专利名称：糖尿病鉴别试剂盒及其制作方法
糖尿病鉴别试剂盒及其制作方法，涉及利用卡介苗(BCG)65KD热休克蛋白作为抗原，运用ELISA法检测糖尿病患者血清中64KD抗体，在临床上鉴别诊断糖尿病型别的一种试剂盒及其制作方法。
目前临床上鉴别糖尿病的指标主要有胰岛细胞抗体(ICA)，胰岛素自身抗体(IAA)，以及64KD抗体。ICA和IAA存Ⅰ型糖尿病患者血清中阳性检出率低，发病后检出率下降，并且ICA和IAA还存在于其他内分泌疾病；所以临床上未能推广应用。检测64KD抗体在现有技术中有运用谷氨酸脱羧酶(GAD)作为抗原，因价格高昂，难以推广到临床使用。本发明的检测64KD抗体的ELISA试剂盒及其制备方法是生产出一种新技术产品的新的技术方法。用本发明制备的检测64KD抗体(65KDHSP抗体)试剂盒检测了30例Ⅰ型糖尿病，30例Ⅱ型糖尿病，5例系统性工斑狼疮，8例甲亢，44例健康人，64KD抗体阳性检出率分别为83．3％，13．3％，0．00％，0．00％，2．27％；24例64KD抗体阳性的Ⅱ型糖尿病有22(91．7％)例需要胰岛素治疗，所以从Ⅱ型糖尿病中可识别出成人迟发性自身免疫性糖尿病。对Ⅰ型糖尿病诊断的特异性为94．6％，诊断的敏感性为83．3％，诊断指数为177．9％。
本发明的目的在于提供一种以卡介苗(BCG)65KD热休克蛋白作为抗原，并以ELISA法检测糖尿病患者血清中64KD抗体的试剂盒，用于临床上鉴别诊断糖尿病型别；此试剂盒不仅能诊断Ⅰ型糖尿病，而且能从Ⅱ型糖尿病中识别成人迟发性自身免疫性糖尿病(LADA)。抗原卡介苗(BCG) 65KD热休克蛋白制备简单，成本较低。
本发明的试剂盒及其制备方法的技术方案如下1)制备卡介苗(BCG) 65KD热休克蛋白BCG接种于培养基中培养10～14天，设备使用恒温振荡培养箱，(上海跃进医疗器械二厂)容量500ml三角烧瓶9个；在恒温水浴箱(型号ZB11241-89)中，40～45℃水浴1～4小时；用离心机(北京医用离心机厂产LD4-2型)收集上清液；用硫酸胺沉淀法浓缩蛋白质，浓度为1～500mg／ml；用蛋白质回收槽(北京六一仪器厂产DYY-Ⅲ43型)纯化，或者用Waters层析仪(层析法)纯化卡介苗(BCG)65KD热休克蛋白；用SDS-PAGE法鉴定其分子量，用免疫动物(家兔或小白鼠)鉴定其免疫(抗原)活性；
合格后即生产出本发明所需用的卡介苗(BCG)65KD热休克蛋白；数量为每人每月制备大约0．5克；三人合作大约每月制备3克。
2)制备酶联反应板将卡介苗(BCG) 65KD热休克蛋白用PH(8-10)的碳酸盐缓冲液定量至1μg～1000μg／ml；包被酶联反应板0．1～50μg／孔；用含1～5％BSA(小牛血清白蛋白)的磷酸盐缓冲液封闭，封闭条件是37℃下1小时，或4℃下12小时；洗涤；洗涤液为含0．1％的吐温-20的PH7．4，0．01mol／L磷酸盐缓冲液洗涤3次，每次5分钟；经自然干燥，用聚氯乙烯塑料袋消毒密闭封装，在4℃下保存备用；1克卡介苗(BCG)65KD热休克蛋白可包被10万人份。
3)制备试剂盒已包被卡介苗(BCG)65KD热休克蛋白的酶联反应板，板型两种可拆96孔或可拆48孔；HRP-羊抗人IgG(辣根过氧化物标记的羊抗人IgG)，1∶800稀释，管装两种规格15μl或7．5μl；洗涤液，瓶装30ml或15ml，20倍浓缩含0．05％的吐温-20的PH7．4，0．01mol／L磷酸盐缓冲液；(使用时稀释20倍)酶标抗体稀释液；(洗涤液加1％～2％的小牛血清白蛋白200μl)底物稀释液；(0．1mol／L的磷酸氢二钠10．28ml加上0．05mol／L枸橼酸9．72ml)底物OPD；(邻苯二胺，片状， 3片，进口产品，Sigma公司出品)终止液2mol／L硫酸；阳性血清，50μl。
本发明用于临床检测64KD抗体过程1)酶联反应板加待检血清(1∶10)-(1∶100)100μl，37℃孵育1小时，洗板；2)加HRP标记的抗人IgG(军事医学科学院产品)，37℃孵育1小时，洗板；3)加底物OPD液100μl，37℃闭光显色10～20分钟；4)加终止液2mol／LH2SO450μl；5)492nm处比色(使用南京华东电子仪器厂产酶联免疫检测仪)。
本发明的好处有(1)由于采取预包被抗原板技术措施，特别适于临床推广使用，操作方便简单(2)制备工艺简单成熟，原料易得，成本较低，有特定的新技术创新内容，产品附加值高；(3)对Ⅰ型糖尿病诊断特异性达94％以上，诊断敏感性达83％以上，对Ⅱ型糖尿病可识别出成人迟发性自身免疫性糖尿病。
本发明叙述的试剂盒及制作方法在技术方案中已详细说明，按其说明可以用本发明叙述的制作方法生产出本发明叙述的试剂盒。
权利要求
1)检测64KD抗体的ELISA试剂盒，包括(a)酶联反应板，(b)HRP-羊抗人IgG，(c)洗涤液，(d)酶标抗体稀释液，(e)底物稀释液，(f)底物0PD，(g)终止液，(h)阳性血清，其特征是将卡介苗(BCG)65KD热休克蛋白包被(a)酶联反应板；(b)HRP-羊抗人IgG(辣根过氧化物标记的羊抗人IgG)，1∶800稀释，管装两种规格15μl或7．5μl；(c)洗涤液，瓶装30ml或15ml，20倍浓缩含0．05％的吐温-20的PH74，0．01 mol／L磷酸盐缓冲液(使用时稀释20倍)；(d)酶标抗体稀释液(洗涤液加1％～2％的小牛血清白蛋白200μl)；(e)底物稀释液(0．1mol／L的磷酸氢二钠10．28ml加上0．05mol／L枸橼酸9．72ml)；(f)底物OPD(邻苯二胺，片状，3片，进口产品，Sigma公司出品)；(g)终止液2mol／l硫酸；(h)阳性血清，50μl。
2)根据权利要求1所述的检测64KD抗体的ELISA试剂盒，其特征是酶联反应板上包被的卡介苗(BCG)65KD热体克蛋白用PH(8-10)的碳酸盐缓冲液定量至1μg～1000μg／ml，包被酶联反应板0．1～50μg／孔，用含1～5％的小牛血清自蛋白的磷酸盐缓冲液封闭。
3)根据权利要求1或权利要求2所述的检测64KD抗体的ELISA试剂盒，其特征是用磷酸缓冲液封闭的条件为37℃下1小时。
4)根据权利要求1或权利要求2所述的检测64KD抗体的ELISA试剂盒，其特征是用磷酸缓冲液封闭的条件为4℃下12小时。
5)一种制造权利要求1所述试剂盒的制作方法，其特征是酶联反应板上包被的卡介苗(BCG)65KD热休克蛋白以如下方法制得BCG接种于培养基中10～14天，40℃～45℃条件下水浴1～4小时。
全文摘要
糖尿病鉴别试剂盒及其制作方法,试剂盒由本发明制备的卡介苗(BCG)65KD热休克蛋白包被的酶联反应板、HRP－羊抗人IgG、洗涤液、酶标抗体稀释液、底物稀释液、底物OPD、终止液以及阳性血清组成。本发明预包被抗原板用于临床操作方便,对Ⅰ型糖尿病诊断特异性达94%以上,诊断敏感性达83%以上,对Ⅱ型糖尿病可识别出成人迟发性自身免疫性糖尿病。本发明制备容易,成本较低,附加值较高。
文档编号G01N33/535GK1279399SQ9911308
公开日2001年1月10日 申请日期1999年7月5日 优先权日1999年7月5日
发明者杨廷彬, 王鸿 申请人:杨廷彬, 王鸿