神经变性的鉴别诊断的制作方法

专利名称：神经变性的鉴别诊断的制作方法
技术领域：
本发明涉及神经变性的诊断领域。本发明涉及新的使用检测体液中的不同神经学标记的联合测定法来鉴别诊断神经变性的方法。本发明还涉及新的检测脑脊液中的Rab3a、SNAP25或α-融合核素(α-synuclein)的方法，以及这些方法在用于鉴别诊断神经变性的联合测定法中的用途。
背景技术：
神经变性是多种神经学疾病的特征之一。神经变性可能牵涉到轴索损害，逐渐发展的神经元死亡；神经递质的释放或受体的功能异常；髓磷脂的破坏；CNS血流改变；血/脑屏障机能障碍和/或改变的氧代谢；其他CNS代谢途径的困难和/或各种其他(常常是未知的)可能引起CNS机能障碍的情况。今天，不同的疾病已与神经机能障碍的不同方面联系起来(有关的概述参见Wilson等，1991年)。例如，早老性痴呆是所有神经变性疾病中最重要的，其中牵涉到大脑皮质中神经细胞的死亡和消失。这是老年人中最常见的痴呆，它给病人和家庭带来了痛苦，并因需要对受到该疾病的影响而完全失去能力的病人进行长期护理而导致了经济上的损失。额颞叶性痴呆是原发性退变性痴呆的第二种最常见的类型，占所有痴呆病人的大约3-10％(Brun,1993年；Knopman,1993年)。临床表现的特征是出现主导性额叶综合征(Sjgren,1997年)，这也可在其他疾病象情感性精神病和精神分裂症中观察到(Abbruzzese等，1997年)。雷维小体病是与进行性痴呆或精神病一起存在的疾病。帕金森氏病的征兆在开始时可能不存在或较轻微，但最终变得普遍，且僵化通常很严重。雷维小体大量见于脑干、基底前脑、丘脑下体和新大脑皮质。帕金森氏病是发生于中老年的雷维小体病类型，它有非常徐缓的进展和长时间的病程。可以将它看作是神经系统疾病的例子，主要涉及黑质纹状体多巴胺能系统。另一方面，脑血管疾病是由与脑部血管有关的多个病理过程之一引起的。它是发达国家中继心脏病和癌症之后列第三位的主要死亡原因，总的流行率达到794人每100 000人。65岁以上的人群中有5％受到中风的影响，中风是作为这些病理过程之一的结果发生的急性神经学损伤。神经变性也可能因接触某些化学物质(表1)、辐射、化疗或低氧-局部缺血事件而引起。儿童期白血病和脑肿瘤的治疗(或预防)的长期并发症包括行为变化、学习成绩不好、记忆力损失、智力下降、生长迟缓、激素失调、和CT扫描异常(大脑萎缩、脑室扩张、大脑内钙化)。白血病幸存者在经过未照射颅侧的放射治疗或化学治疗后分别观察到了智力发育延迟(IQ、记忆力、注意力、空间视觉能力短缺)(Fletcher等，1988年)或认知能力衰退(Ochs等，1991年)。此外，4岁以下的孩子特别容易受到颅侧放疗和/或化疗的神经毒性作用的伤害(Moore等，1986年；Jannoun等，1983年)。对于大多数药剂来说，高剂量的治疗、联合化疗、伴随的颅侧放疗以及颈动脉内(intracarotic)或鞘内注射都比标准的口服或静脉内治疗更有可能导致神经学并发症。神经系统的任何部分都可能受到损害。当癌症病人受到更有力的治疗、接受更多的化疗、活得更长时，以及当新的化疗试剂开发出来、现有试剂的使用增强或以新的途径使用时，癌症化疗的神经学并发症将变得更普遍、更严重和更复杂。
对于大多数神经学病况，由于疾病过程容易证明，病人都寻求一般的医疗护理。临床医师的任务是开发能对疾病的部位和其可能的病因作出精确诊断的神经学分析方法。只有在准确的诊断后，才可能对疾病进行有效的处置和治疗。现已开发出一些用于诊断病人的神经变性的技术，诸如正电子发射X线体层照像术(PET)，单光子发射计算体层摄影术(SPECT)和核磁共振光谱学(NMRS)，这些技术使得有可能研究脑的功能和结构。但是，大多数神经学疾病仍然是在排除了其它疾病形式的基础上进行临床诊断的，并且在有些情况下，甚至不可能将不同的神经学疾病区别开来。例如，对精神抑制药敏感的雷维小体型痴呆或雷维小体痴呆(LBD)在临床上非常难以与早老性痴呆区分(McKeith等，1996年；Ballard等，1998年)。多数病人(75％以上)是从神经病理学上定义为早老性痴呆病人，同时据估计有15-25％的临床上诊断为早老性痴呆的病人患有雷维小体性痴呆(Hooten等，1998年)。由于雷维小体性痴呆对乙酰胆碱酯酶治疗更为敏感，因此要得到最佳治疗效果，就必需将雷维小体性痴呆与早老性痴呆区别开(Levy等，1994年；Perry等，1994年；Wilcock等，1994年)。
额颞叶性痴呆也经常被误诊为其它类型的痴呆或其它精神病，因为在其它疾病中也可观察到额颞叶性痴呆的症状。
在血管疾病和早老性痴呆之间没有明确的差别，此时也明显存在误诊的危险。由于对血管疾病进行药物治疗是可能的，因此早期的正确诊断十分重要。
对于大多数神经病学家来说，对由诱导因素诸如某些化学物质、辐射、化疗或低氧-局部缺血事件等引起的脑损害的识别和治疗仍然是经常而重要的临床问题。在临床诊断不明确的情况下，最后的诊断只能不可挽回地通过神经病理学检查作出。这样，就只有通过尸检才可能精确地鉴别诊断神经变性。因此，用于早期检测病人的神经学疾病和用于监控由不同因素诱导的神经学变化的方法，对于确定是否可以继续接触诱导因素、对个体患者使用的剂量和药物是否适宜、以及对于开始恰当的治疗，都将非常有帮助。
最近有许多神经学标记已适合使用，它们能反映与细胞死亡、轴突生长/再诱导、炎症和/或血脑屏障机能障碍有关的中枢神经系统(CNS)的病况。
例如，微管相关蛋白τ是双螺旋丝状体(PHF)和神经纤丝团(NFT)的主要蛋白成分(Brion等，1985年；Delacourte和Defossez,1986年；Grundke-Iqbal等，1986年；Kosik等，1986年；Wood等，1986年；Kondo等，1988年)。τ蛋白存在不同的同种型，其中在成人的脑中发现了4-6种，但在胎儿的脑中只检测到1个同种型。多种多样的同种型是通过可变mRNA剪接而从人17号染色体上的单基因产生的(Himmler,1989年；Goedert等，1989年；Andreadis等，1992年)。正如从分子克隆推断出的，τ蛋白的最显著的特性是一段31或32个氨基酸的序列，它出现在分子的羧基末端部分，这段序列可以重复3或4次。其他多样性是通过τ分子的NH2-末端部分中的29或58个氨基酸长的插入片段产生的(Goedert等，1989年)。在体内，τ通过涉及其集中在τ的重复区(255-381)的微管结合结构域的相互作用促进微管在神经元的轴索隔室中的装配和稳定性(Lewis等，1988年)。在正常情况下，成人的脑含有2-3摩尔磷酸每摩尔τ(Selden和Pollard,1983年；Ksiezak-Reding等，1992年)。根据对大鼠和人的研究，正常τ蛋白中不同部位的磷酸化依赖于发育状态(Lee等，1991年；Bramblett等，1993年；Goedert等，1993年)。作为磷酸化的结果产生的60、64和68 kDa的τ变种已在显示神经纤丝团的脑部区域中检测到(Delacourte等，1990年；Goedert等，1992年；Flament等，1990年；Greenberg和Davies,1990年)。这些脑含有6-8摩尔磷酸每摩尔τ(Ksiezak-Reding等，1992年)。在从PHF分离的τ(PHF-τ)中，在多个位置上发生磷酸化(Iqbal等，1989年；Lee等，1991年；Hasegawa等，1992年)。迄今为止，对脑提取物中的磷酸-τ的检测，无论是经由抗体(Mab Alz50:Ghanbari等，1990年；Mab Ab423:Harrington等，1991年；Mab AT120:Vandermeeren等，1993年；Mab AT180；Mab AT270国际申请公开WO95/17429；和Mab AT8国际申请公开WO 93/08302)，还是经由分子量的改变(Flament等，1990年)，或者是借助功能测定(Bramblett等，1992年)，都已用于区别带有改变的细胞骨架性能的痴呆和正常的老龄病人或患有其他类型痴呆的病人。各自识别τ的非磷酸化表位的单克隆抗体的组合已用于检测脑脊液中τ和PHF-τ的存在(Van de Voorde等，1995年)。
神经元特异性烯醇化酶(NSE)的γ-亚单位是神经元胞质溶胶的主要成分(Kato等，1981年)。NSE占到可溶性脑蛋白总量的3％。在成人中，它被认为可用于评估局部缺血、感染或肿瘤起源的活性神经元损害(Garcia等，1994年)。对儿童血清中的NSE尚没有研究。Nara等(1988年)显示，脑脊液或血清中的高浓度NSE与昏迷儿童的不良结果和死亡相关。但是，增加的血清NSE不是CNS起源必要的。有一些组织，包括外周神经元、内分泌腺、淋巴细胞、红细胞和血小板，含有NSE(Kaiser,1989年)，这可能危害这种标记的单独使用。
β-淀粉状蛋白是40-43个氨基酸长的肽，它从叫做淀粉样前体蛋白或APP的大的前体蛋白经由蛋白水解切割产生。淀粉状蛋白是在正常细胞的代谢过程中产生的。淀粉样肽显示出高度的不均一性。现已鉴别出两种主要形式的β-淀粉状蛋白β-淀粉状蛋白(1-40)和β-淀粉状蛋白(1- 42)。β-淀粉状蛋白(1-42)是早老性痴呆、唐氏综合征和正常老化的脑中的神经炎性斑的主要成分。它可能是神经毒性的，并且已知能增加神经元的易损性而导致其他损伤。此外，低浓度的可溶性淀粉状蛋白可导致独立于并行的神经毒性的胆碱能活动减退。乙酰胆碱在认知过程中起决定性的作用(Auld等，1998年)。特异性识别肽的了解充分的表位的高亲和力单克隆抗体的开发已导致了对未浓缩脑脊液中的β-淀粉状蛋白(1-42)肽的简单测试法(Citron等，1997年；Johnson-Wood等，1997年)。这种测试已证明在监控干扰APP加工的药物、辐射或化学物质的长期作用中也是有价值的。
生长相关蛋白-43(GAP-43)(也叫做神经调制素(neuromodulin)或B-50)是神经组织特异性蛋白，主要集中在轴突和突触前末端。GAP-43被认为在神经元的生长、轴突的形成、以及在再生和神经元的萌芽中起主要作用(Skene和Willard,1981年；Basi,1987年；Benowitz等，1989年；Mercken等，1992a)。突触蛋白在突触功能中起不同作用。在确定可用于融合的小泡的量时，象突触蛋白这样的蛋白质是重要的，而在将小泡定向到膜上时，Rab3a和Rab亲和蛋白是重要的。停靠过程由小突触小泡蛋白、SNAP25、Sec和突触融合蛋白的分子复合物来确定，而据信CSP和突触结合蛋白在小泡内容物的Ca2+-依赖性释放中起重要作用。α-融合核素富有黑质和基底神经节的突触，并属于包括α-融合核素和γ-融合核素的蛋白质家族。
存在和稳定于体液中的并且反映中枢神经系统中神经元的代谢状态的这类细胞内标记可能在神经变性的早期识别中是有用的，甚至是在临床征兆出现之前。可使用(可能与其他诊断方法结合使用)的神经元功能的生化指标将非常有助于提高神经变性的临床诊断准确度和对其的医疗监控。
早老性痴呆的特征在于丰富的细胞外衰老斑、细胞内团块和突触损失。τ蛋白和β-淀粉状蛋白(1-42)分别是这些团块和斑(这是AD的神经病理学检查中的两种诊断结构)中的必需成分。τ蛋白和β-淀粉状蛋白(1- 42)均已在脑脊液(CSF)中检测到，并且现在已完全肯定CSF-τ和CSF-β-淀粉状蛋白(1-42)可以用作早老性痴呆的神经学标记，尽管尚不清楚与早老性痴呆的病理生理学有关的CSF浓度怎样变化。CSF-τ在早老性痴呆病人中与年龄相当的对照相比增加了，并且涉及到脑中的团块的数量，而β-淀粉状蛋白(1-42)在早老性痴呆病人体内却减少了。β-淀粉状蛋白(1-42)可能与斑的形成无关，因为在没有弥漫性衰老斑的痴呆诸如额叶性痴呆中发现它减少了。尽管有关脑组织的研究提示了斑和痴呆程度的关系，并确定地提示了团块和痴呆程度的关系，但正如通过简短精神状态确定的那样，CSF-τ和CSF-β-淀粉状蛋白(1-42)的浓度并非始终与痴呆程度有关，也会发生与其他类型的痴呆的重叠。除了使用τ和β-淀粉状蛋白(1-42)外，使用β-淀粉状蛋白(1-40)作为神经学标记(Shoji等，1998年)没有改善对早老性痴呆的诊断测定，因为β-淀粉状蛋白(1-40)在早老性痴呆病人体内的浓度与正常对照相比没有变化(Motter等，1995年)。
有关脑GAP-43的研究显示，其浓度在早老性痴呆的额叶皮质中降低了，但在其他区域中则升高了(Coleman等，1992年)。对于痴呆病患者的体液中的GAP-43还没有进行过研究。
AD病人脑中的另一个重要的结构变化是突触损失。事实上，最近的测量团块、斑和突触损失的量的研究显示，突触损失是主要与痴呆程度相关联的(Terry等，1991年)。近来的研究中观察到了突触小泡蛋白免疫反应性的降低。对于其他突触蛋白也证明了类似的降低情况突触结合蛋白，Rab3a，小突触小泡蛋白和突触融合蛋白(Blennow等，1996年；Davidsson等，1996年；Shimohama等，1997年；Ferrer等，1998年)。对于几种形式的帕金森氏病来说，也有强烈的迹象表明突触蛋白起病理作用。在两种罕见的家族性帕金森氏病形式中检测到了α-融合核素的两种突变，并且α-融合核素被描绘为是雷维小体中的主要成分。体内雷维小体的形成可由融合核素的积聚产生，融合核素积聚可能是快速轴突运输减少或融合核素过量表达的结果(Jensen等，1998年)。由于突触蛋白看来是痴呆程度的主要相关因素之一(Terry等，1991年)，因此它将用于提供检测和定量体液中的突触蛋白的方法。对于突触蛋白在CSF中的存在和定量尚没有进行充分探究。嗜铬粒蛋白已经用作CSF中突触损失的标记，但减少只显示在“纯”或Ⅰ型早老性痴呆中(Blennow等，1995年)。之后不久显示在CSF中存在突触结合蛋白Ⅰ(Davidsson等，1996年)。在这项研究中证明，突触结合蛋白在早老性痴呆病人的左海马结构和额叶皮质的9号布劳德曼区中选择性减少了。在CSF的集合体的基础上显示这种减少也可见于CSF中，但尚未定量。Davidsson等(1996年)未能检测CSF中的Rab3a和突触小泡蛋白。
对于因接触某些化学物质、辐射、化疗或低氧-局部缺血事件而导致的神经变性来说，也没有准确的诊断工具。产前窒息可能与神经后遗症有关。然而，对于低氧-局部缺血事件后的脑损害严重性的早期准确评估仍然是新生儿护理中最困难的问题之一。迄今，临床的、脑电图描记和神经放射学评估，加上脑血流量研究，是最容易获得的方法。随着“CSF中各成分的变化反映了改变的脑代谢活性”这一点逐渐变得越来越明显，对CSF神经学标记的检测可以补充低氧-局部缺血事件的评估中的临床数据(Garcia-Alix等，1994年)。对于化疗、辐射或低氧-局部缺血事件后的老年时期的CSF神经学标记和行为变化之间的联系从未评估过。
发明目的本发明的目的是提供特定检测、定量和/或鉴别诊断个体的神经变性的方法。
本发明的另一个目的是提供更具体的检测、定量和/或鉴别诊断个体的早老性痴呆的方法。
本发明的另一个目的是提供更具体的检测、定量和/或鉴别诊断个体的雷维小体病的方法。
本发明的另一个目的是提供更具体的检测、定量和/或鉴别诊断个体的帕金森氏病的方法。
本发明的另一个目的是提供更具体的检测、定量和/或鉴别诊断个体的额颞叶性痴呆的方法。
本发明的另一个目的是提供区别早老性痴呆和帕金森氏病的方法。
本发明的另一个目的是提供区别早老性痴呆和雷维小体性痴呆的方法。
本发明的另一个目的是提供特定检测或定量早老性痴呆中的血管问题的方法以及鉴别诊断不同形式的早老性痴呆的方法。
本发明的另一个目的是提供诊断因化疗导致的或因接触化学物质或辐射导致的神经变性的方法。
本发明的另一个目的是提供诊断个体因采用化疗治疗白血病或脑肿瘤而导致神经变性的方法。
本发明的另一个目的是提供诊断由产前窒息而导致的神经变性的方法。
本发明的另一个目的是提供新的用于检测脑脊液中突触蛋白Rab3a的方法。
本发明的另一个目的是提供新的用于检测脑脊液中Rab3a的方法，从而可以更具体地检测、定量和/或鉴别诊断个体的神经变性。
本发明的另一个目的是提供新的用于检测脑脊液中Rab3a的方法，从而可以更具体地检测、定量和/或鉴别诊断早老性痴呆。
本发明的另一个目的是提供新的用于检测脑脊液中突触蛋白α-融合核素的方法。
本发明的另一个目的是提供新的用于检测脑脊液中α-融合核素的方法，从而可以更具体地检测、定量和/或鉴别诊断个体的神经变性。
本发明的另一个目的是提供新的用于检测脑脊液中α-融合核素的方法，从而可以更具体地检测或定量早老性痴呆和/或雷维小体病和/或可以鉴别诊断早老性痴呆与雷维小体病。
本发明的另一个目的是提供用于实施如上所述的方法的诊断试剂盒。
本发明的另一个目的是提供治疗性监控和/或确定某种治疗的有效性的方法。
发明详述本发明涉及特定检测、定量和/或鉴别诊断个体的神经变性的方法。这些方法涉及测定所述个体的一种或多种体液样品中至少三种神经学标记的浓度，由此通过所述所有神经学标记的浓度与对照样品相比的数量变化来反映神经变性的类型和程度。
从本发明的实施例可以看出，通过使用至少三种神经学标记，可以更特定和灵敏地检测许多神经变性疾病。同样很明显，通过使用至少三种神经学标记，就有可能将在临床诊断的基础上无法鉴别的多种神经变性疾病区别开来。
本申请中所用的术语“神经变性”和“神经变性疾病”代表相同的含义，在整个申请文件中可以互换使用。这些术语包括与神经元机能障碍有关的任何一种脑病。Wilson等(1991年)的文章中提及了各种与神经变性有关的疾病。它们包括早老性痴呆，中风(局灶性脑损伤)，弥漫性脑损伤，血管疾病，帕金森氏病，雷维小体病，克罗伊茨费尔特-雅各布病，额颞叶性痴呆，急性热病性多神经炎，多发性硬化，常压性脑积水，肌萎缩性侧索硬化，精神分裂症，抑郁，山黧豆中毒，癫痫和窒息。不过，这个名单并不完全。还包括已知与神经元机能障碍有关的其他疾病。神经变性也包括与神经元机能障碍有关的以及由特定诱导因素引起的任何方式的脑损害或任何一种脑病。在本发明的优选实施方案中，要特定检测、定量和/或鉴别诊断的神经变性疾病选自下列成员早老性痴呆，雷维小体病，帕金森氏病和额颞叶性痴呆。雷维小体病用于表示在脑干、基底前脑、丘脑下体和/或新大脑皮质中显示雷维小体的任何一种疾病。雷维小体病包括帕金森氏病、多系统性萎缩和雷维小体性痴呆。
在本发明的另一个优选的实施方案中，要特定检测、定量和/或鉴别诊断的神经变性疾病是由低氧-局部缺血事件、化疗、放疗导致的，或者是由于接触化学物质或辐射导致的。更具体地说，神经变性可能由在白血病或脑肿瘤的治疗过程中的化疗或放疗引起。
不过，这里列出的神经变性疾病并不完全，应当还包括其中脑出现机能障碍的其他疾病。
本发明中所用的词语“特定检测神经变性”的意思是检测某种疾病或某种神经学病因与某种神经变性疾病的关联时，比用少于三种神经学标记进行诊断时获得的结果具有更高的灵敏度和特异性。
本发明中所用的词语“定量神经变性”的意思是确定因某种神经变性疾病导致的神经元机能障碍的程度。本发明中所用的词语“鉴别诊断神经变性”是指以“将某种疾病或某种神经学病因与某种神经变性疾病关联起来”这种方式区别开各种神经变性疾病。
特定检测、定量和/或鉴别诊断个体的神经变性是通过使用包含下列步骤的免疫测定检测所述个体的一种或多种体液样品中的至少三种不同的神经学标记完成的-从所述个体获得一种或多种体液样品；和-在适合生成抗原-抗体复合物的条件下，使所述体液样品与各自识别该体液样品中的不同神经学标记的至少三种不同抗体(第一抗体或捕获抗体)接触；和-检测所述抗体与所述体液样品的免疫结合；-推断所述体液中所述神经学标记的浓度，所述所有神经学标记的浓度与对照样品相比的数量变化反映了神经变性的类型和程度。
然后进行检测免疫结合的过程将由抗原和识别其中一种神经学标记的抗体形成的所述抗原-抗体复合物与下列物质混合在一起a)第二抗体(或检测抗体)
*它可以是识别抗原-抗体复合物的特异性表位但不识别单独的第一抗体的单克隆抗体，或者*它可以是识别抗原-抗体复合物的特异性表位但不识别单独的第一抗体的多克隆抗体，所述多克隆抗体优选使用固定化神经学标记或神经学标记-第一抗体复合物通过免疫亲和层析纯化；b)用于特异性标记所述第二抗体或与所述第二抗体偶联的标记，所述标记是本领域技术人员已知的任何可能的标记；c)用于进行抗体和体液样品之间的、第二抗体和神经学标记-第一抗体复合物之间的和/或从另一方面来说，结合第二抗体和标记之间的免疫反应的适宜缓冲溶液；和d)出于标准化的目的，也可能是与用于检测神经学标记的抗体反应的纯化蛋白质或合成肽。
有利地，用于本发明的抗体为固定在适宜支持体上的固定化状态。这些抗体可以存在于最多三个(在检测3个以上神经学标记的情况下为多个)不同的支持体上或存在于同一个支持体上。当抗体存在于同一个支持体上时(例如在一个微量滴定板的孔中)，每种抗体的免疫结合可以利用特异性标记进行检测。另外，抗体可以存在于同一支持体的不同位置上。在后者的情况下，检测可以用测定这些抗体中任何一种的免疫结合的通用标记进行。有利地，第二抗体自身携带着标记或用于直接或间接与标记偶联的基团。另外，本发明的方法可以使用本领域技术人员已知的任何一种其他免疫测定形式加以实施。
术语“表位”是指被抗体结合部位特异性束缚的抗原-抗体复合物部分。表位可以用本领域中已知的任何一种技术确定，或者可以用本领域中已知的各种各样的计算机预测模型预测。
本发明中所用的词语“识别”、“与……反应”、“免疫结合”或“生成抗原-抗体复合物”将被解释为抗原和抗体之间在遵守抗体和抗原的免疫学特性的所有条件下发生的结合。
术语“体液”是指人体中存在的所有液体，包括但不限于血液、淋巴、尿和脑脊液(CSF)。
在一个具体实施方案中，本发明涉及如上所述的方法，其中体液样品选自脑脊液样品和血液样品。血液样品可包括从病人采集的全血样品。更优选的是血液样品包括血浆样品或血清样品。
在本发明的方法中，也有可能检测两种不同体液中的相同标记(同时检测至少另外一种标记)或者检测三种不同体液中的相同标记。例如，检测脑脊液中的两种神经学标记，同时在血浆中检测这两种神经学标记之一。如实施例部分中所示，同样地检测两种不同体液中的相同标记可使检测更特定和灵敏，与只在一种体液中检测这种标记相比，可以更好地鉴别诊断神经变性。
在本发明的方法中检测的神经学标记可以是与某种类型的神经元细胞功能有关的任何一种蛋白质，它们在神经变性的条件下在一种或多种体液中的浓度指示了疾病过程或神经学病因。在一定的神经学疾病条件下，在一种或多种体液中，有些神经学标记的浓度升高了，另一些则降低了。在一定的神经学疾病条件下在某种体液中，3、4、5、6、7、8种或更多浓度发生改变的神经学标记的任何可能的组合可以用于特定检测、定量和/或鉴别诊断个体的所述神经学疾病。用于特定检测、定量和/或鉴别诊断神经变性的可能的神经学标记包括τ蛋白，神经元特异性烯醇化酶(NSE),β-淀粉状蛋白(1-42),β-淀粉状蛋白(1-40)，神经调制素，突触蛋白(诸如Rab3a,SNAP25,α-融合核素，突触蛋白，突触结合蛋白，小突触小泡蛋白，突触融合蛋白，Rab亲和蛋白，n-sec，半胱氨酸线性蛋白(cystein string protein)以及其他)，胶质原纤维酸性蛋白(GFAP),S100,IL6,TNF,IL1,IL2，神经纤丝(NF)，髓鞘碱性蛋白(MBP)和14-3-3。不过，这个名单并不完全，指示某种疾病过程或神经学病因的其他神经学标记也可以使用。其中一些神经学标记在患有不同神经学疾病和脑损害的病人的体液中的行为显示在表2中。
特异性识别上面所提到的神经学标记之一的、本领域中制备或存在的任何单克隆或多克隆抗体可以用于检测神经学标记。特异性识别τ蛋白的抗体包括Alz50(Ghanbari等，1990年)，Ab423(Harrington等，1991年)，AT8(国际申请公开WO 93/08302),AT120(Vandermeeren等，1993年)；AT180和AT270(国际申请公开WO 95/17429)以及AT100(国际申请公开WO 96/04309)。但也可以使用本领域中已知的特异性识别τ蛋白的其他抗体。特异性识别NSE的抗体包括10C1和2E7以及购自Innogenetics(Gent,Belgium)的其他抗体，商业上可获得的抗体，诸如可从Dako购得的(Glostrup,Denmark；Cat No BBS/NC/VI-H14)，从Biogenex购得的(San Ramon,CA,USA；Cat No MA055-5C和AM055-5M)，从RDI购得的(Flanders,NJ,USA；Cat No RDI-TRK4N6),从Roche Diagnostic Systems购得的(Basel,Switzerland；Cat No 0734373)，从Immunosource购得的(Brussels,Belgium；Cat No CLA 73/5和CR7041M)以及从Cortex Biochem购得的(San Leandro,CA,USA；Cat No CR7047)。这个有关识别NSE的抗体的名单并不完全，其他抗体(商业上获得的或本领域中描述的)也可以使用。特异性识别β-淀粉状蛋白的抗体包括2H3,8E5(Johnson-Wood等，1997年)，10H3(Majocha等，1992年；Friedland等，1994年)，2G3(Citron等，1996年)，BA-27和BC-05(Suzuki等，1994年)，BNT77(Asami-Odaka等，1995年)，369.2B(Knig等，1996年)，22C11(Lannfelt等，1995年)，6E10(Kim等，1990年)和AMY-33(Stern等，1990年)。但也可使用本领域中已知的识别β-淀粉状蛋白的另外任何一种抗体。特异性识别神经调制素的抗体包括NM2(Oestreicher等，1994年)，NM4(Six等，1992年)，NM1,NM3,NM6,NM7和NM8(Mercken等，1992a)。但也可使用本领域中已知的识别神经调制素的另外任何一种抗体。特异性识别Rab3a的抗体包括商业上可获得的抗体，诸如可从Transduction Labs购得的(Lexington,KY,USA；Cat No R35520)。也可使用商业上获得或本领域中描述的识别Rab3a的其他抗体。特异性识别SNAP25的抗体包括商业上可获得的抗体，诸如可从Serotec购得的(Oxford,UK；Cat No SP12)，从Sternberger Monoclonals公司购得的(Distributedby Affinity Research Products Lim.,Mamhead,Exeter,UK；Cat NoSMI-81)，从Chemicon购得的(Temecula,CA,USA；Cat No MAB331)和从Transduction Labs购得的(Lexington,KY,USA；Cat No S35020)。这个有关识别SNAP25的抗体的名单并不完全，也可以使用商业上获得的或本领域中描述的识别SNAP25的其他抗体。特异性识别α-融合核素的抗体包括商业上可获得的抗体，诸如可从Transduction Labs购得的(Lexington,KY,USA；Cat No S63320)。也可以使用商业上获得或本领域中描述的识别α-融合核素的其他抗体。用于特定检测有可能用作神经学标记的其他突触蛋白的各种抗体也是商业上可获得的和/或本领域中已知的。特异性识别S100的抗体包括商业上可获得的抗体，诸如可从Biogenex购得的(San Ramon,CA,USA；Cat No MA058-C和AM058-5M)和从Innogenetics购得的(Gent,Belgium；Cat No M-011)。这个有关识别S100的抗体的名单并不完全，也可以使用商业上获得的或本领域中描述的识别S100的其他抗体。特异性识别14-3-3的抗体包括商业上可获得的抗体，诸如可从Santa Cruz Biotechnology购得的(Santa Cruz,CA,USA；Cat No sc-1657)和从Transduction Labs购得的(Lexington,KY,USA；Cat No F46820)。这个有关识别14-3-3的抗体的名单并不完全，也可以使用商业上获得的或本领域中描述的识别14-3-3的其他抗体。特异性识别神经纤丝的抗体包括商业上可获得的抗体，诸如可从Innogenetics购得的(Gent,Belgium；Cat NoM-011和M-005)和从Alexis购得的(Lufelfingen,Switzerland；Cat No BC-4000-A-L001和BC-4010-A-L001)。这个有关识别神经纤丝的抗体的名单并不完全，也可以使用商业上获得的或本领域中描述的识别神经纤丝的其他抗体。
衍生自这些单克隆抗体的片段诸如Fab,F(ab)’2,ssFv(“单链可变片段”)和其他保留了抗体可变区的抗体样构造，假如它们保留了原始的结合性能，就可用于本发明的方法。这些片段一般利用，例如，木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或其他蛋白酶对抗体的酶促消化产生。对本领域技术人员来说众所周知的是，单克隆抗体或其片段可以修饰后用于各种用途。小抗体和多价抗体诸如二价体(diabodies)、三价体、四价抗体和五价体(peptabodies)也可以用于本发明的方法。国际专利申请WO98/29442中全面描述了这些片段和多价抗体的制备和使用。
用于本发明方法的单克隆抗体可以是利用重组DNA技术制成的鼠单克隆抗体的人源化变型，脱离了编码H和L链的鼠和/或人基因组DNA序列或编码H和L链的cDNA克隆。另外，用于本发明方法的单克隆抗体可以是人单克隆抗体。术语“人源化抗体”是指免疫球蛋白的至少一部分构架区衍生自人免疫球蛋白序列。
本发明方法中所用的抗体可以利用酶、荧光或放射性型的适宜标记物进行标记。
在本发明的具体实施方案中，至少一种要在上述方法中检测的神经学标记选自下列成员τ蛋白，磷酸-τ蛋白，β-淀粉状蛋白(1-42)，β-淀粉状蛋白(1-40)，神经调制素，神经元特异性烯醇化酶和/或突触蛋白。其中有一种选自上述成员的、3、4、5、6、7、8种或多种标记的任何可能的组合可以用于特定检测、定量和/或鉴别诊断个体的神经变性。很清楚，要用于本发明方法的1个以上(即2、3、4、5、6、7个或更多)或者甚至是所有神经学标记都可选自上述成员。
在本发明的更具体的实施方案中，要在上述方法中检测的1个、更优选2个、首选3个神经学标记选自下列成员-τ蛋白，β-淀粉状蛋白(1-42)和神经调制素；或-τ蛋白，神经元特异性烯醇化酶和神经调制素；或-τ蛋白，磷酸-τ蛋白和β-淀粉状蛋白(1-42)；或在另一个更具体的实施方案中，在一种体液(优选CSF)中检测τ蛋白，并在两种不同的体液(优选CSF和血浆)中检测β-淀粉状蛋白(1-42)。
在本发明的另一个更具体的实施方案中，要在上述方法中检测的至少一种神经学标记是选自下列成员的突触蛋白Rab3a、SNAP25和α-融合核素。其中有一种选自上述突触蛋白成员的、3、4、5、6、7、8种或多种标记的任何可能的组合可以用于特定检测、定量和/或鉴别诊断个体的神经变性。
因此，本发明也涉及新的检测脑脊液中的Rab3a的方法，该方法至少包含以下步骤-从个体获得脑脊液样品；和-在适合生成抗原-抗体复合物的条件下，使所述脑脊液样品与识别Rab3a的单克隆抗体(第一抗体或捕获抗体)接触；和-检测所述抗体与所述脑脊液样品的免疫结合。
尽管特异性识别Rab3a的抗体可以用于检测脑组织中的Rab3a，但检测脑脊液中的Rab3a时却没有这么显著。Davidsson等(1996年)利用他们所用的方法未能检测出脑脊液中的Rab3a。
能特定检测脑脊液中的Rab3a的任何抗体都可用于本发明的新方法。用于本发明方法的优选的单克隆抗体可以从Transduction Labs获得(Lexington,KY,USA；Cat No R35520)。
有利地，用于本发明的单克隆抗体为固定在适宜支持体上的固定化状态。另外，本发明的方法可以使用本领域技术人员已知的任何一种其他免疫测定形式加以实施。
然后进行检测免疫结合的过程将由抗原和识别Rab3a的抗体形成的所述抗原-抗体复合物与下列物质混合在一起
a)第二抗体(或检测抗体)*它可以是识别抗原-抗体复合物的表位但不识别单独的第一抗体的单克隆抗体；或者*它可以是识别抗原-抗体复合物的表位但不识别单独的第一抗体的多克隆抗体，所述多克隆抗体优选使用固定化Rab3a或Rab3a-第一抗体复合物通过免疫亲和层析纯化。
b)用于特异性标记所述第二抗体或与所述第二抗体偶联的标记，所述标记是本领域技术人员已知的任何可能的标记；c)用于进行抗体和脑脊液样品之间的、第二抗体和神经学标记-第一抗体复合物之间的和/或结合第二抗体和标记之间的免疫反应的适宜缓冲溶液；和d)出于标准化的目的，也可能是与识别Rab3a的抗体反应的纯化蛋白质或合成肽。
如本发明实施例中所示，多克隆Rab3a血清可以用作检测抗体。
有利地，第二抗体自身携带着标记或用于直接或间接与标记偶联的基团。
本发明也涉及新的检测脑脊液中的SNAP25的方法，该方法至少包含以下步骤-从个体获得脑脊液样品；和-在适合生成抗原-抗体复合物的条件下，使所述脑脊液样品与识别SNAP25的单克隆抗体(第一抗体或捕获抗体)接触；和-检测所述抗体与所述脑脊液样品的免疫结合。
尽管特异性识别SNAP25的抗体可以用于检测脑组织中的SNAP25，但检测脑脊液中的SNAP25时却没有这么显著且以前没有显示过。
能特定检测脑脊液中的SNAP25的任何抗体都可用于本发明的新方法。用于本发明方法的优选的单克隆抗体可以从Serotec获得(Oxford,UK；Cat No SP12)，从Sternberger Monoclonals公司获得(Di stributed by Affinity Research Products Lim.,Mamhead,Exeter,UK；Cat No SMI-81)，从Chemicon获得(Temecula,CA,USA；Cat No MAB331)或从Transduction Labs获得(Lexington,KY,USA；Cat No S35020)。
有利地，用于本发明的单克隆抗体为固定在适宜支持体上的固定化状态。另外，本发明的方法可以使用本领域技术人员已知的任何一种其他免疫测定形式加以实施。
然后进行检测免疫结合的过程将由抗原和识别SNAP25的抗体形成的所述抗原-抗体复合物与下列物质混合在一起a)第二抗体(或检测抗体)*它可以是识别抗原-抗体复合物的表位但不识别单独的第一抗体的单克隆抗体；或者*它可以是识别抗原-抗体复合物的表位但不识别单独的第一抗体的多克隆抗体，所述多克隆抗体优选使用固定化SNAP25或SNAP25-第一抗体复合物通过免疫亲和层析纯化。
b)用于特异性标记所述第二抗体或与所述第二抗体偶联的标记，所述标记是本领域技术人员已知的任何可能的标记；c)用于进行抗体和脑脊液样品之间的、第二抗体和神经学标记-第一抗体复合物之间的、和/或结合第二抗体和标记之间的免疫反应的适宜缓冲溶液；和d)出于标准化的目的，也可能是与识别SNAP25的抗体反应的纯化蛋白质或合成肽。
如本发明实施例中所示，多克隆SNAP25血清可以用作检测抗体。
有利地，第二抗体自身携带着标记或用于直接或间接与标记偶联的基团。
本发明也涉及新的检测脑脊液中的α-融合核素的方法，该方法至少包含以下步骤-从个体获得脑脊液样品；和-在适合生成抗原-抗体复合物的条件下，使所述脑脊液样品与识别α-融合核素的单克隆抗体(第一抗体或捕获抗体)接触；和-检测所述抗体与所述脑脊液样品的免疫结合。
尽管特异性识别α-融合核素的抗体可以用于检测脑组织中的α-融合核素，但检测脑脊液中的α-融合核素时却没有这么显著。由于以前从未报道过α-融合核素在脑脊液中的存在，人们甚至怀疑CSF中是否存在α-融合核素。首先，本发明人能显示脑脊液中存在α-融合核素。此外，开发出了用于定量检测脑脊液中的α-融合核素的精确方法。本发明人还显示α-融合核素在某些神经变性疾病(包括但不限于雷维小体病)条件下发生了变化。
能特定检测脑脊液中的α-融合核素的任何抗体都可用于这种新方法。用于本发明方法的优选的单克隆抗体可以从Transduction Labs获得(Lexington,KY,USA；Cat No R35520)。
有利地，用于本发明的单克隆抗体为固定在适宜支持体上的固定化状态。这种固定化状态可能是微量滴定板，其上涂覆或未涂覆抗-IgG。另外，本发明的方法可以使用本领域技术人员已知的任何一种其他免疫测定形式加以实施。
然后进行检测免疫结合的过程将由抗原和识别α-融合核素的抗体形成的所述抗原-抗体复合物与下列物质混合在一起a)第二抗体(或检测抗体)*它可以是识别抗原-抗体复合物的表位但不识别单独的第一抗体的单克隆抗体；或者*它可以是识别抗原-抗体复合物的表位但不识别单独的第一抗体的多克隆抗体，所述多克隆抗体优选使用固定化α-融合核素或α-融合核素-第一抗体复合物通过免疫亲和层析纯化。
b)用于特异性标记所述第二抗体或与所述第二抗体偶联的标记，所述标记是本领域技术人员已知的任何可能的标记；c)用于进行抗体和脑脊液样品之间的、第二抗体和神经学标记-第一抗体复合物之间的、和/或结合第二抗体和标记之间的免疫反应的适宜缓冲溶液；和d)出于标准化的目的，也可能是与识别α-融合核素的抗体反应的纯化蛋白质或合成肽。
有利地，第二抗体自身携带着标记或用于直接或间接与标记偶联的基团。
在优选的实施方案中，用于检测Rab3a、SNAP25和/或α-融合核素的这些方法可以与用于检测一种或多种其他神经学标记的方法结合使用，以特定地检测、定量和/或鉴别诊断个体的神经变性。
在更优选的实施方案中，用于检测Rab3a、SNAP25和/或α-融合核素的这些方法可以与用于检测一种或多种选自下列成员的神经学标记的方法结合使用τ蛋白，磷酸-τ蛋白，β-淀粉状蛋白(1-42),β-淀粉状蛋白(1-40)，神经调制素，神经元特异性烯醇化酶(NSE)。
更具体地说，用于特定检测、定量和/或鉴别诊断神经变性的神经学标记可以从以下几组中选择-τ蛋白，磷酸-τ蛋白，NSE,β-淀粉状蛋白(1-42),β-淀粉状蛋白(1-40)，神经调制素或Rab3a；或-τ蛋白，磷酸-τ蛋白，NSE,β-淀粉状蛋白(1-42),β-淀粉状蛋白(1-40)，神经调制素或SNAP25；或-τ蛋白，磷酸-τ蛋白，NSE,β-淀粉状蛋白(1-42),β-淀粉状蛋白(1-40)，神经调制素或α-融合核素。
选自上述各组的3、4、5、6或7个标记的任何可能的组合可以用于特定检测、定量和/或鉴别诊断个体的神经变性。
在另一个实施方案中，用于检测Rab3a、SNAP25和/或α-融合核素的方法可以一起使用来特定检测、定量和/或鉴别诊断神经变性。因此，本发明涉及其中两个或三个神经学标记选自Rab3a、SNAP25和α-融合核素的方法。
一个非常具体的实施方案涉及用于特定检测或定量早老性痴呆和/或雷维小体病和/或用于鉴别诊断早老性痴呆与雷维小体病的如上所述的方法，其中-至少测定脑脊液样品中α-融合核素的浓度；和/或-测定脑脊液样品中τ蛋白、β-淀粉状蛋白(1-42)和α-融合核素的浓度。
另一个非常具体的实施方案涉及用于特定检测或定量早老性痴呆和/或用于鉴别诊断早老性痴呆与其他痴呆的方法，其中-测定脑脊液样品中τ蛋白、β-淀粉状蛋白(1-42)和Rab3a的浓度；或-测定脑脊液样品中τ蛋白、β-淀粉状蛋白(1-42)和SNAP25的浓度。
另一个非常具体的实施方案涉及用于特定检测或定量早老性痴呆和/或帕金森氏病和/或用于鉴别诊断早老性痴呆与帕金森氏病的方法，其中测定脑脊液样品中τ蛋白、β-淀粉状蛋白(1-42)和神经调制素的浓度。
另一个非常具体的实施方案涉及用于特定检测或定量由化疗、接触化学物质和/或辐射而导致的神经变性的方法，其中测定脑脊液样品中τ蛋白、神经元特异性烯醇化酶和神经调制素的浓度。
另一个非常具体的实施方案涉及用于特定检测或定量个体为治疗白血病或脑肿瘤而因化疗、接触化学物质和/或辐射导致的神经变性的方法，其中测定脑脊液样品中τ蛋白、神经元特异性烯醇化酶和神经调制素的浓度。
另一个非常具体的实施方案涉及用于特定检测或定量由产前窒息导致的神经变性的方法，其中至少检测三种神经学标记。
另一个非常具体的实施方案涉及用于特定检测或定量额颞叶性痴呆和/或用于鉴别诊断额颞叶性痴呆与其他痴呆的方法，其中测定脑脊液样品中τ蛋白、磷酸-τ蛋白和β-淀粉状蛋白(1-42)的浓度。
另一个非常具体的实施方案涉及用于特定检测或定量早老性痴呆中的血管问题、用于鉴别诊断不同形式的早老性痴呆和/或用于鉴别诊断早老性痴呆与其他痴呆的方法，其中至少-定量测定脑脊液样品中τ蛋白和β-淀粉状蛋白(1-42)的浓度以及定量测定血浆样品中β-淀粉状蛋白(1-42)的浓度；或-定量测定脑脊液样品中磷酸-τ蛋白和β-淀粉状蛋白(1-42)的浓度以及定量测定血浆样品中β-淀粉状蛋白(1-42)的浓度；或-定量测定脑脊液样品中τ蛋白和磷酸-τ蛋白的浓度以及定量测定血浆样品中β-淀粉状蛋白(1-42)的浓度；或-定量测定脑脊液样品中τ蛋白、磷酸-τ蛋白和β-淀粉状蛋白(1-42)的浓度。
上述通过测定个体体液中的至少三种神经学标记的浓度来特定检测、定量和/或鉴别诊断所述个体的神经变性的方法可以单独使用、与容易监控的神经学终点(例如白细胞计数)结合使用、或与测量血浆中的药物浓度结合使用。
本发明还涉及用于特定检测、定量和/或鉴别诊断个体的神经变性的诊断试剂盒，它包含至少三种各自识别所述个体的一种或多种体液样品中的不同神经学标记的抗体。
更具体地说，本发明涉及用于特定检测、定量和/或鉴别诊断个体的神经变性的诊断试剂盒，它至少包含支持体诸如微量滴定板，该滴定板上加有在一起或在分离的孔中的至少三种各自识别所述个体的一种或多种体液样品中的不同神经学标记的抗体。
本发明还涉及用于特定检测、定量和/或鉴别诊断个体的神经变性的试剂盒，它包含-支持体诸如微量滴定板，该滴定板包含在一起或在分离的孔中的至少三种各自识别不同神经学标记的抗体(第一抗体或捕获抗体)；-第二抗体(检测抗体)，各自识别其中一种神经学标记-第一抗体复合物*它可以是能与神经学标记-第一抗体复合物的表位形成免疫复合物但不能与单独的第一抗体形成免疫复合物的单克隆抗体；或者*它可以是能与神经学标记-第一抗体复合物的表位形成免疫复合物但不能与单独的第一抗体形成免疫复合物的多克隆抗体，所述多克隆抗体优选使用固定化神经学标记或神经学标记-第一抗体复合物通过免疫亲和层析纯化；-可能的话，用于特异性标记所述第二抗体或与所述第二抗体偶联的标记；-可能的话，用于进行第一抗体和体液样品之间的、第二抗体和神经学标记-第一抗体复合物之间的和/或结合第二抗体和标记之间的免疫反应的适宜缓冲溶液；-可能的话，出于标准化的目的，用于检测神经学标记的、由该试剂盒的抗体特异性识别的纯化蛋白质或合成肽。
在具体的实施方案中，本发明涉及各自设计用于实施如上所述的一个或多个方法的如上所述的诊断试剂盒。
更具体地说，本发明涉及如上所述的诊断试剂盒，它至少包含特异性识别以下物质的抗体-α-融合核素；或-τ蛋白，β-淀粉状蛋白(1-42)和α-融合核素；或-τ蛋白，β-淀粉状蛋白(1-42)和Rab3a；或-τ蛋白，β-淀粉状蛋白(1-42)和SNAP25；或-τ蛋白，β-淀粉状蛋白(1-42)和神经调制素；或-τ蛋白，神经元特异性烯醇化酶和神经调制素；或-τ蛋白，磷酸-τ蛋白和β-淀粉状蛋白(1-42)；或-τ蛋白和β-淀粉状蛋白(1-42)；本发明还涉及用于检测脑脊液中的Rab3a的试剂盒，它至少包含识别Rab3a的单克隆抗体。
本发明还涉及用于检测脑脊液中的Rab3a的试剂盒，它至少包括含有识别Rab3a的单克隆抗体的支持体，诸如微量滴定板。
更具体地说，本发明涉及用于检测脑脊液中的Rab3a的试剂盒，它包含-至少，含有识别Rab3a的单克隆抗体(第一抗体或捕获抗体)的支持体，诸如微量滴定板；-第二抗体(或检测抗体)*它可以是能与Rab3a-第一抗体复合物的表位形成免疫复合物但不能与单独的第一抗体形成免疫复合物的单克隆抗体；或者*它可以是能与Rab3a-第一抗体复合物的表位形成免疫复合物但不能与单独的第一抗体形成免疫复合物的多克隆抗体，所述多克隆抗体优选使用固定化Rab3a或Rab3a-第一抗体复合物通过免疫亲和层析纯化；-可能的话，用于特异性标记所述第二抗体或与所述第二抗体偶联的标记；-可能的话，用于进行抗体和脑脊液样品之间的、第二抗体和Rab3a-第一抗体复合物之间的和/或结合第二抗体和标记之间的免疫反应的适宜缓冲溶液；-可能的话，出于标准化的目的，用于检测Rab3a的、由该试剂盒的抗体特异性识别的纯化蛋白质或合成肽。
本发明还涉及用于检测脑脊液中的SNAP25的试剂盒，它至少包含识别SNAP25的单克隆抗体。
本发明还涉及用于检测脑脊液中的SNAP25的试剂盒，它至少包括含有识别SNAP25的单克隆抗体的支持体，诸如微量滴定板。
更具体地说，本发明涉及用于检测脑脊液中的SNAP25的试剂盒，它包含-至少，含有识别SNAP25的单克隆抗体(第一抗体或捕获抗体)的支持体，诸如微量滴定板；-第二抗体(或检测抗体)*它可以是能与SNAP25-第一抗体复合物的表位形成免疫复合物但不能与单独的第一抗体形成免疫复合物的单克隆抗体；或者*它可以是能与SNAP25-第一抗体复合物的表位形成免疫复合物但不能与单独的第一抗体形成免疫复合物的多克隆抗体，所述多克隆抗体优选使用固定化SNAP25或SNAP25-第一抗体复合物通过免疫亲和层析纯化；-可能的话，用于特异性标记所述第二抗体或与所述第二抗体偶联的标记；-可能的话，用于进行抗体和脑脊液样品之间的、第二抗体和SNAP25-第一抗体复合物之间的和/或结合第二抗体和标记之间的免疫反应的适宜缓冲溶液；-可能的话，出于标准化的目的，用于检测SNAP25的、由该试剂盒的抗体特异性识别的纯化蛋白质或合成肽。
本发明还涉及用于检测脑脊液中的α-融合核素的试剂盒，它至少包含识别α-融合核素的单克隆抗体。
本发明还涉及用于检测脑脊液中的α-融合核素的试剂盒，它至少包括含有识别α-融合核素的单克隆抗体的支持体，诸如微量滴定板。
更具体地说，本发明涉及用于检测脑脊液中的α-融合核素的试剂盒，它包含-至少有支持体，诸如含有(可能通过抗-IgG抗体)直接与微量滴定板相连的识别α-融合核素的单克隆抗体(第一抗体或捕获抗体)的微量滴定板；-第二抗体(或检测抗体)*它可以是能与α-融合核素-第一抗体复合物的表位形成免疫复合物但不能与单独的第一抗体形成免疫复合物的单克隆抗体；或者*它可以是能与α-融合核素-第一抗体复合物的表位形成免疫复合物但不能与单独的第一抗体形成免疫复合物的多克隆抗体，所述多克隆抗体优选使用固定化α-融合核素或α-融合核素-第一抗体复合物通过免疫亲和层析纯化；-可能的话，用于特异性标记所述第二抗体或与所述第二抗体偶联的标记；-可能的话，用于进行抗体和脑脊液样品之间的、第二抗体和α-融合核素-第一抗体复合物之间的和/或结合第二抗体和标记之间的免疫反应的适宜缓冲溶液；-可能的话，出于标准化的目的，用于检测α-融合核素的、由该试剂盒的抗体特异性识别的纯化蛋白质或合成肽。
本发明还涉及如上所述的任一方法或任一试剂盒用于医疗监控和/或确定某种治疗的有效性的用途。
描述对已公开的任何一种标记具有特异性的抗体的所有参考文献的内容都结合到本发明的说明书中作为参考。
以下实施例仅仅是用于阐述本发明。
表格表1．化疗的神经学并发症(部分名单)
表2．许多神经学标记在某些神经变性疾病下的行为
+神经学标记的量增加；-神经学标记的量减少；=神经学标记的量没有变化。简写AD早老性痴呆；PD帕金森氏病；CJD克罗伊茨费尔特-雅各布病；GBS急性热病性多神经炎；ALS肌萎缩性侧索硬化；MS多发性硬化；P-τ磷酸-τ；NSE神经元特异性烯醇化酶；βA(1-42):β-淀粉状蛋白(1-42)；βA(1-40):β-淀粉状蛋白(1-40)；NM神经调制素；NF神经纤丝。
表3．小鼠用α-融合核素免疫接种后得到的效价
表4．脑脊液中细胞内蛋白的浓度(均值±SD)
AU=任意单位*与对照有显著性差异(p≤0.05；Whitney检验)**来自对照病人的有关β-淀粉状蛋白(1-42)在脑脊液中的浓度的数据未得到。
表5．每种单独的标记以及各种标记的组合的似然比
*来自对照病人的有关β-淀粉状蛋白(1-42)在脑脊液中的浓度的数据是从另一项研究中得到的。
表6．加入本研究的病人的特性
表6．加入本研究的病人的特性(续)
表7a．对于有B细胞NHL的病人的治疗方案(UKCCSG 9602)
表7a．续
IT=鞘内给药；IV=静脉内给药；PO=口服；LP=腰椎穿刺；MTX=甲氨蝶呤；Ara-C=阿糖胞苷表7b．对于有非B细胞ALL/NHL的病人的治疗方案(EORTC58881)
表7b．续
表7c．对于有AML的病人的治疗方案(EORTC 58921)
IT=鞘内给药；IV=静脉内给药；PO=口服；SC=皮下给药；LP=腰椎穿刺；Ara-C=阿糖胞苷；VP16=
表8．实施例7中所述的4组病人的τ蛋白、β-淀粉状蛋白(1-42)和神经调制素的平均脑脊液浓度
*与对照比有显著性差异(p＜0.01；双侧Wilcoxon检验)浓度表示为pg/ml，均值±标准误差表9．患有早老性痴呆、帕金森氏病的病人和年龄相当的对照病人的τ蛋白、β-淀粉状蛋白(1-42)和神经调制素的平均脑脊液浓度
**与对照病人比有显著性差异(p＜0.01)；*与对照病人比有显著性差异(p＜0.05)；++与AD病人比有显著性差异(p＜0.01)；+与AD病人比有显著性差异(p＜0.05)。生物学参数的结果用pM表示(均值±SD)。NM=神经调制素；AD=早老性痴呆；PD=帕金森氏病；C=对照病人。


图1．实施例1.3中所述的蛋白质印迹，显示了Rab3a在早老性痴呆和对照病人的脑的颞皮质中的免疫反应性。1、12.8μl对照病人n°3；2、6.4μl对照病人n°3；3、3.2μl对照病人n°3；4、1.6μl对照病人n°3；5、1.0μl对照病人n°3；6、10μl对照病人n°3；7、10μl AD病人n°1；8、10μl AD病人n°2；9、10μl对照病人n°1；10、10μl对照病人n°2；11、10μl AD病人n°3；12、10μl对照病人n°4。
图2．突触蛋白Rab3a(a)和SNAP25(b)在脑脊液中的稳定性。如实施例1.5中所述，突触蛋白的降解经由对突触蛋白具有特异性的夹心ELISA测量。将纯化突触蛋白掺加在CSF集合体中并在37℃下培养过夜(图例Rab3a在CSF中；SNAP25在CSF中)。作为对照，将突触蛋白掺加在相同的CSF集合体中并直接测量(图例Rab3a；SNAP25)。还测定在1％BSA中的稳定性(结果未显示)。
图3．对购自Transduction Labs的α-融合核素的抗体(Lexington,KY,USA；Cat No S63320)的特异性的说明。ACoumassie染色凝胶；B用抗-His单克隆抗体展开的蛋白质印迹，以显示所有产物的表达；C用购自Transduction Labs(Lexington,KY,USA)的单克隆抗体展开的蛋白质印迹。泳道1表达α-融合核素的大肠杆菌；泳道2表达β-融合核素的大肠杆菌；泳道3表达γ-融合核素的大肠杆菌；泳道4含有表达神经元特异性烯醇化酶的大肠杆菌的对照泳道；泳道5分子量标准物；泳道6没有任何质粒的大肠杆菌菌株。
图4．检测200ml CSF中的α-融合核素。如实施例2.2中所述，混合CSF借助Rotophor按照分子量和等电点分离。M分子量标记；R1:pI3；R2:pI4；R3:pI4.5；R4:pI4.5；R5:pI5；R6:pI5；R7:pI5.5；R8:pI6；R9:pI6；R10:pI6.5；R11:pI6.5；R12:pI7；R13:pI7；R14:pI7.5。
图5．用于单克隆抗体3B5和9B6对α-融合核素的羧基末端作图的α-融合核素和重叠肽的氨基酸序列。用于肽合成的羧基端部分用粗体显示。图中显示了被单克隆抗体和商品抗体(Clone 42,IgG1,Transduction Labs,Lexington,KY,USA)识别的肽。
图6．不同的α-融合核素羧基端肽与抗体3B5、9B6和Clone 42反应后得到的光密度(OD)。光密度在实施例2.4所述的免疫测定中测量。X轴上的号码(1-12)与图5中所示的肽的号码一致。
图7．如实施例1.6和3.1中所述的、用夹心ELISA测量的、32名AD病人、20名患有血管性痴呆(MID)的病人和11名对照病人的CSF中的Rab3a和τ蛋白的浓度。
图8．实施例4.1中所述的AD病人的Rab3a和SNAP25、Rab3a和β-淀粉状蛋白(1-42)以及Rab3a和τ蛋白的CSF-浓度之间的相互关系。Rab3a、SNAP25、τ蛋白和β-淀粉状蛋白(1-42)的浓度如实施例1.6和3所述用夹心ELISA测量。
图9．给予任何治疗之前的诊断时的τ值1、AML(3)；2、AML-CNS+(1)；3、Down AML(2)；4、脊髓发育不良(2)；5、其他[成神经管细胞瘤(2)，横纹肌肉瘤(2)，颅内胚细胞瘤(1)]；6、B-NHL(8)；7、霍奇金病(3)；8、Down NB ALL(1)；9、NB ALL(21)；10、NB ALL-Brachman综合征(1)；11、NB ALL-CNS+(1)；12、NB ALL-VHR(4)；13、对照(6)。(病人数)。
图10．CSF神经学标记τ蛋白(a)、神经调制素(b)、β-淀粉状蛋白(1-42)(c)和NSE(d)、血清LDH(e)和CSF WBC(f)在第1天时的浓度。1、AML；2、AML-CNS+；3、Down AML/MDS；4、脊髓发育不良；5、慢性骨髓瘤性白血病(myelomic leukemia)；6、B-NHL；7、霍奇金病；8、Down NB ALL；9、NB ALL；10、NB ALL-Brachman综合征；11、NB ALL-CNS+；12、NB ALL-VHR；13、LCH，横纹肌肉瘤，胚细胞瘤，成神经管细胞瘤，绒膜癌；14、对照，成视网膜细胞瘤(健康的)，hemofagocytose(gezond HLH)。实施例3中描述了这些标记的检测方法。
图11．B细胞NHL病人的化疗过程中，CSF神经学标记τ蛋白(a)、神经调制素(b)和神经元特异性烯醇化酶(c)在各次腰椎穿刺(LP)操作中的浓度。X轴上的数字对应于表7a中给出的LP数。实施例3中描述了这些标记的检测方法。
图12．13名非B ALL病人在化疗的不同阶段，CSF神经学标记τ蛋白(a)和神经调制素(b)的浓度。实施例3中描述了这些标记的检测方法。
图13．非B细胞ALL病人的化疗过程中，CSF神经学标记τ蛋白(a)、β-淀粉状蛋白(1-42)(b)、神经调制素(c)和神经元特异性烯醇化酶(d)在各次腰椎穿刺(LP)操作中的浓度。X轴上的数字对应于表7b中给出的LP数。实施例3中描述了这些标记的检测方法。
图14．AML病人的化疗过程中，τ蛋白(a)和神经调制素(b)在各次腰椎穿刺(LP)操作中的浓度。X轴上的数字对应于表7c中给出的LP数。实施例3中描述了这些标记的检测方法。
图15．τ蛋白(a)、β-淀粉状蛋白(1-42)(b)和神经调制素(或生长相关蛋白43)(c)各自在如实施例7中所述归类称为神经学对照(急性热病性多神经炎，多发性硬化等)(1 CONT)、有记忆力损伤的人(2 MEM)、症状发生前的家族性早老性痴呆病人(PS1突变)(3 PFAD)、家族性早老性痴呆病人(PS1突变)(4 FAD)、早老性痴呆病人(5 AD)和有血管性痴呆的病人(6 VAD)的个体中的浓度。β-淀粉状蛋白(1-42)的浓度如实施例3中所述进行测量。数据用pg/ml表示。
图16．τ蛋白和神经调制素在60名患有早老性痴呆(AD)的病人和32名年龄相当的对照病人中的各自浓度之间的相互关系。τ蛋白和神经调制素的浓度如实施例3中所述进行测量。
图17．τ/nm和β-淀粉状蛋白(1-42)在患有早老性痴呆(AD)、帕金森氏病(PARK)的病人和对照病人(CONT)中的各自浓度之间的相互关系。τ蛋白、神经调制素和β-淀粉状蛋白(1-42)的浓度如实施例3中所述进行测量。
实施例实施例1CSF中Rab3a和SNAP25的检测1.1 Rab3a和SNAP25的克隆利用制造商提供的扩增方案，用特异性引物来扩增编码来自Quick-ScreenTM人类cDNA文库(Clontech,Palo Alto,CA,USA；CatNo K1003-1)的序列的Rab3a和SNAP25。简而言之94℃下培养45秒、60℃下退火45秒、72℃下用Taq聚合酶(Stratagene,Amsterdam,TheNetherlands；Cat No 600131)延伸2分钟，以上操作循环35次。最后在72℃下进行7分钟聚合酶延伸反应使该程序结束。反应在Perkin-Elmer(überlingen,Germany)DNA循环变温加热器(480型)上进行。用于扩增Rab3a的引物的序列是基于人Rab3a序列(Zahraoui等，1989年)ATG引物ATG GCA TCG GCC ACA GAC TCG CGC TAT GGG(Tm=76℃)和反向引物CGCG TCTAG AGG CTC TCA GCA GGC GCA GTC CTGGTG CGG(Tm=77℃)。用于扩增SNAP25的引物的序列是基于人SNAP25序列(Zhao等，1994年)ATG引物ATG GCC GAA GAC GCA GAC ATGCGC AAT GAG(Tm=75℃)和反向引物CGCG CTAG ACA CTT AAC CAC TTCCCA GCA TCT TTG TTG(Tm=59℃)。
将PCR产物再次扩增，以产生足够多量的PCR产物，用T4 DNA聚合酶补齐，用XbaⅠ切割并连接在NcoⅠ-钝化的、XbaⅠ切割pIGRHISA(Innogenetics,Gent,Belgium；Cat No 2075)中。于是，对于Rab3a产生了pIGRHISARab3a(Innogenetics,Gent,Belgium；Cat No 3008),对于SNAP25产生了pIGRH6SNAP25a(Innogenetics,Gent,Belgium；Cat No 2941)。将连接产物转化成DH1(λ)(Bachmann,1987年)，并分析四环素抗性集落的插入片段的存在。对插入片段测序，含有正确序列的质粒(Zahraoui等，1989年；Zhao等，1994年)用于后面的步骤。对于Rab3a存在一些PCR人工产物。正确的序列从两种克隆进行装配。
1.2 Rab3a和SNAP25的表达和纯化Rab3a和SNAP25分别使用基于PL的表达系统pIGRHISARab3a和pIGRH6SNAP25a在大肠杆菌中表达。用热敏cI阻抑物将正确的质粒转化成MC1061 pACI(Wertman等，1986年)。在12.5％的丙烯酰胺凝胶上可见25kDa左右的coumassie可染色条带，指示了合理的表达水平。重组蛋白制成含有6个另外的组氨酸残基的融合蛋白标记物，以使经过NiIMAC柱迅速纯化。使用3升热诱导的大肠杆菌将10mg以上的重组Rab3a和SNAP25纯化达到至少95％均一性(Hochuli,1988年；Van Gelder等，1993年)。
1.3 Rab3a和SNAP25特异性抗体的产生和特性描述在兔子体内培养重组Rab3a和SNAP25的抗体。将50μg纯化蛋白质腹膜内注射到两只兔子体内(100μg/只兔子)。注射每4周进行一次，并用ELISA测定效价。在脑提取物上描绘抗体的特性。有关Rab3a的免疫反应性的结果显示在图1中。来自早老性痴呆病人和对照病人的组织样本通过在5体积的1％SDS,1％钒酸钠，10mM Tris pH7.4中迅速匀浆并在水浴中煮沸5分钟而制备。匀浆液离心(12000g，室温)5分钟以除去不溶物质。将少量上清液样品用于使用BCA法测量蛋白质浓度(Pierce,Rockford,Illinois,USA)。上清液用水稀释至蛋白质浓度为2mg/ml，并加入等体积的2x样品缓冲液(250mM Tris pH6.8,3％SDS,10％甘油，0.006％溴酚蓝和2％β-巯基乙醇)。按照Laemmli系统在10-12.5％凝胶上进行凝胶电泳。用半干印迹法将蛋白质转移到硝化纤维素上(Schleicher和Schuell,Dassel,Germany；Cat No401196)。该硝化纤维素过滤器用在10mM Tris pH7.5,150mM NaCl中的1％BSA封闭。以在1％BSA中的适宜浓度(±1μg/ml)下加入第一抗体和第二抗体。
1.4 Rab3a和SNAP25特异性抗体的免疫亲和纯化纯的重组抗原在0.3M NaHCO3,pH8.6中透析过夜。测定透析前后的OD280值来估计蛋白质的量。用Mini-Leak-Medium(KEM-EN-TECBiozyme,Vancouver,BC,Canada；Cat No 10127,Lot No 60232-5)按照制造商提供的说明对抗体进行免疫提纯。将部分抗体生物素化(Amersham,Place Little Chalfont Buchinghamshire,UK；Cat No RPN2202)。利用银染和蛋白质印迹来监控纯化和标记情况(结果未显示)。
1.5 Rab3a和SNAP25在CSF中的稳定性和存在的评估使用特异性单克隆抗体(Transduction Labs,Lexington,KY,USA；R35520和S35020)作为捕获抗体，免疫纯化的多克隆兔抗血清作为检测抗体，在CSF中掺加的突触蛋白Rab3a和SNAP25的稳定性在37℃下培养过夜后再评估。在500pg/ml浓度下，SNAP25和Rab3a的重组免疫反应性在测试的CSF中过夜后没有变化(图2)。
有关CSF中存在这两种蛋白质的直接证据通过从50ml CSF提取白蛋白和IgG并在柱上分级分离而得到。将各级分干燥并溶于样品缓冲液，在12％丙烯酰胺凝胶上流过并作印迹。PVDF膜用Rab3a和SNAP25单克隆抗体探测。检测预期分子量和pI值的免疫反应条带。
1.6用于Rab3a和SNAP25检测和CSF浓度的定量测定的夹心ELISA的开发在以单克隆Rab3a或SNAP25抗体作为捕获抗体和以生物素化的免疫亲和纯化的多克隆抗体作为检测抗体的基础上开发夹心ELISA。Maxisorp微量滴定板涂覆Affini纯山羊抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.,West Grove,Pennsylvania,USA；CatNo 115-035-144)。在PBS中的1％BSA(临床级98％脂肪酸游离；ICN,Biomedical Research Products,Costa Mesa,CA,USA；Cat No 105033,Lot No 6p384)用作封闭缓冲液。加入在封闭缓冲液中稀释1/1000倍的小鼠抗-Rab3a(Transduction Labs,Lexington,KY,USA；Cat NoR35520,IgG2a,Clone 9,Lot No 606-259-1550 lot 2)或抗-SNAP25(Transduction Labs,Lexington,KY,USA；Cat No S35020,IgG1,Clone 20)。培养后，加入不同浓度的重组抗原(浓度范围40000-2.56pg/ml)。同时加入亲和纯化的兔抗-Rab3a或抗-SNAP25抗血清，加入浓度应使得到最佳的背景-信号比。然后经由辣根标记的链霉抗生物素蛋白(Immuno Research Laboratories,Inc.,West Grove,Pennsylvania,USA；Cat No 016-030-084)在1/2000的稀释度下检测生物素化的兔抗体。偶联过氧化物酶经由TMB,H2O2底物溶液检测。与2N H2SO4反应30分钟后反应停止，在450nm测量吸光度。基于这种ELISA，可以检测浓度低至10pg/ml的Rab3a。有关SNAP25的测定基于相同的原理。实施例2α-融合核素在脑脊液中的存在和检测2.1有关商品抗体对α-融合核素的特异性的评估评估可从商业上获得的单克隆抗体(Transduction Labs,Lexington,KY,USA；Cat No S63320,IgG1)对不同的融合核素同种型的特异性。α-融合核素、β-融合核素和γ-融合核素可读框(从ATG到终止密码子)从人类脑cDNA文库(HL5081；Clontech,Palo Alto,CA,USA)开始使用基于公开的序列数据的引物(α-融合核素登记号L08850；β-融合核素登记号S69965；γ-融合核素登记号AF010126)进行扩增。据报道，在γ-融合核素的原始序列中有一些重要的氨基酸变化K12E和K68E，并且在这个克隆中氨基酸109的多态性是E109V。插入片段在于氨基端加入了6个另外的组氨酸的基于PL的表达系统(ICCG 3307；Innogenetics,Gent,Belgium)中亚克隆。附加了His的融合核素融合蛋白标记物在大肠杆菌中进行表达。随后该大肠杆菌蛋白在SDS-PAGE上运行，并用购自Transduction Labs(Lexington,KY,USA)的商品单克隆抗体进行免疫印迹分析。这种单克隆抗体显示将对α-融合核素是特异性的，绘制该融合核素蛋白的羧基端部分的图(图3)。
2.2α-融合核素在脑脊液中的存在的评估将来自多个病人的CSF混合。200ml混合的CSF按照等电点借助Rotophor分离。随后，所得级分在SDS-PAGE上运行，并用购自Transduction Labs(Lexington,KY,USA)的单克隆抗体进行免疫印迹分析。在19kDa范围内并且pI在4-6的范围内检测到两个免疫反应条带(图4)。较低的条带可能是C端截短形式，因为一些阴性电荷的氨基酸(末尾20个氨基酸中的6E)的缺失导致pI向更具碱性的一端迁移。在这种免疫反应性的基础上，估计α-融合核素的浓度范围在pg/ml范围内。
2.3 α-融合核素特异性抗体的产生和特性描述α-融合核素从3升诱导大肠杆菌培养物纯化，使得纯化10mg以上α-融合核素(从coumassie和银染色凝胶估计纯度在90％以上)。将蛋白质按照几种免疫接种方案(表3)注射到小鼠体内。4次注射后，在包被ELISA中评估对α-融合核素的效价。6只小鼠的效价超过100000(效价定义为导致OD值两倍于背景的血清稀度)。
最后一次注射后三天，从动物312(m3)取出脾细胞并用于主要按照Khler和Milstein(1975年)所述的方法进行的细胞融合。在第一次筛选循环中，杂交瘤在直接包被测定中测试特异性抗体的存在。随后，在含有α-、β-、γ-融合核素和来自α-融合核素的缺失突变体的大肠杆菌裂解液的斑点印迹上再次对它们进行测试，以选出能产生识别融合核素蛋白上的不同表位的抗体的杂交瘤。
2.4α-融合核素特异性抗体的特性描述分离出两种杂交瘤3B5(IgG2a)和9B6(IgG1)，在斑点印迹上它们对α-融合核素具有特异性。为了确定其精确表位，将羧基端部分(64-140位)合成为10个重叠肽(图5)。这些肽为14个氨基酸长，有7个氨基酸重叠。生物素化肽以1μg/ml的浓度捕捉在链霉抗生物素蛋白包被的滴定板上。α-融合核素特异性抗体在这些肽上培养，随后用抗小鼠酶偶联抗体检测。酶，辣根过氧化物酶，使用三甲基联苯胺作为底物进行测量。3B5和9B6都识别含有序列LEDMPVDPDNEAYE(113-126位)的肽，提示了这种单克隆抗体的线型表位(图6)。在同一组实验中，先前已显示识别α-融合核素的商品抗体(Clone 42,IgG1,Transduction Labs,Lexington,KY,USA；Cat No S63320)也能绘制成线型表位(序列AGSIAAATGFVKKD,85-98位)(图6)。
2.5α-融合核素特异性抗体的纯化和生物素化在第二和第三次亚克隆循环后，抗体的生成按比例扩大至1-2升，以用于10-20mg抗体的纯化。用Mini-Leak-Medium(KEM-EN-TECBiozyme,Vancouver,BC,Canada；Cat No 10127,Lot No 60232-5)按照制造商提供的说明对抗体进行免疫提纯。
生物素化按照已完全确定的步骤(Bonhard等，1984年)使用D-生物素酰基-η-氨基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(Boehringer-Mannheim,Brussels,Belgium；Cat No 1008960)进行。
2.6用于α-融合核素检测和脑脊液浓度的定量测定的夹心ELISA的开发在以α-融合核素抗体作为捕获抗体并以一种生物素化单克隆抗体作为检测抗体的基础上开发夹心ELISA。Maxisorp微量滴定板涂覆Affini纯山羊抗小鼠IgG(Jackson Immuno Research Laboratories,Inc.,West Grove,Pennsylvania,USA；Cat No 115-035-144)。在PBS中的1％BSA(临床级98％脂肪酸游离；ICN,Biomedical ResearchProducts,Costa Mesa,CA,USA；Cat No 105033,Lot No 6p384)+1％小鼠血清用作封闭缓冲液。加入用封闭缓冲液稀释1/1000倍的抗-α-融合核素(Transduction Labs,Lexington,KY,USA)。培养后，加入不同浓度的重组抗原(浓度范围1000-2pg/ml)。同时在1％小鼠抗体的存在下加入生物素化抗-α融合核素单克隆抗体，加入浓度应使得到最佳的背景-信号比。然后经由辣根标记的链霉抗生物素蛋白(JacksonImmuno Research Laboratories,Inc.,West Grove,Pennsylvania,USA；Cat No 016-030-084)在1/2000的稀释度下检测生物素化的兔抗体。偶联过氧化物酶通过TMB,H2O2底物溶液检测。与2NH2SO4反应30分钟后反应停止，在450nm测量吸光度。实施例3脑脊液中其他神经学标记的检测3.1τ和磷酸-τ总的τ蛋白用τ抗原试验测量，使用AT120作为捕获抗体，用生物素化HT7-BT2作为检测抗体(INNOTEST hTau抗原，Innogenetics,Gent,Belgium)。单克隆抗体AT120同等良好地与正常和过磷酸化人τ蛋白反应(Vandermeeren等，1993年)，单克隆抗体HT7也同等良好地与正常和过磷酸化人τ蛋白反应，而单克隆抗体BT2优先识别正常τ蛋白(Goedert等，1994年)。如先前所述制备的(Mercken等，1992b)亲和纯化的τ蛋白用作标准物。
磷酸-τ用夹心ELISA测量，使用HT7作为捕获抗体，生物素化AT270作为检测抗体(INNOTEST磷酸-τ(181),Innogenetics,Gent,Belgium)。AT270特异性识别磷酸-τ(国际申请公开WO 95/17429)。
3.2β-淀粉状蛋白(1-42)β-淀粉状蛋白(1-42)浓度用Innotestβ-淀粉状蛋白(1-42)(Innogenetics,Gent,Belgium)测量。该测定法是夹心型ELISA，其中第一单克隆抗体21F12(对淀粉状蛋白的羧基端有特异性)用作捕获抗体，生物素化3D6(对氨基端有特异性)用作检测抗体。21F12/3D6的组合能特异性检测淀粉状蛋白(1-42)肽。对于淀粉状蛋白(1-43)观察到一些交叉反应性，但对于较短的肽则没有观察到(Citron等，1997年；Johnson-Wood等，1997年)。简言之，将21F12抗体悬浮于10mMTris-10mM NaCl并涂敷到Nunc Maxisorbs微量滴定板上在4℃下过夜。经过一次洗涤步骤后，滴定板在25℃下用PBS-0.1％酪蛋白封闭2小时。该试验通过同时培养(1小时，25℃)75μl生物素化3D6和25μl CSF或标准物而进行。经过数次洗涤步骤后，束缚抗体的量通过加入100μlHRP-链霉抗生物素蛋白(RDI,Flanders,New York,NY,USA)进行检验。在25℃下继续培养30分钟。然后，加入100μl 0.42mM 3,5,3’,5’-四甲基联苯胺作为过氧化物酶底物。与50μl 0.9N H2SO4反应30分钟后停止反应。
3.3β-淀粉状蛋白(1-40)测量β-淀粉状蛋白(1-40)的浓度，使用购自Quality ControlledBiochemicals(QCB,Hopkinton,MA,USA)的C端特异性亲和纯化多克隆抗体作为捕获抗体，3D6(Citron等，1997年；Johnson-Wood等，1997年)作为检测抗体。Nunc Maxisorps微量滴定板在25℃下用在10mMTris-10mM NaCl缓冲液中的5μg/ml亲和纯化山羊抗兔IgG(H+L)(Jackson Immuno Research Laboratories,Inc.,West Grove,Pennsylvania,USA；Cat No 111-005-144)包被2小时。之后，滴定板在4℃下用PBS-0.1％酪蛋白封闭过夜。在25℃下以0.5μg/ml的浓度加入兔多克隆抗体(QCB,Hopkinton,MA,USA；Cat No 44-348-20)1小时。经过数次洗涤步骤后，100μl CSF或标准物在25℃下培养2小时。束缚淀粉状蛋白的量通过加入100μl生物素化3D6抗体进行检验，在25℃下以在缀合稀释剂中的0.1μg/ml的浓度加入1小时。滴定板再次洗涤5次。束缚抗体的量通过加入100μl SV-AP(Gibco,Rockville,MD,USA；Cat No JK-4410)进行检验。在25℃下继续培养1小时。经过最后的洗涤步骤(5次)后，加入100μl溶解在底物缓冲液中的TMB作为过氧化物酶底物。与50μl 0.9N H2SO4反应30分钟后停止反应。
3.4神经调制素神经调制素也用夹心型ELISA测量，使用两种表位特异性单克隆抗体(NM2,NM4；Oestreicher等，1994年)。NM2选择作为捕获抗体，生物素化NM4作为检测抗体。重组神经调制素用作标准物。
3.5神经元特异性烯醇化酶NSE的测量是基于夹心ELISA，使用抗-NSE单克隆抗体2E7作为捕获抗体，用过氧化物酶标记的抗-NSE单克隆抗体10C1作为检测抗体。来自人脑的纯化NSE用作标准物(Vanmechelen等，1997年)。
蛋白质浓度用BCA蛋白试剂(Pierce,Rockford,Illinois,USA)测定。实施例4联合测定，使用CSF-Rab3a、CSF-SNAP25、CSF-τ和CSF-β-淀粉状蛋白(1-42)作为神经学标记，用于特定检测早老性痴呆和鉴别早老性痴呆与年龄相当的对照者4.1病人和对照受试者早老性痴呆(AD)组包括32名病人，15名男性和17名女性，平均年龄±SD为75.0±6.6岁。血管性痴呆(CAD)组有20名病人，10名男性和10名女性，平均年龄±SD为81.0±7.0岁。对照组包括18名个体，7名男性和11名女性，平均年龄±SD为67.5±5.5岁。可能是AD的诊断是按照NINCDS-ADRDA标准通过排除作出的(McKhann等，1984年)。有涉及痴呆的发展的一过性缺血发作和/或中风发作和/或CT发现大面积梗塞和/或多段腔隙、和/或临床发现严重的血管病(诸如高动脉压或伴有并发症的糖尿病)或有这样的病史的病人诊断为VAD。对照组由没有精神病或神经病、恶性病或系统病(例如类风湿性关节炎，传染病)的病史、症状或体征的个体组成。在60岁以上的个体中，认知状态使用简短精神状态检查(Folstein等，1975年)来检验。将得分低于28的个体排除。该研究由Gteborg大学的道德委员会(Gteborg,Sweden)核准。病人(或其最近亲)和对照组中的个体完全同意参加该研究。
4.2脑特异性脑脊液的分离方法已由Davidsson等(1996年)作了详细描述。简言之，将5-10ml CSF加载到用于选择性去除白蛋白的Blue Sepharose分析柱上(Pharmacia,Uppsala,Sweden)。然后将没有白蛋白的级分加到装有与Sepharose 4B共价相连的葡萄球菌蛋白G的分析柱上(Pharmacia,Uppsala,Sweden)以吸收IgG。未吸收的蛋白使用装配有mRPC C2/C18柱(尺寸，内径2.1×100mm，凝胶体积0.35ml，粒径3mm)的SMART系统(Pharmacia LKB technology,Uppsala,Sweden)通过mR-HPLC分离。蛋白质用两份线性梯度的三氟乙酸洗脱。将总共40个级分在Savant Speed Vac浓缩器中干燥。将各级分溶于SDS-PAGE样品缓冲液，超声处理并煮沸15分钟，之后在12％聚丙烯酰胺上分离。
4.3对用于特定检测早老性痴呆的组合测定的评估借助夹心ELISA测量32名AD病人、20名VAD病人和11名对照者的CSF样品中的CSF-Rab3a、CSF-SNAP25、CSF-τ和CSF-β-淀粉状蛋白(1-42)的浓度。所有标记的平均浓度概括在表4中。图7中给出了τ蛋白和Rab3a的个体值。
在利用对AD病人的最高灵敏度和对对照病人的最高特异性而确定的截止值的基础上确定似然比(表5)。由于Rab3a和SNAP25浓度是有相互关系的，因此可以只使用Rab3a或SNAP25与τ和β-淀粉状蛋白(1-42)结合(图8)。因此，未测定有关Rab3a和SNAP25的组合的似然比。三种神经学标记的组合τ-β-淀粉状蛋白(1-42)-Rab3a和τ-β-淀粉状蛋白(1-42)-SNAP25的似然比与单独的一种标记的似然比相比或与各自两种标记的组合的似然比相比升高了，表明三种标记的组合能更特定和灵敏地检测早老性痴呆。
全阶乘复合变量分析(ANOVA)，用所有标记作为因变量，性别作为因子，年龄和简短精神得分评估(MMSE；Folstein等，1975年)作为协变量，在不同的组中显示这些参数没有一个发生协变。另外，无论是在单独的各个组中还是将所有组结合在一起，都未能检测到τ蛋白、β-淀粉状蛋白(1-42)和Rab3a/SNAP25之间的明显相关性。
分离有关Rab3a和SNAP25的其他抗体。CSF-Rab3a、CSF-SNAP25、CSF-τ蛋白和CSF-β-淀粉状蛋白(1-42)的浓度在明确的临床诊断组中进行研究，其中可接受的样品大小允许进行统计学显著性比较。实施例5联合测定，使用CSF-τ、CSF-神经调制素和CSF-神经元特异性烯醇化酶作为神经学标记，用于诊断治疗白血病的儿童因化疗诱导的神经元损害5.1病人和对照受试者1996年8月至1998年9月间，从正在比利时的鲁汶天主大学的儿科血液-肿瘤学系治疗癌症的83名儿童身上采集448份CSF样品。所有病人在诊断的时候都经过了全面的临床评估。研究得到了他们父母的同意。
样品只在用于对恶性肿瘤的疾病分期或治疗的预定腰椎穿刺(LP)的过程中采集。患有血液学恶性肿瘤的不同组病人参加本研究(表6)。第1组包括9名B细胞非霍奇金淋巴瘤病人(B-NHL)，按照联合王国儿童癌症患者团体(UKCCSG 9602)NHL方案(表7a)进行治疗。在这个组中，4名病人有B细胞淋巴瘤，3名病人有伯基特淋巴瘤，2名病人有整形大细胞淋巴瘤(ALCL)。这些病人中有8名作纵向研究。第二组也是最大的一组包括42名患有非B细胞急性成淋巴细胞性白血病/非霍奇金淋巴瘤(NB ALL/NHL)的病人，按照“欧洲癌症研究与治疗组织”(EORTC)的方案58881(表7b)进行治疗。在这组中，18名儿童伴有CD(+)枯萎病或普通NB ALL，2名病人伴有唐氏综合征(DS)，1名病人伴有布-朗综合征，3名病人伴有普通B细胞枯萎病，1名病人有普通T细胞枯萎病，2名病人有原B细胞枯萎病，9名病人有前B细胞枯萎病，8名病人有T细胞枯萎病。38名儿童有白血病，5名有非霍奇金淋巴瘤Ⅱ期(1名)、Ⅲ期(3名)或Ⅳ期(1名)，其中1名病人明显牵涉到CNS(CNS+)，这是按照在CSF、眼底镜检查和对比恍惚中有恶性细胞的研究方案确定的。按照治疗方案中确定的标准，5名病人被认为是极高危(VHR)的病人(2名病人伴有T细胞枯萎病，3名伴有肾上腺皮质激素抗药性)。这组中有27名病人可以纵向进行研究。第三组由6名患有急性骨髓瘤性白血病(AML)的儿童组成，其中1名牵涉到CNS,2名有唐氏综合征。有3名病人有MO，各1名病人有M1、M2或M7表型。所有这些病人都按照EORTC 58921方案(表7c)进行治疗并纵向进行。其他病人由不同类的儿童组成(n=18)，其中出于临床原因，在他们的治疗过程中或之后，进行腰椎穿刺以诊断感染和疾病分期。这组包括5名伴有成神经管细胞瘤的儿童(3名疾病分期，1名治疗过程中，1名治疗后追查)，3名伴有霍奇金病的儿童(疾病分期)，3名伴有横纹肌肉瘤的儿童(2名疾病分期，1名治疗过程中)，2名伴有脊髓发育不良综合征(MDS)的儿童(疾病分期)，2名伴有朗格罕氏组织细胞增多症(langerhans cell histiocytis)的儿童(LVH/HLH，疾病分期)，1名患有幼年期慢性骨髓瘤性白血病(CML)(治疗过程中)、绒膜癌(追查)或生殖细胞瘤(疾病分期)的儿童。有一大群健康新生儿未采用，因为从这些病人采集脑脊液是不道德的。作为对照，怀疑患有脑膜炎但伴有否定判定(n=4)、局限性成视网膜细胞瘤(n=1)和家族性噬红细胞性淋巴组织细胞增多病(n=1)的儿童加入研究。研究得到了他们父母的同意。
5.2研究设计使用预期和纵向的单中心研究设计。在加入该研究之前没有病人接受过任何治疗。在本探察研究中，在进行任何治疗之前先从58名儿童得到CSF样品(=诊断性腰椎穿刺或LP1)(其他详细资料参见表7)。对于大多数病人，在所有时间点都没有残余样品。缺少的值不是由于儿童的疾病状态造成的，而是采样或样品储藏过程中的人为结果。
进行腰椎穿刺以用于常规分析，或者在基线时进行以用于诊断性检查，或者就在化疗的IT给药之前进行。将5ml CSF收集在不同的聚丙烯试管中。1份样品立即以1500rpm离心2分钟以消除细胞和其他不溶物质。上清液储藏在-70℃下以用于随后的分析。冷冻/融解循环的次数限制在最小程度。常规CSF测量包括细胞学，蛋白质浓度，葡萄糖，等等。
由于不受诊断组支配的所有神经学标记数据的当量浓度都被拒绝了，因此将非参数统计学用于分析。Kruskal-Wallis检验用于研究关于有效变量(τ，神经调制素，蛋白质等)的组间差异。Wilcoxon符号等级配对检验用于检查第一次诊断性LP和随后的LP之间的差值。Pearson相关用于研究可能的协变。分析用Prism软件2.01版(Gradhpad Software Inc.,San Deigo,CA,USA)、Systat 7版(SPSS,Chicago,IL,USA)进行。
5.3对用于诊断化疗诱导的神经元损害的联合测定的评估治疗前神经学标记的浓度首先确定来自患有传染病(但病毒和细菌培养物为阴性)的儿童(n=4)的CSF样品的τ蛋白的正常上限浓度，其中1名患者有非常局限性的成视网膜细胞瘤，1名患者筛选家族性HLH。对照儿童的平均τ值是106.2pg/ml(95％CI=34.3-178.0)。任意截止正常值认为是312pg/ml(均值+3 SD)，它在成人观测值的范围内。80％的正常成人对照者的τ值在352pg/ml以下，而425pg/ml(p25-p75:274-713,n=150)是早老性痴呆病人的τ浓度中值(Hulstaert等，1999年)。样品首先独立于病人数进行分析；之后，再次在一个免疫滴定板上对来自1名病人的所有样品进行分析。对于一组104份样品用第一和第二种方法获得的结果之间的相关系数是0.901(95％CI:0.856-0.933)。
分析每个病人子群的诊断时的τ浓度(图9)。诊断时的τ浓度范围是66-1500pg/ml。有关τ、神经调制素、β-淀粉状蛋白(1-42)、β-淀粉状蛋白(1-40)、血清LDH和CSF白细胞数的数据(图10)显示在伴有或不伴有唐氏综合征的各组中或在诊断组之间没有明显差异。此外，在τ浓度和WBC或LDH浓度之间未发现相关性。在τ浓度和儿童的年龄之间也未发现明显的关系。2名有MDS的病人、有明显CNS侵袭(CNS+)的病人，他们的诊断时的τ浓度明显增强，但患有AML的儿童则无此现象。另外，三名因后窝中的成神经管细胞瘤引起颅内压升高的入院病人，采集他们的CSF用于疾病分期，他们的CSF-τ浓度非常高(823,1397,1500)。不过，7/21患有非-B ALL/NHL的儿童、1/4有极高危标准的非-B ALL/NHL病人、2/4有AML的病人和2/8有B-细胞NHL的病人，他们的τ浓度在312pg/ml以上，尽管使用标准方法未检测到CNS侵袭。
对于27名患有非-B ALL/NHL的病人或9名患有B细胞NHL的病人(数据未显示)，诊断时的τ浓度与肿瘤负担无关，正如由白细胞数(p=0.935,n=40)或血清LDH(p=0.855,n=39)反映出的。在LP1时，τ和神经调制素之间有非常显著的相关性[r=0.793；95％CI:0.658-0.928,n=50]，表明这两种蛋白的分泌在有些点是相互关联的。τ和β-淀粉状蛋白(1-42)之间未观察到相关性(p=0.1032,n=52)。
B-NHL病人的治疗过程中神经学标记的浓度关于化疗诱导的CSF中τ的增加的最惊人的差异是在B细胞NHL病人中检测到的。来自三名病人的基线和第9天LP(=LP2)跟踪样品的结果是有效的，显示于图11a中。在第9天(即MTX和氢化可的松IT给药以及MTX和长春新碱IV给药后)已可测量到最大的τ增加值。稍后的测量显示τ值没有再增加。化疗诱导的对神经元代谢活性的作用得到了有关神经调制素(图11b)和神经元特异性烯醇化酶(图11c)的类似发现的确证。此外，τ和神经调制素之间(r=0.722,95％CI:0.553-0.834,n=49)或神经调制素和神经元特异性烯醇化酶之间(r=0.622,95％CI:0.247-0.835,n=20)有惊人的相关性。
非B细胞ALL/NHL病人治疗过程中神经学标记的浓度得到按照EORTC方案58881进行治疗的13名非-B ALL病人的覆盖整个治疗期的数据(pre-post样品)。图12a中显示了个体患者的不同治疗阶段的中间τ值。在诱导期，当与治疗前的浓度(LP1)相比(p=0.048)、或者与维持期相比(p=0.040)时，τ浓度显著升高。1名病人在开始治疗之前τ浓度已经升高(893pg/ml)，可能反映了已在进展的神经学机能障碍。在治疗前和诱导期之间神经调制素浓度也有升高的趋势(p=0.0522)(图12b)。在治疗开始时表现出高τ浓度的病人也显示出在开始添加化疗时的高神经调制素浓度。2名病人的LP1和LP2的NSE数据是有效的[LP1(4.0ng/ml,3.4ng/ml)；LP2(11.7ng/ml,9.6ng/ml)],NSE有显著升高。
对来自非-B ALL病人的所有数据的分析显示，在诱导期中观察到了最高τ浓度。在诱导期中，分析的样品中有41％(28/68)高于500 pg/ml。然后该百分率在间期下降至18.9％(14/74)，在再次诱导过程中下降至16.7％(3/18)，最后在维持期下降至9.7％(7/72)(图13a)。治疗开始前τ值已升高(＞500pg/ml)的三名病人的τ值在化疗后正常化。有关非-B ALL病人的β-淀粉状蛋白(1-42)、神经调制素和NSE浓度的数据分别显示在图13b、图13c和图13d中。此时，在τ和神经调制素(r=0.658,95％CI=0.580-0.725,n=251)或NSE(r=0.589,95％CI=0.363-0.749,n=47)的浓度之间也有显著的相关性。
本研究中纵向测试5名符合极高危标准的非-B ALL儿童。第1治疗阶段与EORTC 58881类似。5名病人中有4名观察到类似的化疗诱导的τ浓度变化，同时在τ和神经调制素之间有极显著的相关性(n=55；r=0.880,95％CI:0.802-0.929)。
1名唐氏综合征-非B ALL病人诊断时的τ浓度为70pg/ml。在该纵向研究中所有非B ALL病人在第8天时τ浓度的平均升高值为250％(95％CI=130％-370％,n=13)，在第21天时为200％(95％CI=150％-260％,n=8)，而伴有唐氏综合征的病人在第8天和第21天时τ浓度的升高百分数分别为820％和1200％。
1名特殊病人用泼尼松龙治疗了8天，但由于高白血病负荷(610000WBC/mm3)，在第1天时没有IT给药MTX。治疗8天后，τ浓度仍很低，为155pg/ml。之后，该名病人象其他所有非B ALL病人一样开始用EORTC方案治疗，包括在以后的几周内IT注射MTX。τ浓度迅速升高，在第12、15、18、22和44天时分别达到744、948、1120、861和1023pg/ml。
从在另一个中心接受治疗的儿童获得1份CSF样品，该名儿童在用MTX治疗后出现明显神经毒性，并且他患有双瘫。该名儿童的τ和神经调制素浓度超过了所用的最高标准物(τ浓度为1500pg/ml，神经调制素为8000pg/ml)，反映了总体神经元变性。
AML治疗过程中神经学标记的浓度图14a显示了患有AML的患者个体的τ的进展情况。病人11、12和23在治疗过程中τ没有明显升高(表7c)。病人12在第1天和第8天时进行LP，他患有侵略性疾病并且在骨髓移植后很快就死了。可从伴有唐氏综合征的2名病人之一获得纵向数据，该名病人的τ浓度有些微升高，在300pg/ml以上，这与病人11和23的CSF中的τ浓度的进展情况形成了对照。病人69，诊断时证明有CNS侵袭，他的CSF中的τ和神经调制素有惊人的升高(图14b)。该名儿童仍在治疗中，并且此刻病情已完全缓解。
结论在这个纵向研究中我们发现液体中τ、神经调制素和NSE的浓度显著升高，这很可能反映了与化疗有关的神经元损害，并且这主要是在ITMTX并结合IV皮质类固醇和化疗(ALL诱导和再次诱导治疗，B细胞NHL治疗)的时候导致的，在间期治疗过程中的高剂量IV和IT MTX过程中则没有产生这样的情况。实施例6用于诊断产前窒息导致的脑损害的联合测定产期窒息可能与神经元损害相关联。在低氧-局部缺血事件的评估中，除了脑电图和神经系放射学数据以外，CSF神经学标记可以补充临床数据(Garcia-Alix,1994年)。现在越来越有证据表明改变的脑代谢活性可由CSF中各成分的变化反映。对CSF标记的产前浓度以及因窒息引起的变化的分布进行评估。实施例7联合测定，使用CSF-神经调制素、CSF-τ和CSF-β-淀粉状蛋白(1-42)作为神经学标记，用于特定检测早老性痴呆和用于鉴别早老性痴呆与对照受试者7.1病人和对照受试者得到109名个体的CSF。将这些个体分成4组(ⅰ)定义为痴呆的神经学对照的组(n=70)。该组包括多发性硬化、急性热病性多神经炎、多神经病和癫痫病人。其他组包括(ⅱ)记忆力损伤的老年病人(n=7)，(ⅲ)早老性痴呆(AD)病人(n=27)和(ⅳ)血管性痴呆(VAD)病人(n=5)。所有病人都按照《国际疾病分类》第9版(疾病、损伤和死因的国际统计学分类手册基于第9次修订会议的推荐；1975年，由第29次世界健康大会通过。日内瓦世界卫生组织，1977年)规定的标准进行诊断。在AD组中，有2名病人来自其中presenilin突变决定该疾病的早期发作的家庭。这些病人中有1名是症状发生前的。
CSF作为神经学检查的一部分进行常规取样。所有试验都用剩余的CSF进行。只测量适当储存于聚丙烯试管并只冷冻了一次的CSF样品中的β-淀粉状蛋白(1-42)。
7.2对用于特定检测早老性痴呆和用于鉴别早老性痴呆与对照受试者的联合测定的评估测定这些病人的CSF中的τ、β-淀粉状蛋白(1-42)和神经调制素(GAP-43)的浓度。表8中显示了每组的平均CSF浓度。β-淀粉状蛋白(1-42)、τ和神经调制素的个体浓度分别显示在图15a、15b和15c中。
AD病人的CSF-τ和CSF-β-淀粉状蛋白(1-42)有显著变化。并且，AD病人的CSF-神经调制素显著升高。与此对照，在记忆力损伤的老年病人中，没有观察到CSF-神经调制素的显著作用，而CSF-τ浓度与对照受试者相比则显著升高了。7名记忆力受损的病人中有3名的CSF-τ浓度高于由对照组确定的最大值(280pg/ml)。由于储存不当，只能确定3名记忆力受损病人的CSF-β-淀粉状蛋白(1-42)浓度。这3名病人中有2名的浓度在300pg/ml以下。这些病人中还有1名的CSF-τ浓度升高了。其他病人的CSF-τ浓度为278pg/ml，即，刚刚低于对照组确定的最大值。在症状发生前的家族性AD病人中，CSF-τ浓度升高至327pg/ml，同时β-淀粉状蛋白(1-42)浓度低于300pg/ml。针对一些记忆力受损个体的样品进行的这种分析表明，τ、β-淀粉状蛋白(1-42)和神经调制素的结合使用是指示早老性痴呆存在的较好指示器。为了达到统计学显著性，用每组大量样品进行分析(每个诊断组至少50份样品)。实施例8联合测定，使用CSF-神经调制素、CSF-β-淀粉状蛋白(1-42)和CSF-τ作为神经学标记，用于特定检测早老性痴呆、鉴别早老性痴呆与对照受试者，用于特定检测帕金森氏病、鉴别帕金森氏病与对照受试者，以及用于鉴别早老性痴呆与帕金森氏病。
8.1病人和对照受试者从60名早老性痴呆病人、23名帕金森氏病病人和32名年龄相当的对照病人获得CSF。测定这些病人的CSF中的τ、β-淀粉状蛋白(1-42)和神经调制素(GAP-43)浓度。表9中显示了每组的平均CSF浓度。
8.2对用于特定检测早老性痴呆和鉴别早老性痴呆与对照受试者的联合测定的评估AD病人的τ浓度与对照相比显著升高，而β-淀粉状蛋白(1-42)浓度则下降了。这两组间的NM浓度没有显著差异。但是，NM和τ浓度显著相关(图16)。图16的外部检查显示，AD病人的值可以与对照病人的分离开。后向判别分析(Morrison,1976年)用于确定哪个变量(τ、β-淀粉状蛋白(1-42)、神经调制素或τ/神经调制素)能最好地区别早老性痴呆病人与对照病人。挑选出变量τ/神经调制素和β-淀粉状蛋白(1-42)并准确地分出了58名早老性痴呆病人中的55名(灵敏度94.8％,CI85.6％-98.9％)和31名对照病人中的30名(灵敏度96.8％,CI 83.3-99.9％)(图17)。对大量样品的进一步分析将能证明利用这三种标记诊断早老性痴呆的统计学上显著的改善。
8.3对用于特定检测帕金森氏病和鉴别帕金森氏病与对照受试者的联合测定的评估后向判别分析(Morrison,1976年)用于确定哪个变量能最佳地区别对照与帕金森氏病病人。挑选出变量τ/神经调制素和β-淀粉状蛋白(1-42)。准确地分出了23名帕金森氏病病人中的14名(灵敏度60.9％,CI 38.6％-80.3％)和31名对照病人中的27名(灵敏度87.1％,CI70.2-96.4％)(图17)。对大量样品的进一步分析将能证明利用这三种标记诊断帕金森氏病的统计学上显著的改善。
8.4对鉴别早老性痴呆与帕金森氏病的联合测定的评估挑选出β-淀粉状蛋白(1-42)和神经调制素来鉴别早老性痴呆病人和帕金森氏病病人，对于早老性痴呆病人的灵敏度为94.8％(CI 85.6-98.9％)，对于帕金森氏病病人的灵敏度为78.3％(CI 56.3％-92.5％)。对大量样品的进一步分析将能证明利用这三种标记来鉴别早老性痴呆与帕金森氏病的统计学上显著的改善。实施例9使用CSF-α-融合核素作为神经学标记来鉴别雷维小体性痴呆与早老性痴呆9.1病人和对照受试者从30-40名早老性痴呆病人、10-20名雷维小体性痴呆病人和10-20名年龄相当的对照病人获得CSF。
9.2用于鉴别诊断早老性痴呆与雷维小体性痴呆的测定定量测定不同的病人组和对照组中病人的CSF中的α-融合核素浓度。早老性痴呆组的α-融合核素浓度的平均值与雷维小体性痴呆组的α-融合核素浓度的平均值之间的显著差异使得我们能区别开这两种类型的痴呆。通过将α-融合核素的定量测定与另外的至少两种神经学标记(诸如τ和β-淀粉状蛋白(1-42))的定量测定结合起来，可以进一步改善对早老性痴呆与雷维小体性痴呆的鉴别。实施例10联合测定，使用CSF-β-淀粉状蛋白(1-42)、CSF-τ和CSF-磷酸-τ作为神经学标记，用于特定检测额颞叶性痴呆和鉴别额颞叶性痴呆与其他痴呆10.1病人和对照受试者从30-40名额颞叶性痴呆病人和10-20名年龄相当的对照受试者获得CSF。
10.2用于鉴别诊断额颞叶性痴呆与对照受试者的联合测定定量测定不同的额颞叶性痴呆病人和对照病人的CSF中的β-淀粉状蛋白(1-42)、τ和磷酸-τ的浓度。额颞叶性痴呆病人的τ和磷酸-τ浓度的平均值与对照病人的τ和磷酸-τ浓度的平均值相比显著升高。而额颞叶性痴呆病人的β-淀粉状蛋白(1-42)浓度与对照病人相比降低了。实施例11联合测定，使用CSF-β-淀粉状蛋白(1-42)、CSF-τ和血浆-β-淀粉状蛋白(1-42)作为神经学标记，用于特定检测早老性痴呆中的血管问题和鉴别血管疾病与其他形式的早老性痴呆11.1病人和对照受试者从30-40名血管病病人、30-40名其他形式的早老性痴呆病人和10-20名年龄相当的对照病人获得CSF和血浆。
11.2用于鉴别诊断血管病与其他形式的早老性痴呆的联合测定定量测定不同的血管病病人、其他形式的早老性痴呆病人和对照病人的CSF中的τ和β-淀粉状蛋白(1-42)浓度以及血浆中的β-淀粉状蛋白(1 42)浓度。血浆-β-淀粉状蛋白(1-42)、CSF-τ和CSF-β-淀粉状蛋白(1-42)浓度的数值差异使得我们能够区别开血管病病人和患有其他形式的早老性痴呆的病人。
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权利要求
1.特定检测、定量和/或鉴别诊断个体的神经变性的方法，它包括以下步骤-从所述个体获得一种或多种体液样品；-利用特异性识别神经学标记的抗体测定所述样品中至少三种神经学标记的浓度，由此，所述所有神经学标记的浓度与对照样品相比的数量变化反映了神经变性的类型和程度。
2.按照权利要求1的方法，其中所述体液样品选自脑脊液样品和血液样品。
3.按照权利1-2任一项所述的方法，其中一种或多种所述神经学标记选自τ、磷酸-τ、β-淀粉状蛋白(1-42)、β-淀粉状蛋白(1-40)、神经调制素、神经元特异性烯醇化酶和/或突触蛋白。
4.按照权利要求3的方法，其中所述突触蛋白选自Rab3a、SNAP25和α-融合核素。
5.检测脑脊液中的Rab3a的方法，该方法至少包含以下步骤-在适合生成抗原-抗体复合物的条件下，使脑脊液样品与能与Rab3a反应的抗体接触；和-检测所述抗体与所述脑脊液样品的免疫结合。
6.检测脑脊液中的α-融合核素的方法，该方法至少包含以下步骤-在适合生成抗原-抗体复合物的条件下，使脑脊液样品与能与α-融合核素反应的抗体接触；和-检测所述抗体与所述脑脊液样品的免疫结合。
7.按照权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述神经变性选自早老性痴呆、雷维小体病、帕金森氏病和额颞叶性痴呆。
8.按照权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述神经变性是由化疗引起或因接触化学物质或辐射引起的。
9.按照权利要求1-4任一项或按照权利要求6所述的方法，它用于特定检测或定量早老性痴呆和/或雷维小体病和/或用于鉴别诊断早老性痴呆与雷维小体病，其中-测定脑脊液样品中α-融合核素的浓度；和/或-测定脑脊液样品中τ、β-淀粉状蛋白(1-42)和α-融合核素的浓度。
10.按照权利要求1-4任一项或按照权利要求5所述的方法，它用于特定检测或定量早老性痴呆和/或用于鉴别诊断早老性痴呆与其他痴呆，其中-测定脑脊液样品中τ、β-淀粉状蛋白(1-42)和Rab3a的浓度；或-测定脑脊液样品中τ、β-淀粉状蛋白(1-42)和SNAP25的浓度。
11.按照权利1-3任一项所述的方法，它用于特定检测或定量早老性痴呆和/或帕金森氏病和/或用于鉴别诊断早老性痴呆与帕金森氏病，其中测定脑脊液样品中τ、β-淀粉状蛋白(1-42)和神经调制素的浓度。
12.按照权利1-3任一项所述的方法，它用于特定检测或定量因化疗和/或接触化学物质和/或辐射而引起的神经变性，其中测定脑脊液样品中τ、神经元特异性烯醇化酶和神经调制素的浓度。
13.按照权利8或12的方法，其特征还在于检测或定量其神经变性的个体患有白血病或脑肿瘤。
14.按照权利1-3任一项所述的方法，它用于特定检测或定量额颞叶性痴呆和/或用于鉴别诊断额颞叶性痴呆与其他痴呆，其中测定脑脊液样品中τ、磷酸-τ和β-淀粉状蛋白(1-42)的浓度。
15.按照权利1-3任一项所述的方法，它用于特定检测或定量早老性痴呆中的血管问题、用于鉴别诊断不同形式的早老性痴呆和/或用于鉴别诊断早老性痴呆与其他痴呆，其中定量测定脑脊液样品中τ和β-淀粉状蛋白(1-42)的浓度以及定量测定血浆样品中β-淀粉状蛋白(1-42)的浓度。
16.用于特定检测、定量和/或鉴别诊断个体的神经变性的诊断试剂盒，它至少包含3种各自识别不同神经学标记的抗体。
17.用于特定检测、定量和/或鉴别诊断个体的神经变性的诊断试剂盒，它包含-包含在一起或分离的至少3种各自识别不同神经学标记的抗体(第一抗体或捕获抗体)的支持体；-第二抗体(检测抗体)，各自识别其中一种神经学标记-第一抗体复合物；-可能的话，用于特异性标记所述第二抗体或与所述第二抗体偶联的标记；-可能的话，用于进行第一抗体和体液样品之间的、第二抗体和神经学标记-第一抗体复合物之间的和/或结合第二抗体和标记之间的免疫反应的适宜缓冲溶液；-可能的话，出于标准化的目的，用于检测神经学标记的、由该试剂盒的抗体特异性识别的纯化蛋白质或合成肽。
18.按照权利要求16或17的诊断试剂盒，它特别设计用于实施权利要求1-15任一项所述的方法。
19.用于检测CSF中的Rab3a的诊断试剂盒，它至少包含识别Rab3a的单克隆抗体。
20.用于检测CSF中的Rab3a的诊断试剂盒，它包含-含有识别Rab3a的单克隆抗体(第一抗体)的支持体；-识别Rab3a-第一抗体复合物的第二抗体(或检测抗体)；-可能的话，用于特异性标记所述第二抗体或与所述第二抗体偶联的标记；-可能的话，用于进行第一抗体和脑脊液样品之间的、第二抗体和Rab3a-第一抗体复合物之间的和/或结合第二抗体和标记之间的免疫反应的适宜缓冲溶液；-可能的话，出于标准化的目的，用于检测Rab3a的、由该试剂盒的抗体特异性识别的纯化蛋白质或合成肽。
21.用于检测CSF中的α-融合核素的诊断试剂盒，它至少包含识别α-融合核素的单克隆抗体。
22.用于检测CSF中的α-融合核素的诊断试剂盒，它包含-含有识别α-融合核素的单克隆抗体(第一抗体)的支持体；-识别α-融合核素-第一抗体复合物的第二抗体(或检测抗体)；-可能的话，用于特异性标记所述第二抗体或与所述第二抗体偶联的标记；-可能的话，用于进行第一抗体和脑脊液样品之间的、第二抗体和α-融合核素-第一抗体复合物之间的和/或结合第二抗体和标记之间的免疫反应的适宜缓冲溶液；-可能的话，出于标准化的目的，用于检测α-融合核素的、由该试剂盒的抗体特异性识别的纯化蛋白质或合成肽。
23.按照权利要求1-22任一项所述的方法或诊断试剂盒用于治疗性监控和/或确定某种治疗的有效性的用途。
全文摘要
本发明涉及新的使用检测个体的一种或多种体液中的至少三种神经学标记的联合测定法来特定检测、定量和/或鉴别诊断所述个体的神经变性的方法,所述所有神经学标记的浓度与对照样品相比的数量变化反映了神经变性的类型和程度。本发明还涉及检测脑脊液中的Rab3a、SNAP25和α－融合核素的方法,以及这些方法在用于特定检测、定量和/或鉴别诊断神经变性的联合测定法中的用途。
文档编号G01N33/53GK1316055SQ99810286
公开日2001年10月3日 申请日期1999年6月29日 优先权日1998年7月3日
发明者E·范梅彻伦, H·范德斯蒂彻勒, A·范德沃尔德 申请人:基因创新有限公司