标准抗原(Xi)。
以含5％犊牛血清的PRMI1640培养基培养单层细胞，将病毒接种上述单层细胞，接种量为0.5-1.2ml，37℃吸附60-90min后倒去接种液，以Hanks缓冲液洗涤1次，加以含0.5％犊牛血清的细胞维持液于37℃5％CO2的培养箱中培养24-48h，收取病毒培养液，经超声处理或反复冻融三次后，6000-8000g离心30min，取病毒上清液加20-60％的密度梯度蔗糖溶液液面上，以50000-70000g离心3-5h，收取纯化的病毒条带，其蛋白浓度为10-30mg/ml，获得某种畜禽疫病毒标准抗原，以此种制备方式获病毒标准抗原的畜禽疫病有鸡传染性法氏囊病(IBD)，口蹄疫(FMD)，狂犬病，伪狂犬病，猪瘟(SF)，猪生殖和呼吸系统综合症(PRRS)，马传染性贫血(EIA)，牛病毒性腹泻—粘膜病(BVD-MD)，羊蓝舌病(BT)，鸡马立克氏病(MD)，鸡传染性喉气管炎(ILT)，鸭病毒性肝炎(DVH)，小鹅瘟(GP)、禽流感(AI)等。
(1.2)用鸡(鸭)胚培养病毒，获取某种畜禽疫病标准抗原(Xi)。
选取新鲜受精鸡(鸭)蛋，清除表面污物，用消毒液擦拭干净，然后置于38-39℃的孵化箱内孵化，相对湿度保持在60-70％，孵化9-10天后用于接种病毒。先将某种病毒用灭菌生理盐水作1∶10倍稀释成病毒液，将病毒液接种于9-10日龄发育良好的鸡(鸭)胚尿囊腔内，每胚接种0.1ml，接种后将蛋壳上的接种孔以石腊封好，将接种过的鸡(鸭)胚置于37℃孵化箱内继续孵化48-96h，照蛋并弃去死胚，在4℃冷却24h。将蛋壳的气室部位用碘酊消毒后，无菌打开气室部位的蛋壳，用小镊子撕去壳膜、绒毛、尿囊膜及羊膜，抽取鸡(鸭)胚尿囊液，经超声波处理或反复冻融三次后，6000-8000g离心30min，取病毒上清加于20-60％密度梯度蔗糖溶液液面上，以50000-70000g离心3-5h，收取纯化的病毒带，其蛋白浓度为10-20mg/ml，获得某种病毒标准抗原。以此种方式制备病毒性标准抗原的畜禽疫病有鸡减蛋综合症(EDS)，鸡新城疫病(ND)，鸡传染性支气管炎(IB)等。
(1.3)用细菌培养，以LB培养基培养细菌并从其中提取细菌蛋白，制备某种细菌性畜禽疫病标准抗原(Xi)。
挑选待培养的某种细菌单个菌落，接种于LB液体培养基中，37℃200r/min摇振培养16-20h，4℃3000g离心10-20min，取离心沉淀重悬于生理盐水中，以超声波破碎菌体，制得某种细菌标准抗原，其蛋白浓度为20-40mg/ml，以此种方式制备细菌性标准抗原的畜禽疫病有大肠杆菌病，炭疽病，沙门氏菌病，布氏杆菌病，巴氏杆菌病等。
(2)各种畜禽疫病包被用单克隆抗体(Yi)简称包被抗体(Xi)的制备方法用50μg-100μg/只的某种畜禽疫病标准抗原(Xi)，免疫BALB/C系小鼠三次，每次间隔15-30天，第三次加强免疫3-4天后，将小鼠眼球放血，拉颈致死，于75％酒精浸泡5-10min，无菌取其脾脏，剪碎并经100目尼龙网过滤，1000g离心10min，收集脾细胞，将1×108的脾细胞与2-5×107的NSO浆细胞瘤细胞混合，1000g离心10min弃上清，细胞沉淀于37℃水溶中缓缓加入0.7-1ml的40-50％的PEG4000(pH8.5-9.0)作用1min。然后缓慢加入无血清RPMI1640培养基15ml，以终止PEG的作用。37℃水浴5-10min，1000g离心10min弃上清，将细胞沉淀重悬于HAT选择培养基中，并加入96孔培养板(100μl-200μl/孔)，置37℃％CO2培养箱中培养7-10天后，以1∶500稀释某种标准抗原(Yi)包被酶标板(40孔/块)，以酶联免疫吸附试验(ELISA)检测杂交瘤的培养上清，选取强阳性细胞克隆(OD492＝0.8以上)，进行连续三次的有限稀释法克隆化，所生产的杂交瘤细胞染色体数为92-98，其分泌的单克隆抗体特异地与相应的某种畜禽疫病的标准抗原蛋白反应，而不与其它无关蛋白发生交叉反应，亲和力常数达109-10，轻链亚型为κ或λ，重链亚型为IgG1，IgG2a，IgG2b或IgG3，形成针对某种畜禽疫病标准抗原特异抗原决定簇的包被单克隆抗体，用于快速诊断试纸条的阳性显示印迹，即包被抗体印迹，此种制备方法适用于任一种畜禽疫病包被抗体的制备。
(3)某种畜禽疫病金标记抗体(Wi)和金标抗体(Wi)玻璃棉的制备。
以柠檬酸钠还原法制备金溶胶，即在沸腾的50-100ml0.01-0.05％氯金酸水溶液中加入2-4ml的0.5-2％柠檬酸三钠溶液，获得直径为15nm左右的胶体金，以0.1mol/LK2CO3调胶体金pH至8.5-9.5，以1∶1000-1∶3000的标记比将待标记的某种畜禽疫病的单克隆抗体(Yi)加入pH8.5-9.5金溶胶中，标记10min后，加20％PEG10000至终浓度0.05％，4℃1500-3000g离心20min，除去未结合的金颗粒，4℃15000g离心1h，弃上清，获得初步纯化金标蛋白质混合物后，用丙烯葡聚糖S-400柱层析，分离纯化金标蛋白质，获得某种畜禽疫病胶体金标记抗体，将1∶100-1∶500稀释的胶金标记抗体吸附在精制玻璃棉中，干燥，制得某种畜禽疫病病金标抗体(Wi)玻璃棉，本制备方法适用于任何一种畜禽疫病金标抗体棉的制备。
(4)畜禽疫病快速诊断试纸条实施结构参见图1，2，3，图中，1为支撑层用不吸水薄片条，实施中可采用塑胶薄片条或采用不吸水的硬质纸片材，反应试剂载体吸附层由2，3，4，5，组合而成，从样品端2开始，到手柄端5依次粘贴在支撑层1上面，其中2为样品端纤维层，实施中可使用玻璃纤维棉简称玻璃棉，3为吸附有某种畜禽疫病金标抗体(Wi)纤维层，可采用精制玻璃纤维棉，简称为(Wi)金标抗体棉，4为纤维素膜层，实施中可采用硝酸纤维素膜，5为手柄端吸水材料层，采用吸水纸，如滤纸或其它吸水纸均可，试纸条总长8cm，宽度0.4cm，6为用某种畜禽疫病标准抗原(Xi)在纤维素膜上制出阴性显示可印迹“-”或“|”，7为用某种畜禽疫病包被抗体(Yi)在硝酸纤维素膜上阳性显示印迹“|”或“-”，阴性显示印迹6和阳性显示印迹7可组合为“+”或为“‖”，或为“＝”，或为
、或为
、或为“”、或为
。选用“+”最好，或选用“‖”也很不错。
8为保护膜，覆盖在玻璃棉及金标抗体(Wi)玻璃棉的保护膜为8-1，覆盖在吸水层滤纸上的保护膜为8-2。在玻璃棉和金标抗体(Wi)玻璃棉交界处对应位置的白色保护膜上偏向玻璃棉一方0.5cm处的保护膜上印有一条标记线9，在9线右边印有箭头并印有max字样，手柄端保护膜可用黄色或其它颜色，2，3，4，5各层彼此之间交界处纤维互相交叉渗透。
(5)畜禽疫病快速诊断试纸条实施诊断反应原理当试纸条样品端插入待检测样品溶液后，待检溶液通过虹吸带动某种畜禽疫病病原及金标抗体棉中的金标抗体(Wi)一起向纤维素膜扩散，并最终渗透到滤纸层中，在扩散过程中Wi(某种金标抗体)与Xi(某种畜禽疫病检测抗原)相结合，形成抗原—金标抗体复合物，该复合物又可与印迹于纤维素膜层上包被抗体Yi相结合，在抗体中生成红棕色“|”标记，部分未与包被抗体结合的金标抗体与在纤维膜上的标准抗原相结合，生成红棕色标记“-”或“|”，两种标记互相组合叠加结果，形成阳性显示“+”或“‖”，反之只有金标抗体和标准抗原相结合，没有抗原—金标抗体复合物和相应包被抗体相结合，则生成单一的阴性显示标记“-”或“|”如果试纸条检测结果，既无阴性显示标记“-”或“|”，也无阳性显示标记“+”或“‖”，证明试纸条已失效。
(6)畜禽疫病快速诊断试纸条实施例检测方法。
检测样品液的制备，检测鸡传染性法氏囊病(IBD)取病鸡法氏囊组织为病料，鸡减蛋综合症(EDS)取病鸡卵巢和输卵管为病料，其它畜禽疫病可取畜禽的血液或粪便或扁桃体或其它病料，心、肝、脾、肾及肺等内脏组织。先将可凝病料剪碎研磨，制成1∶10的待检样品溶液。
将相应的畜禽疫病快速诊断试纸条样品端插入样品溶液中，约几秒，插入深度不要超过标记线9，取出诊断试纸条后，水平放置，约2分钟观察结果。
结果判断如果在纤维素膜上有红棕色“+”或“‖”标记显示，则表明为阳性，证明所检畜禽患有某种疫病如果硝酸纤维素膜上只有红棕色“-”或“|”标记显示则表明为阴性，证明畜禽未患所检疫病，如果没有标记显示，则表明试纸条失效。
实施例一，鸡传染性法氏囊病(IBD)快速诊断试纸条，参见图1，2，3，首先按实施例中(1.1)或(1.2)方法步骤制备IBD标准抗原X1，按实施例中(2)方法步骤制备IBD包被抗体Y1，按实施例中(3)方法步骤制备IBD金标抗体(W1)和金标抗体(Wi)棉。
图中，1为塑胶薄条，做为支撑层，2为玻璃棉(样品端)即纤维层，3为吸附有IBD金标抗体(W1)的玻璃棉，即吸附有金标抗体W1的纤维层，简称IBD W1棉，4为纤维素膜，本实施例选用硝酸纤维素膜，5为滤纸(手柄端)，即吸水材料层，2，3，4，5从左至右依次粘贴在塑胶薄条1上，6为印制在硝酸纤维素膜4上的IBD标准抗原(X1)印迹“-”或“|”，7为在硝酸纤维素膜4上的IBD包被抗体(Y1)印迹“|”，两种印迹组成“+”字，或“‖”式样，8-1为白色保护膜，覆盖在玻璃棉2和IBD金标抗体W1棉3上，在2和3交界处对应保护膜8-1位置上偏玻璃棉一方约0.5cm处印有标记线9，9的右边印箭头及max字样，滤纸5(手柄端)上有黄色保护膜8-2。
检测病鸡是否患IBD使用IBD快速诊断纸条，先取病鸡法氏囊，或脾、肾，剪碎研磨，制成1∶10的待检样品溶液，将IBD诊断试纸条样品端插入待检样品溶液，插入深度不能超标记线9，约5秒钟后取出，试纸条水平放置，2分钟后，即可观察检测结果，如果在硝酸纤维素膜上显示“+”或“‖”的红棕色标记，表示阳性，表明鸡患IBD，如果硝酸纤维素膜4上显示“-”或“|”的红棕色标记，表示阴性，表明鸡不患IBD，如果素膜4上不显示标记，表明该试纸条已失效。
实施例二，鸡减蛋综合症(EDS)快速诊断试纸条。参见图1，2，3，制备EDS金标抗体W2棉(即W2棉)，EDS标准抗原X2，EDS包被抗体Y2的方法步骤与实施例一类同，1，2，4，5，，8-1，8-2，9标号同实施例一，不重述。3，6，7与实施例一有点不同。在本实施例中，3为EDS金标抗体(W2)棉，6为EDS标准抗原(X2)印迹“-”或“|”，7为EDS包被抗体(Y2)印迹“|”，两印迹组合或“+”或“‖”。
病料取病鸡卵巢，或泄殖腔，或粪便，剪碎研磨制取1∶10样品溶液。检测及观察结果，同实施例一，不重述。
实施例三，鸡新城疫病(ND)快速诊断试纸条，参见图1，2，3，制作方法、结构、检测、观察结果与实施例一类似，不重述，有些不同是2为ND金标抗体棉(即W3棉)，6为ND标准抗原(X3)印迹，7为ND包被抗体(Y3)印迹。病料取病鸡的心、肝、脾、肾、肺中一种剪碎研磨，制取样品溶液。
实施例四，鸡马立克氏病(MD)快速诊断试纸条，类同实施例一，不重述。有点不同的是，2为MD金标抗体(W4)棉，6为MD标准抗原(X4)印迹，7为MD包被抗体(Y4)印迹。病料样品溶液取病鸡内脏器官或神经制取。
实施例五，鸡传染性支气管炎(IB)快速诊断试纸条，类同实施例一，不重述。有点不同的是2为IB金标抗体(W5)棉，6为IB标准抗原(X5)印迹，7为IB包被抗体(Y6)印迹。病料溶液取鸡肺，气管，渗出物制取。
实施例六，鸡传染性喉气管炎(ILT)快速诊断试纸条，类同实施例一，不重述。有点不同的是，2为ILT金标抗体(W6)棉，6为ILT标准抗原(X6)印迹，7为ILT包被抗体(Y6)印迹。病料样品溶液取鸡喉头，气管粘膜，分泌物制取。
实施例七，鸭病毒性肝炎(DVH)快速诊断试纸条，类同实施例一，不重述。有点不同的是，2为DVH金标抗体(W7)棉，6为DVH标准抗原(X7)印迹，7为DVH包被抗体(Y7)印迹。病料样品溶液取病鸭肝脏制取。
实施例八，禽流感(AI)快速诊断试纸条，类同实施例一，不重述。有点不同的是，2为AI金标抗体(W8)棉，6为AI标准抗原(X8)印迹，7为AI包被抗体(Y8)印迹。病料样品溶液取病禽内脏器官制取。
实施例九，小鹅瘟(GP)快速诊断试纸条，类同实施例一，不重述。有点不同的是，2为GP金标抗体(W9)棉，6为GP标准抗原(X9)印迹，7为GP包被抗体(Y9)印迹。病料样品溶液取病鹅脾，胰，肝制取。
实施例十，炭疽快速诊断试纸条，类同实施例一，不重述。有点不同的是，炭疽标准抗原X10采用实施例中(1.3)用细菌培养方法制备，2为炭疽金标抗体(W10)棉，6为炭疽标准抗原(X10)印迹，7为炭疽包被抗体(Y10)印迹。病料样品溶液取病畜血液，渗出液制取。
实施例十一，大肠杆菌病快速诊断试纸条，类同实施例十，不重述。2为大肠杆菌病金标抗体(W11)棉，6为大肠杆菌病标准抗原(X11)印迹，7为大肠杆菌病包被抗体(Y11)印迹。病料样品溶液取病畜禽血液或内脏组织制取。
实施例十二，沙门氏菌病快速诊断试纸条，类同实施例十，不重述。有点不同的是，2为沙门氏菌病金标抗体(W12)棉，6为沙门氏菌病标准抗原(X12)印迹，7为沙门氏菌病包被抗(Y12)印迹。病料样品溶液取病畜禽血液，内脏器官，粪便制取。
实施例十三，巴氏杆菌病快速诊断试纸条，类同实施例十，不重述。有点不同的是，2为巴氏杆菌病金标抗体(W13)棉，6为巴氏杆菌病标准抗原(X13)印迹，7为巴氏杆菌病包被抗体(Y13)印迹。病料样品溶液取病畜禽的心，肝，脾，体腔渗出物。
实施例十四，布氏杆菌病快速诊断试纸条，类同实施例十，不重述。有点不同的是，2为布氏杆菌病金标抗体(W14)棉，6为布氏杆菌病标准抗原(X14)印迹，7为布氏杆菌病包被抗体(Y14)印迹。病料样品溶液取病畜禽的胎儿、胎衣(流产)制取。
实施例十五，口蹄疫(FMD)快速诊断试纸条，类同实施例一，不重述。有点不同的是，2为FMD金标抗体(W15)棉，6为FMD标准抗原(X15)印迹，7为FMD包被抗体(Y15)印迹。病料样品溶液取病畜禽的水疱皮或水疱液制取。
实施例十六，狂犬病快速诊断试纸条，类同实施例一，有点不同的是，2为狂犬病金标抗体(W16)棉，6为狂犬病标准抗原(X16)印迹，7为狂犬病包被抗体(Y16)印迹。病料样品溶液取病犬脑组织，唾液腺制取。
实施例十七，伪狂犬病快速诊断试纸条，类同实施例一，不重述。有点不同的是，2为伪狂犬病金标抗体(W17)棉，6为伪狂犬病标准抗原(X17)印迹，7为伪狂犬病包被抗体(Y17)印迹。病料样品溶液取病犬脑组织，扁桃体，胎儿(流产)制取。
实施例十八，猪瘟(SF)快速诊断试纸条，类同实施例一，不重述。有点不同是的，2为SF金标抗体(W18)棉，6为SF标准抗原(X18)印迹，7为SF包被抗体(Y18)印迹。病料样品溶液取扁桃体，脾，肾制取。
实施例十九，猪生殖和呼吸系统综合症(PRRS)快速诊断试纸条，类同实施例一，有点不同的是，2为PRRS金标抗体(W19)棉，6为PRRS标准抗原(X19)印迹，7为PRRS包被抗体(Y19)印迹。病料样品溶液取死胎，血液，腹水、脾，肺制取。
实施例二十，马传染性贫血(EIA)快速诊断试纸条，类同实施例一，不重述。有点不同的是，2为EIA金标抗体(W20)棉，6为EIA标准抗原(X20)印迹，7为EIA包被抗体(Y20)印迹。病料样品溶液取病马血液或脾，肝，心制取。
实施例二十一，牛病毒性腹泻—粘膜病(BVD-MD)快速诊断试纸条，类同实施例一，不重述。有点不同的是，2为BVD-MD金标抗体(W21)棉，6为BVD-MD的标准抗原印迹，7为BVD-MD包被抗体(Y21)印迹。病料样品溶液取病牛血液，脾，淋巴结制取。
实施例二十二，羊蓝舌病(BT)快速诊断试纸条，类同实施例一，不重述。有点不同的是，2为BT金标抗体(W22)棉，6为BT标准抗原(X22)印迹，7为BT包被抗体(Y22)印迹。病料样品溶液取病羊血液或心，脾、肾，淋巴结制取。
权利要求
1.一种畜禽疫病快速诊断试纸条，含有支撑层，反应试剂载体吸附层，本发明的特征是支撑层为不吸水薄片条，反应试剂载体吸附层粘贴在支撑层上，从样品端起依次为纤维层，吸附待测某种畜禽疫病相应的金标抗体(Wi)纤维层，纤维素膜层，手柄端为吸水材料层，用某种待测畜禽疫病标准抗原溶液(Xi)和用相应的某种畜禽疫病包被抗体溶液(Yi)分别在纤维素膜层上印制出阴性显示印迹“-”或“|”，和阳性显示印迹“|”或“-”。
2.根据权利要求1所述的诊断试纸条，其特征是不吸水支撑层薄片条可用硬质塑胶片条，或不吸水硬纸片条，纤维层可用玻璃棉，吸水材料层可用吸水纸，纤维素膜层可用硝酸纤维素膜，金标抗体纤维层可用金标抗体(Wi)玻璃棉，在玻璃棉，金标抗体玻璃棉及吸水纸层上覆盖有保护膜，阴性显示印迹和阳性显示印迹其组合可为“+”，“‖，“＝”，
“”，
印迹，选用“+”，“‖”这两种组合印迹较好，在玻璃棉和金标抗体(Wi)玻璃棉交界处对应的保护膜偏向玻璃棉一侧约0.5cm处印制出标记线。
3.根据权利要求1或2所述的诊断试纸条，其特征是吸附有待测某种畜禽疫病金标抗体(Wi)玻璃棉，用某种畜禽疫病标准抗原(Xi)印制阴性显示印迹和用某种相应畜禽疫病包被抗体(Yi)印制的阳性显示印迹可为下列畜禽疫病中的一种口蹄疫(FMD)金标抗体玻璃棉，FMD标准抗原印迹和相应FMD包被抗体印迹，狂犬病金标抗体玻璃棉，狂犬病标准抗原印迹和相应的狂犬病包被抗体印迹，伪狂犬病金标抗体玻璃棉，伪狂犬病标准抗原印迹和相应伪狂犬病包被抗体印迹，猪瘟(SF)金标抗体玻璃棉，SF标准抗原印迹和相应SF包被抗体印迹，猪生殖和呼吸系统综合症(PRRS)金标抗体玻璃棉，PRRS标准抗原印迹和相应PRRS包被抗体印迹，马传染性贫血(EIA)金标抗体玻璃棉，EIA标准抗原印迹和相应EIA包被抗体印迹，牛病毒性腹泻—粘膜病(BVD-MD)金标抗体玻璃棉，BVD-MD标准抗原印迹和相应的BVD-MD包被抗体印迹，羊蓝舌病(BT)金标抗体玻璃棉，BT标准抗原印迹和相应的BT包被抗体印迹，鸡传染生法氏囊病(IBD)金标抗体玻璃棉，IBD标准抗原印迹和相应IBD包被抗体印迹，鸡新城疫病(ND)金标抗体玻璃棉，ND标准抗原印迹和相应ND包被抗体印迹，鸡马立克氏病(MD)金标抗体玻璃棉，MD标准抗原印迹和相应MD包被抗体印迹，鸡减蛋综合症(EDS)金标抗体玻璃棉，EDS标准抗原印迹和相应EDS包被抗体印迹，鸡传染性支气管炎(IB)金标抗体玻璃棉，IB标准抗原印迹和相应IB包被抗体印迹，鸡传染性喉气管炎(ILT)金标抗体玻璃棉，ILT标准抗原印迹和相应ILT包被抗体印迹，鸭病毒性肝炎(DVH)金标抗体棉，DVH标准抗原印迹和相应DVH包被抗体印迹，小鹅瘟(GP)金标抗体玻璃棉，GP标准抗原印迹和相应GP包被抗体印迹，禽流感(AI)金标抗体玻璃棉，AI标准抗原印迹和相应AI包被抗体印迹，炭疽金标抗体玻璃棉，炭疽标准抗原印迹和相应炭疽包被抗体印迹，大肠杆菌病金标抗体玻璃棉，大肠杆菌病标准抗原印迹和相应的大肠杆菌病包被抗体印迹，沙门氏菌病金标抗体玻璃棉，沙门氏菌病标准抗原印迹和沙门氏菌病包被抗体印迹，巴氏杆菌病金标抗体玻璃棉，巴氏杆菌病标准抗原印迹和相应巴氏杆菌病包被抗体印迹，布氏杆菌病金标抗玻璃棉，布氏杆菌病标准抗原印迹和相应布氏杆菌包被抗体印迹。
全文摘要
本发明涉及畜禽疫病诊断器具,特别涉及一种畜禽疫病快速诊断试纸条,含有支撑层,反应试剂载体吸附层,支撑层为不吸水薄片条,反应试剂载体吸附层粘贴在支撑层上,从样品端起依次为纤维层、吸附待测某种畜禽疫病相应的金标抗体Wi纤维层,纤维素膜层,手柄端为吸水材料层,用某种待测畜禽疫病标准抗原溶液Xi和用相应的某种畜禽疫病包被抗体溶液Yi分别在纤维素膜层上印制出阴性显示印迹“－”或“丨”,和阳性显示印迹“丨”或“－”。本试纸条特异性和敏感性好,操作简便,快速,大大降低劳动强度,缩短检测时间,显示判断检测结果形象、直观、准确,不会发生假阳性或假阴性误判,投资小,成本低,容易推广应用。
文档编号G01N33/531GK1261670SQ9910153
公开日2000年8月2日 申请日期1999年1月21日 优先权日1999年1月21日
发明者张改平, 郭军庆, 杨艳艳, 王爱萍, 闫玉河, 李学伍, 邓瑞广, 李青梅, 李灵霞, 闫红良 申请人:河南省农业科学院畜牧兽医研究所