专利名称：利用抗体结合蛋白的模式化沉积产生基于光衍射的生物传感器的制作方法
技术领域：
一般而言，本发明涉及对介质中的分析物进行检测的领域，更详细地说，本发明涉及将抗体结合蛋白微晒图(micro-contact print)在一种基质上，用于产生可表明介质中存在该分析物的一次性专用传感器。
背景技术：
有多种系统和装置可用来检测不同介质中的多种分析物。这些系统和装置大多比较昂贵，并且要由经过培训的技术人员来进行测试。在很多情况下，最好是能够快速而廉价地测定分析物的存在情况。而所需要的正是一种易于生产、造价低廉，并且能够灵敏可靠地检测分析物甚至微量分析物的生物传感系统。此外还需要一种简单灵活的方法来制备可实现最佳大规模处理的生物传感器。
Sandstrom et al.，24 Applied Optics 472，1985对一种硅制光学基质的应用进行了描述，该基质含有一层一氧化硅，并含有一层作为介质薄膜的硅。文中指出，薄膜的厚度变化可改变光学基质的特性，从而随薄膜的厚度产生不同的颜色。薄膜的厚度与观察到的颜色相关，而光学基质上覆盖的一层薄膜能够产生可见的颜色变化。作者指出，颜色变化可利用数学模型来定量，而“利用计算机模型进行计算的结果表明，使用多层结构不会引起光学特性的变化……但表面的生物层几乎不改变这种结构的反射作用，因为其光学特性主要由该多层结构的内界面决定。尽管可由额外的介质层来实现其它大多数应用性能，但最灵敏的生物层检测系统为单层系统”。
Sandstrom et al.还指出，金属表面的金属氧化膜具有一些缺点，并且金属离子的存在还会在许多生化应用中产生有害作用。他们指出，理想的表层介质薄膜是将一氧化硅层置于环境大气中时自然形成的2-3nm厚的二氧化硅层，在玻璃或塑料基质上则可采用在40-60nm一氧化硅层上形成70-95nm二氧化硅层的方案。另外，他们还描述了一氧化硅楔的形成，方法是对一氧化硅进行选择性蚀刻、用二氯二甲基硅烷处理二氧化硅表面，并施加抗原与抗体生物层。他们可通过该楔形结构由一种偏振光椭圆计来测量薄膜厚度，并指出“最大的反差位于约65nm区域，这里的干涉色由紫色变为蓝色”。他们指出，这种系统的灵敏度之高足以通过固定化抗体来检测蛋白抗原。他们断定“提供的该设计方案具有足以适用于广泛应用领域的灵敏性”。所用原料，即玻璃、硅和氧化硅，具有化学惰性，并且不会影响所研究的生化反应。利用上述计算方法可设计出针对不同应用而优化的薄片。这种薄片可通过工业方法来生产，并且可确保其品质，目前能够以商品形式购买的有两种设计款式。
Kumar et al.发表的美国专利5,512,131描述了一种装置，该装置含有一种带金属涂层的聚合物基质。抗体结合蛋白层则模压(stamp)在带涂层基质的表面。该装置可用于模压过程，或可作为一种开关。当分析物与该装置结合时可产生一种衍射图像。因而可使用一种显象装置，如摄谱仪(spectrometer)，来确定该衍射图像的存在情况。
但Kumar et al.描述的该装置具有一些缺点。其中之一就是需要额外的显象装置来观察所有的衍射图像。由于需要衍射装置而不能裸眼来确定分析物的存在情况，所以Kumar et al.的装置不能对大量的样品进行测试。
Bogart et al.的美国专利号5,482,830描述了一种装置，该装置包含一种带有光学活性表面的基质，这种光学活性表面可随光照而显示出第一颜色。第一种颜色被定义为发射光的光谱分布该基质还可显示出与第一颜色不同的第二种颜色(通过与第一颜色的波长组合不同的光波长组合，或不同的光谱分布，或通过与第一颜色不同的一种或多种波长的强度)。当分析物出现在该表面时，在相同的光的刺激下可显示出第二种颜色。由一种颜色向另一种颜色的变化可通过仪器或眼睛来测量。这种灵敏的检测方法相对于上文Sandstrom和Nygren描述的装置而言是一种进步，从商业角度考虑，使用该装置更具前途和竞争力。
但在Bogart et al.的专利中描述的方法和装置也有一些缺点。一是该装置造价昂贵。另一问题是难以控制晶片上的不同薄层以获得可靠的数据。而所需要的正是一种易于生产、造价低廉，并且能够灵敏可靠地检测待测分析物的生物传感装置。
一旦可使光散射的目标分析物与带有模式化蛋白及抗体的聚合物膜的特定区域结合，即可通过该分析物的确定尺寸和特定精确位置产生透射光衍射和/或反射光衍射。产生的衍射图像可用眼睛方便地观察，也可选择性地使用一种传感装置。
本发明采用模式化抗体结合蛋白的晒图方法。这些蛋白能够与抗体结合，并将抗体模式化附着于表面，同时维持受体抗体的最佳取向。这些受体抗体可对特定的一种或一类分析物具有特异性，这将取决于所使用的蛋白。适用于产生在本发明所述系统中使用的传感装置的晒图方法完全公开于美国专利申请号08/707,456和08/769,594,在此均全面引入作为参考。但由于这些方法涉及单层膜的自我组装，而抗体结合蛋白原料不能自我组装，因此需要如下文所述将这些方法稍加修改来印制抗体结合蛋白原料。
带有抗体的模式化抗体结合蛋白层可使分析物在其表面模式化排布或模式化结合。由此产生的本发明所述生物传感装置可根据这两种方式中的一种来加以使用，这将取决于分析物的大小。当诸如微生物等分析物本身可造成衍射时，该系统的使用方法是，首先将生物传感装置暴露于含有选定分析物的介质中，然后在保温适当时间后用一种光，如激光，照射并穿透该薄膜或使其由薄膜反射。如果分析物存在于介质中并且与模式化抗体结合蛋白层上的抗体结合，那么光就被衍射并产生可见图像。
对诸如蛋白等极小的分析物而言，该系统可选择性地使用能够与目标分析物和生物传感器结合并使振幅和/或折射率发生极大变化的“衍射增强元件”，以此来提高生物传感器的衍射效率并使较小分析物的检测得以进行。在使用时，目标分析物可直接与印有蛋白和抗体的聚合物膜的特定区域结合，也可与衍射增强元件结合，然后该部件与生物传感器结合。然后通过分析物的确定尺寸和特定精确位置产生透射光衍射和/或反射光衍射。产生的衍射图像可用眼睛方便地观察，也可选择性地使用一种传感装置。
该传感器的另一可选用途涉及对抗体分析物进行检测。该传感装置可只含有模式化抗体结合蛋白，然后将其暴露于加有衍射增强元件的介质中，该衍射增强颗粒需含有待测抗体的特异性抗体。颗粒上的优选抗体应不与模式化抗体结合蛋白发生非特异性结合，而是只有在结合了分析物抗体后才发生结合。这样，衍射增强元件可在分析物抗体存在的情况下使振幅和/或折射率发生实质性变化，从而形成衍射图像。也可预见将这种方式与其它免疫测定方式一同使用，如横流测定(lateral folw)或微孔板方法等。
换句话说，结合了分析物的抗体结合蛋白与抗体层可产生光学衍射图像来表明分析物的存在。使用的光可以是可见光，也可以是薄膜的反射光或是透射光，分析物可以是能够与抗体结合蛋白层反应的任何化合物或颗粒。使用的光可以是白光，也可以是位于可见区内的单色电磁辐射。本发明还提供一种柔性支持物，用于在金或其它适当金属或合金上支持抗体结合蛋白层。
本发明提供一种可批量生产的一次性廉价生物传感器。该生物传感器包括印有模式化抗体结合蛋白的表面。这些蛋白一般可通过抗体的恒定区(Fc)与抗体结合，这样就使抗体的抗原结合区(Fab)处于游离状态，从而获得最佳的结合活性。模式化蛋白表面的制备还使传感器的生产具有最大程度的灵活性。生产过程中的最终步骤，将所需抗体捕获在模式化区域可根据特定分析物的需要来进行(即在生产的时候)。
本发明的生物传感器可制成用于单次分析物检测的形式，也可定制成多重测试装置。本发明的生物传感器可用来检测衣服，如尿布，中的污染物，也可用来检测微生物污染物。
本发明还可用来检测隐形眼镜、眼镜、窗玻璃、药剂瓶、溶剂容器、水瓶、胶布绷带等之上的污染物。
在审阅以下公开实施方案的详细描述之后，将会了解本发明的这些及其它特点和优点。
图2为抗体结合蛋白层的晒图以及随后的抗体模式化沉积的示意图。
发明详述本发明的特征是提供改进型生物传感装置以及该生物传感装置的使用方法，用于对介质中特定分析物的存在情况或数量进行检测和定量。可通过本发明加以检测的分析物包括，但不局限于，诸如细菌、酵母、真菌和病毒等微生物。与此前的装置相比，本发明的装置可通过持续时间仅数分钟的快速测定来检测介质中极少量的分析物。此外，本发明的生物传感装置无需信号部件或相关电子部件。
本发明包括将抗体结合蛋白以微晒图在一种聚合物薄膜上，该薄膜还可带有金属涂层。这是一种简易的模块化生产方法，因为此后暴露于抗体可导致抗体的模式化结合。此外，这些蛋白可提高固定化抗体的活性。本发明产生可依据光衍射来表明分析物的存在情况的一次性专用传感器。一旦目标分析物与含有蛋白的塑料薄膜的特定区域接触，即可通过该分析物的确定尺寸和特定精确位置产生透射光衍射和/或反射光衍射。举例来说，当酵母、真菌或细菌被在表面上有序模式化放置时，其大小均足以充当可见光的衍射元件。此外，本发明还包括能提高生物传感器衍射效率的衍射增强元件，由此可对任意数量的不同分析物进行检测。分析物除采用可产生简单衍射图像的形式之外，也可采用产生全息传感图像和/或可见的颜色变化的形式。此时，全息图象的出现或现有全息图象的改变表明一种阳性反应。透射光的衍射模式可以是任何形式，其中包括，但不局限于，当分析物与接受物结合时即由一种模式转变为另一种模式。在特别优选实施方案中，该衍射模式在分析物与本发明的生物传感装置接触后不到1小时内即可被辨别。
优选而言，在与分析物相互作用后即可产生光衍射的衍射光栅具有最小的波长频率，并且折射率与周围介质不同。诸如病毒或分子等极小的分析物可通过使用对其有特异性的较大颗粒来间接检测。检测小分析物的实施方案包括用一种能够与特定分析物特异性结合的蛋白物质包被诸如乳胶粒等颗粒。可在本发明中使用的颗粒包括，但不局限于，玻璃、纤维素、合成聚合物或合成塑料、乳胶、聚苯乙烯、聚碳乙酸、蛋白、细菌或真菌细胞等。颗粒的优选外形为球形，但该颗粒的结构和空间构型对本发明而言并非决定性因素。举例来说，该颗粒可以是长条形、椭圆形、立方形等。合乎需要的颗粒大小为直径约0.2μm-50.0μm，理想的则约为0.4μm-1μm。颗粒的成分对本发明而言并非决定性因素。
表面的固定化/模式化抗体将与分析物的一种表位特异性结合，该表位与结合衍射增强元件的表位不同。因此，在检测含有小分析物，如病毒颗粒，的介质时，可首先将该介质暴露于结合有该病毒颗粒的衍射增强元件颗粒，如乳胶颗粒。然后选择性地对衍射增强元件颗粒进行冲洗，再将其暴露于具有含病毒特异性抗体的抗体结合蛋白层的聚合物膜。此时抗体可结合元件颗粒上的病毒颗粒，从而将元件颗粒以相同于抗体的模式固定在膜上。由于结合的元件颗粒可引起可见光衍射，所以可形成一种衍射图像，以表明流体中存在该病毒颗粒。此外，该聚合物膜上可含有一层金属涂层。此时抗体结合蛋白层应位于薄膜的金属化表面之上。
作为选择，分析物的检测方法也可以是，首先将基质暴露于含有分析物的介质，使分析物与含有分析物特异性抗体的抗体结合蛋白层物质结合。其次将含有衍射增强元件颗粒的溶液与结合有分析物的基质相接触。从而使颗粒与分析物结合。由于结合的元件颗粒能够导致可见光衍射，因此会形成一种衍射图像，以表明流体中存在该分析物。
最后，在一项优选实施方案中，可将生物传感器、衍射增强元件颗粒和含有分析物的介质同时混合。这将导致上述结合过程一同发生。一些分析物将在与基质结合前先与衍射增强元件颗粒结合。另一些分析物则是先与基质结合，然后与元件颗粒结合。当使用点光源透射(show through)该传感器时，即可形成一种衍射图像，以表明流体中存在该分析物。
可考虑使用本发明来加以检测的分析物包括，但不局限于，细菌；酵母；真菌；病毒；类风湿因子，抗体包括但不限于IgG，IgM，IgA，IgE抗体；癌胚抗原；链球菌A类抗原；病毒抗原；自身免疫疾病相关抗原；变应原；肿瘤抗原；链球菌B类抗原；HIVI或HIVII抗原；或对这些病毒及其它病毒的宿主应答(抗体)；RSV特异性抗原或对该病毒的宿主应答(抗体)；抗原；酶；激素；多糖；蛋白；脂类；糖类；药物或核酸；沙门氏菌；念珠菌，其中包括，但不局限于，白色念珠菌和热带念珠菌；沙门氏菌；脑膜炎奈瑟菌A类、B类、C类、Y类和W类135亚类；肺炎链球菌、大肠杆菌K1、B型流感嗜血菌；来源于微生物的抗原；半抗原、湿用药物；治疗药物；环境方剂；以及肝炎特异性抗原。
在本发明的另一项实施方案中，可在抗体结合蛋白层内加入一类特定微生物的营养物。这样就可以检测极低浓度的微生物，方法是首先将本发明的生物传感器与加入的营养物相接触，然后在适于所结合微生物生长的条件下将该生物传感器保温。使微生物生长，直至其数量足以形成衍射图像。当然在某些情况下，微生物可在模式化单层中不存在营养物的条件下增殖至足以形成衍射图像。
本发明还提供一种方法，用来将诸如抗体等受体模式化印制(pattern)在聚合物膜或金属化聚合物膜上。该方法需要可结合抗体的微晒图蛋白。这些蛋白包括，但不局限于，蛋白A、蛋白G、蛋白L，及其重组形式。商品形式的蛋白，如Zymed(San Francisco，CA)的KAPPALOCKTM，也同样适用。因此，该蛋白物质的定义为，用来与含有所需分析物特异性抗体的其它部分产生特异性配对结合的基底材料。
与模式化蛋白结合的受体物质的特征在于，能够与一种或多种目标分析物特异性结合。无论选择何种目标分析物，都可通过设计使该蛋白物质能够与该目标分析物特异性结合。在一项优选实施方案中，该生物传感装置的设定和编排方式能够在目标分析物被夹在抗体和衍射增强元件之间时对复色光(polychromatic light)透射发生反应而产生一种裸眼可辨的图像。在分析物的大小足以使光发生衍射的另一项实施方案中，无需使用衍射增强元件。
在许多情况下需要一种“阻断物”来避免非特异性结合。此处使用的术语“阻断物”是指一种可附着于传感器表面从而“阻断”或避免非分析物与该表面(模式化区域或非模式化区域)非特异性结合的试剂。阻断可作为后处理步骤在表面已被晒图之后进行(“后阻断”)，这属于用另一种巯基试剂来填补非晒图区域的常规技术。但本发明人发现，“前阻断”技术要优于后阻断技术。前阻断技术是用一种含非巯基的阻断物对基质表面进行预处理，然后再晒图。尽管不希望受任何理论的约束，但从理论上讲，晒图原料(通常含有硫)可取代物理吸附的阻断物，从而使抗体结合蛋白原料可直接与基质的表面结合。如果需要，也可随后进行后阻断。阻断物包括，但不局限于，β-酪蛋白、白蛋白如牛血清白蛋白、非离子型表面活性剂(pluronic)或其它表面活性剂、聚乙二醇、聚乙烯醇，或上述化合物的硫衍生物，以及该领域普通技术人员所了解的其它任何阻断物。
含有目标分析物的基体可以是固体、气体、或一种体液，如组织液、粘液、唾液、尿、粪便物、组织、骨髓、脑脊液、血清、血浆、全血、滑膜液、痰、缓冲液、抽提液、精液、阴道分泌物、心包液、胃液、腹膜液、胸膜液、喉吸取液或其它清洗液等。目标分析物可以是抗原、抗体、酶、毒素、环境药剂(environmental agent)、细胞质成分、伞毛或鞭毛成分、蛋白、多糖、药物，或可被抗体识别的其它任何物质。例如，细菌的受体物质可特异性结合其表面膜成分、蛋白或脂类、多糖、核酸或酶。细菌的表明性分析物可以是糖类或多糖、酶、核酸、膜成分、神经节苷脂或宿主对该细菌应答而产生的抗体。分析物的存在可表明一种感染性疾病(细菌性或病毒性)、癌症、变态反应或其它医学病症或病情。分析物的存在也可表明水污染或食物污染，或表明其它有害物质的存在。该分析物可表明药物滥用或用来监控治疗剂的水平。
在某些情况下，分析物可以不仅与受体物质结合，还可导致该受体物质发生可检测的变化。这种相互作用可导致测试表面质量的提高，也可导致测试表面受体物质的量降低。后一情况的一个实例是降解酶或降解物质与一种固定化特异底物发生相互作用。此时是在与目标分析物发生相互作用之前可传感到一种衍射图像，而如果分析物存在，则该衍射图像将消失。分析物与受体物质结合、杂交或相互作用的具体机制对本发明而言并不重要，但它会影响最终测定方案所采用的反应条件。
一般而言，抗体结合蛋白可被动粘附于基质层。如果需要，也可在抗体结合蛋白上连接功能基团，以使其共价连接于测试表面。
有多种技术可用来将蛋白物质涂布在基质上。用抗体结合蛋白包被测试表面的方法可以是以离散点阵(discrete arrays)或模式涂覆溶液；喷洒、喷墨或其它印制方法；或晒图方法。所选的技术应能够使包被大量测试表面所需的蛋白物质量达到最小，并且能够在应用过程中保持蛋白物质的稳定性/功能性。该技术还须能够将蛋白物质以一种完全相同的和可重复的方式涂布或粘连在基质上。
下一步包括将模式化表面暴露于对目标分析物具有特异性的抗体。这一步的实现方法可以是在溶液中完全浸没预定的时间、喷洒或旋涂。此外，将不同抗体进行受控排布可获得多重分析物系统。该方法的另一优点在于模块化生产方式。换句话说，可将带有模式化抗体结合蛋白的系统加以优化，然后可根据所结合的抗体对多种分析物进行检测。
分析物所处的介质可以是固体、类凝胶、流体或气体。对检测体液中的分析物而言，该流体可选自，但不局限于，尿、血清、血浆、脊髓液、痰、全血、唾液、尿殖分泌物、粪便提取物、心包液、胃液、腹膜液、胸膜液、阴道分泌物，或喉吸取液；使用的方法可选择性地包括使用一种分光光度计来测量出现的折射图像。本发明所述生物传感装置可考虑使用的最常见气体为空气。
本发明的生物传感装置采用在基质上，理想的是在金属化聚合物膜上，进行模式化抗体结合蛋白的晒图，随后暴露于抗体以获得模式化抗体的方法，同时涉及由此产生的组合物以及这些组合物的应用。模式化抗体结合蛋白层可实现能与分析物结合的抗体的受控排布。此处使用的术语“模式化抗体结合蛋白层”是指包括固体形式的基质上任何模式的，抗体结合蛋白加所需抗体层。
当含有模式化抗体结合蛋白层的薄膜暴露于可与其抗体反应的分析物时，该薄膜将根据抗体与目标分析物间的反应产生不同的光学衍射图像。使用的流体可以是一种高表面张力流体，如水。使用的光可以是可见光，也可以是薄膜的反射光或是透射光，分析物可以是能够与模式化抗体结合蛋白层反应的任何化合物。
在一项优选实施方案中，该方法涉及在可使基质的折射率发生变化的条件下将基质与一种可能含有分析物的测试样品相接触。当光透射过带有模式化抗体结合蛋白层的薄膜时可形成一种可见的衍射图像，该衍射图像的显现方法可以是将光引至某一表面，或是直接透过基质进行观察。
在一项实施方案中，本发明采用将微晒图薄膜装在量尺(dipstick)末端的量尺方式来加以实施。在使用时，将量尺浸入可能含有待检分析物的流体中并维持数分钟。然后取出量尺，并用光透射薄膜或是通过薄膜后的光对其进行观测。如果观测到图像，则该流体中存在分析物。
本发明的另一项实施方案是在同一支持物上建立多重分析物测试系统。如
图1所示，条带10上带有若干微晒图薄膜20、25、30和35，每种膜均印制有一种模式40。各微晒图金属化薄膜15、20、25和30含有对不同分析物具有特异性的不同抗体。可以看到，本发明可采用带有多种微晒图金属化薄膜的任何阵列模式化，因而本发明所述生物传感装置的使用者可通过单次测试对介质中多种分析物的存在情况进行检测。
在本发明的又一项实施方案中，可将生物传感器连接于带背胶的胶粘物(Sticker)或贴纸(decal)，继而可置于硬表面或容器壁上。该生物传感器可置于诸如食品包装或玻璃瓶等容器的内表面。然后可通过该生物传感器的显象来确定分析物的存在情况。
典型的，涂钛(titanium-primed)聚对苯二甲酸乙二醇酯薄膜、Si/SiO2晶片或玻璃片来支持5-2000nm厚的金膜。钛可作为金与支持物的增粘剂。抗体结合蛋白可在晒图过程中连接在于金的表面。
图2概述了微晒图的方法。利用一种弹性印模(stamp)将抗体结合蛋白“印墨”经接触转移到表面；如果印模被模式化，那么即可形成模式化的抗体结合蛋白层。印模的制作方法是将聚二甲基硅氧烷(PDMS)浇注在具有所需模式的底版(master)上。底版的制备采用标准影印技术，也可利用具有微观表面特性的现有材料构造而成。
在一项优选的典型实验方法实施方案中，将通过影印法产生的底版置于玻璃或塑料培养皿内，并倒入比率为10∶1(w∶w)的SYLGARD硅酮弹性体184与SYLGARD硅酮弹性体184固化剂(curing agent)(Dow Corning Corporation)的混合物。在室温下将弹性体静置约30分钟并减压脱气，然后在60℃下至少固化4小时，再温和地由底版剥落。弹性印模的上墨方法是将印模暴露于0.1-10μM的抗体结合蛋白二硫化衍生物水溶液，其实现方法通常是将印模面朝下在该溶液中置10秒-10分钟。在环境条件下或是一般通过暴露于空气或氮气流使印模干燥。将上墨后的印模涂覆于金表面。施加轻微压力以确保印模与该表面的完全接触。在1秒-5分钟后，温和地使印模与该表面脱离。然后将表面漂洗并干燥。作为选择，还可通过使用第二种印模或将整个表面暴露于不同试剂来对未印制区域做进一步的衍生化。随后还可暴露于蛋白阻断剂，如BSA或β-酪蛋白，或该领域所熟知的其它任何制剂。在模式被确定后，需要将该模式化表面暴露于对目标分析物具有特异性的抗体，方法是浸没在溶液中或是将溶液喷洒或旋涂在该模式化表面。
印模的弹性特性对该方法的成功实现非常重要。固化的聚二甲基硅氧烷(PDMS)的弹性足以使印模与表面发生良好的共形接触，甚至当该表面具有明显的起伏时也是如此；这种接触是蛋白高效接触转移至金膜的基础。当印模由底版剥落时，PDMS的弹性特性也发挥了重要作用如果印模为刚性(象底版那样)，那么当固化完成后将很难在两种基质均不损坏的条件下将印模与底版分离。PDMS还具有充分的刚性来维持其形状，甚至亚微米大小的部件也是如此。PDMS表面的界面自由能很低(y＝22.1 dynes/cm)，并且由其制作的印模不与金膜粘连。该印模十分耐用，同一印模可在持续数月的时间里使用多达100次而不出现性能的明显降低。PDMS的聚合特性在上墨过程中也发挥了至关重要的作用，它能够通过膨胀使印模吸收蛋白墨。
以下是本发明所述方法和组合物的更详细描述。其中引用的所有出版物均全面引入作为参考。
任何塑料薄膜均适用于本发明。优选而言，该塑料薄膜上还可沉积有一层金属涂层。这些塑料薄膜包括，但不局限于，多种聚合物，如对苯二甲酸亚乙酯(MYLAR)、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯、丙烯腈-丙烯酸甲酯共聚物、玻璃纸，纤维素聚合物，如乙基纤维素、醋酸纤维素、醋酸丁酸纤维素、丙酸纤维素、三醋酸纤维素、三醋酸纤维素，聚乙烯、聚乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、离子交联聚合物(乙烯聚合物)、聚乙烯-尼龙共聚物、聚丙烯、甲基戊烯聚合物、聚氟乙烯和芳香聚砜。优选而言，该塑料薄膜的光学透明度应大于80％。其它适当的热塑性塑料及供应厂商可在，例如，Modern PlasticsEncyclodedia(McGraw-Hill Publishing Co.，New York 1923-1996)的参考部分中找到。
在本发明的一项实施方案中，聚合物薄膜上具有一层金属涂层，并且光学透明度约为5％-95％。本发明使用的热塑性塑料薄膜的更理想的光学透明度约为20％-80％。在本发明的一项理想实施方案中，聚合物薄膜的光学透明度至少约为80％，金属涂层的厚度可使光学透明度维持在约20％以上，从而使折射光或透射光可以产生衍射图像。这相当于金属涂层的厚度约为10nm。但是在本发明的其它实施方案中，金的厚度约为1nm-1000nm。
在薄膜上沉积的优选金属为金。但也可使用银、铝、铬、铜、铁、锆、铂和镍，以及这些金属的氧化物。
具有适当大小的皱折的任何表面原则上都可作为底版。微晒图方法首先需要一种适当的凸纹(relief)表面结构来浇注弹性印模。这种“底版”模板的产生可采用影印法或其它方法，如商品形式的衍射光栅。在一项实施方案中，可利用聚二甲基硅氧烷来制备该印模。
在另一项实施方案中，本发明描述了一种光学测定装置，该装置具有一种光学活性受体表面，其设定和编排方式可用来同时测定多个表面样品的一种目标分析物，另外还描述了一种自动液体装卸设备(如一种移液装置)，其设定和编排方式可用来在表面施加样品和试剂溶液。
以下提供一种说明性方法，通过该方法可产生适于构建本发明所述光学测试表面的最佳原料和方法。一般而言，本发明包括用于直接检测分析物的新型光学活性测试表面。这些测试表面含有通过附着层——即抗体结合蛋白——与其相连接的分析物特异性抗体。因此，本发明提供一种检测装置，包括选择一种光学基质，用抗体结合蛋白对其进行印制，然后将其暴露于抗目标分析物的抗体。检测方法涉及将该装置与含有目标分析物的流体样品相接触，然后通过观查是否形成衍射图像来检测透射光衍射或折射光衍射的变化。
本发明具有广泛的应用领域，并且可在多种特异性配对结合测定方法中使用。例如，本发明的装置可在免疫测定法中用于抗原或抗体的检测。该装置经过修改可在直接的、间接的或竞争性的检测方案中使用。
在本发明的一项实施方案中，抗体结合蛋白层具有以下通式X-P-AbX是一种使化学吸附于金属或金属氧化物得以实现的可选媒介物。例如，X可以是不对称的或对称的二硫化物(-R’SSY’、-RSSY)、硫化物(-R’SY’、-RSY)、二硒化物(-R’Se-SeY’)、硒化物(-R’SeY’、-RSeY)、硫醇(-SH)、腈(-CN)、异腈、硝基(-NO2)、硒醇(-SeH)、三价磷化合物、异硫氰乙酸、黄原乙酸、硫氨基甲乙酸、膦、硫羰酸或二硫羰酸、羧酸、羟基酸和异羟肟酸。
P表示可与X衍生的抗体结合蛋白。Ab表示目标分析物的特异性抗体。
印模涂敷可在空气中或诸如水等流体内进行，以避免蛋白物质的过度扩散。对大规模或连续印制方法而言，最理想的是在空气中印制，因为这些方法需要较短的接触时间。
本发明的一项实施方案是利用抗体结合蛋白层在金属化热塑性聚合物上形成模式。本发明的另一项实施方案是利用抗体结合蛋白层形成模式凹纹。在模压(stamping)过程完成后，可选择性地利用，例如，酪蛋白等试剂将塑料上的金属化区域钝化或阻断。优选的是在暴露于抗体之前实施这一步骤。
本发明将通过以下实施例做进一步的说明，这些实施例决不是要对本发明的范围加以限制。相反，应清楚了解的是，可能有多种其它实施方案、修改方案及其等价方案，在阅读本说明书后会发现，这些方案对该领域的技术人员而言并未脱离本发明的精神主旨。
实施例实施例1通过碳化二亚胺与乙基二甲氨基二碳化二亚胺(EDAC，Polysciences试剂盒3号瓶，目录编号19539)的偶合产生抗体缀合的聚苯乙烯颗粒。该实施例是用EDAC水溶液将0.5微米直径蓝色羧乙酸颗粒(Bangs Laboratories；Fishers，Indiana；Cat#D0005070CB)的10％悬浮液共0.125mL活化1-4小时，漂洗，然后暴露于300微克的黄体生成素μ亚基单克隆抗体(FitzgeraldIndustries，Cat.No.10-L10，Clone No.M94136)。将颗粒再次漂洗，用牛血清白蛋白阻断，并以2.5％的浓度保存在磷酸缓冲盐溶液中。
将1.3mg Sulfo-LC-SPDP(Pierce Chemical Co.；Rockford，IL)溶于2.07mL去离子水，制备成10mM的Sulfo-LC-SPDP水性储液。结合反应是在含有20mM磷酸钠缓冲液、150mM NaCl、1mM EDTA和0.02％叠氮化钠的pH7.5的磷酸缓冲盐溶液(PBS)中进行。将1毫克冻干的蛋白A或蛋白G溶解于450微升PBS，并在该抗体溶液中加入50微升Sulfo-LC-SPDP储液。将混合物在室温反应60分钟。将该样品加到此前已用5倍柱体积(25mL)PBS平衡的5mL聚丙烯酰胺脱盐柱上。以PBS为洗脱缓冲液来洗脱组分，并用COOMASSIEPlusProtein Assay(Pierce Chemical Co.)监测各组分中的蛋白。典型的是在微量滴定板中将50μL COOMASSIE试剂与50μL各组分相混合。COOMASSIE试剂与蛋白反应，产生蓝颜色，颜色的强度取决于组分中的蛋白含量。产生的蓝色最强的级分即为含有大部分洗脱蛋白的组分。将这些级分合并，作为二硫化物形式的最终衍生产物。晒图通常即采用这种形式。
也可选择性地通过还原反应将二硫化物形式的硫醇化粘合剂中存在的二硫吡啶基还原成巯基。此时衍生蛋白的脱盐不是在PBS平衡的柱上进行，而是在醋酸缓冲液(100mM醋酸钠缓冲液、100mM NaCl，pH4.5)平衡的柱上进行。该醋酸缓冲液的酸性pH值可避免天然蛋白中存在的二硫键发生不必要的还原。该还原反应是将12mg二硫苏糖醇(DTT)溶于500mL醋酸缓冲液，并加入1mL经SPDP衍生的蛋白。在室温下将反应混合物保温30分钟，然后在已用5倍柱体积(25mL)醋酸缓冲液平衡的5mL脱盐柱上脱盐。再次利用上述COOMASSIEProtein Assay试剂对洗脱组分的蛋白含量进行监测，将所含蛋白量最高的组分合并，用于随后的晒图。
二硫化物形式和还原形式的硫醇化粘合剂在晒图前均以水溶液形式保存于4℃。
用5mg/mLβ-酪蛋白溶液将金/MYLAR膜预处理(或阻断)10分钟，然后将膜彻底清洗，并置于空气流下干燥。用硫醇化抗体结合蛋白包被10微米大小的圆形PDMS印模，方法是将该印模面朝下置于0.5mg/mL硫醇化蛋白A(或蛋白G)溶液中，并浸泡10分钟。利用强空气流将印模表面彻底干燥。将包被的印模与金/MYLAR接触5分钟，然后移开。将印制的所得金/MYLAR置蒸馏水中清洗并干燥。
然后将该传感器暴露于抗体溶液(例如以2βg/mL浓度溶于PBS溶液的黄体生成素-β单克隆抗体，Catalog No.10-L15，Clone No.M94187，Fitzgerald Industries International，Inc.；Concord，MA)，时间30分钟，然后清洗并空气干燥。
将传感器样品暴露于2□g/mL的羊抗鼠HRP(辣根过氧化物酶标记的)水溶液(含有1％牛血清白蛋白)，方法是将一小滴该溶液滴加在传感器表面，室温下放置30-60分钟。用0.02％吐温20溶液清洗样品，然后用蒸馏水清洗。随后暴露于TMB膜增色溶液(如Kirkegaard与Perry Laboratories试剂的10∶1 v/v混合物，目录编号50-76-18和50-77-01)，方法是将TMB溶液加在传感器样品上，放置10分钟。这样可在圆圈内或部件内显现出蓝色沉淀，并且用点光源照射时可产生衍射图像。
也可选择性地将分析物溶液(如该实施例使用的黄体生成素)与微颗粒相混合(通常是50-70微升分析物溶液与10-20微升的1.5-2.5％抗体结合颗粒形成悬浮液)，并加在传感器上(通常使用1平方厘米的传感器样品)。5-10分钟后，将中心凿有小孔的硝化纤维素圆片(孔径5或8微米，Sigma No.N3771或N4146)置于传感器上。这样做可以吸走过量的液体和未结合的微颗粒。此时用点光源透射传感器样品(通过硝化纤维素膜上的小孔)。如果分析物存在，则可在光束的另一侧观测到衍射图像。
实施例2通过碳化二亚胺与乙基二甲氨基二碳化二亚胺(EDAC，Polysciences试剂盒3号瓶，目录编号19539)的偶合产生结合有抗体的聚苯乙烯颗粒。该实施例是用EDAC水溶液将0.5微米直径蓝色羧乙酸颗粒(Bangs Laboratories；Fishers，Indiana；Cat#D0005070CB)的10％悬浮液0.125mL活化1-4小时，漂洗，然后暴露于300微克的IgE多克隆抗体(为了不与模式化蛋白A反应，可使用例如鸡抗IgE)。将颗粒再次漂洗，用牛血清白蛋白阻断，并以2.5％的浓度保存在磷酸缓冲盐溶液中。
将1.3mg Sulfo-LC-SPDP(Pierce Chemical Co.；Rockford，IL)溶于2.07mL去离子水，制备成10mM的Sulfo-LC-SPDP水性储液。结合反应是在含有20mM磷酸钠缓冲液、150mM NaCl、1mM EDTA和0.02％叠氮化钠的pH7.5的磷酸缓冲盐溶液(PBS)中进行。将1毫克冻干的蛋白A溶解于450微升PBS，并在该抗体溶液中加入50微升Sulfo-LC-SPDP储液。将混合物在室温反应60分钟。将该样品加到此前已用5倍柱体积(25mL)PBS平衡的5mL聚丙烯酰胺脱盐柱上。以PBS为洗脱缓冲液来洗脱组分，并用COOMASSIEPlus ProteinAssay(Pierce Chemical Co.)监测各组分中的蛋白。典型的是在微量滴定板中将50μL COOMASSIE试剂与50μL各级分相混合。COOMASSIE试剂与蛋白反应，产生蓝颜色，颜色的强度取决于级分中的蛋白含量。产生的蓝色最强的级分即为含有大部分洗脱蛋白的级分。将这些级分合并，作为二硫化物形式的最终衍生产物。晒图通常即采用这种形式。
也可选择性地通过还原反应将二硫化物形式的硫醇化粘合剂中存在的二硫吡啶基还原成巯基。此时衍生蛋白的脱盐不是在PBS平衡的柱上进行，而是在醋酸缓冲液(100mM醋酸钠缓冲液、100mM NaCl，pH4.5)平衡的柱上进行。该醋酸缓冲液的酸性pH值可避免天然蛋白中存在的二硫键发生不必要的还原。该还原反应是将12mg二硫苏糖醇(DTT)溶于500mL醋酸缓冲液，并加入1mL经SPDP衍生的蛋白。在室温下将反应混合物保温30分钟，然后在已用5倍柱体积(25mL)醋酸缓冲液平衡的5mL脱盐柱上脱盐。再次利用上述COOMASSIEProtein Assay试剂对洗脱组分的蛋白含量进行监测，将所含蛋白量最高的组分合并，用于随后的晒图。
二硫化物形式和还原形式的硫醇化粘合剂在晒图前均以水溶液形式保存于4℃。
用5mg/mLβ-酪蛋白溶液将金/MYLAR膜预处理(或阻断)10分钟，然后将膜彻底清洗，并置于空气流下干燥。用硫醇化抗体结合蛋白包被10微米大小的圆形PDMS印模，方法是将该印模面朝下置于0.5mg/mL硫醇化蛋白A溶液中，并浸泡10分钟。利用强空气流将印模表面彻底干燥。将包被的印模与金/MYLAR接触5分钟，然后移开。将印制的所得金/MYLAR置蒸馏水中清洗并干燥。
将分析物溶液(通常为50-70微升以2μg/mL浓度溶于PBS溶液的IgE(Catalog No.30-AI05，Fitzgerald IndustriesInternational，Inc.；Concord，MA))加在传感器上(通常为1平方厘米)，置0-20分钟，然后加入10-20微升的1.5-2.5％抗体结合颗粒形成悬浮液，再置5-20分钟。然后将中心凿有小孔的硝化纤维素圆片(孔径5或8微米，Sigma No.N3771或N4146)置于传感器上。这样做可以吸走过量的液体和未结合的微颗粒。此时用点光源透射传感器样品(通过硝化纤维素膜上的小孔)。如果分析物存在，则可如图所示在光束的另一侧观测到衍射图像。
权利要求
1.一种生物传感器，包括一种聚合物膜；以及在该聚合物膜上模式印制的一种抗体结合蛋白层，其中该抗体结合蛋白层上带有一种对分析物具有特异性的抗体。
2.权利要求1的生物传感器，其中抗体结合蛋白层的印制模式能够使该生物传感器在与分析物结合的情况下将透射光衍射而形成一种衍射图像。
3.权利要求2的生物传感器，其中的衍射图像用裸眼可以看到。
4.权利要求1的生物传感器，其中聚合物膜进一步含有一种金属涂层。
5.权利要求4的生物传感器，其中的金属选自金、银、铬、镍、铂、铝、铁、铜、锆，或其氧化物。
6.权利要求4的生物传感器，其中的金属为金。
7.权利要求6的生物传感器，其中金涂层的厚度约为1纳米-1000纳米。
8.权利要求1的生物传感器，其中的聚合物膜选自对苯二甲酸亚乙酯、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯、丙烯腈-丙烯酸甲酯共聚物、玻璃纸，纤维素聚合物如乙基纤维素、醋酸纤维素、醋酸丁酸纤维素、丙酸纤维素、三醋酸纤维素、三醋酸纤维素，聚乙烯、聚乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、离子交联聚合物(乙烯聚合物)、聚乙烯-尼龙共聚物、聚丙烯、甲基戊烯聚合物、聚氟乙烯或芳香聚砜。
9.权利要求8的生物传感器，其中的聚合物膜为对苯二甲酸亚乙酯。
10.权利要求1的生物传感器，其中的聚合物膜为光学透明的。
11.权利要求1的生物传感器，其中的聚合物膜具有5％-95％的光学透明度。
12.权利要求1的生物传感器，其中的聚合物膜具有约20％-80％的光学透明度。
13.权利要求1的生物传感器，其中的抗体结合蛋白层由具有以下通式的化合物形成X-P-Ab其中X能够与聚合物膜上的金属或金属氧化物反应；P是一种抗体结合蛋白；并且Ab是一种目标分析物特异性抗体。
14.权利要求13的生物传感器，其中X为不对称的或对称的二硫化物(-SSY’、-SSY)、硫化物(-’SY’、-SY)、二硒化物(-’Se-SeY’)、硒化物(-SeY’、-SeY)、硫醇(-SH)、腈(-CN)、异腈、硝基(-NO2)、硒醇(-SeH)、三价磷化合物、异硫氰乙酸、黄原乙酸、硫氨基甲乙酸、膦、硫羰酸或二硫羰酸、羧酸、羟基酸和异羟肟酸。
15.权利要求1的生物传感器，其中分析物选自细菌、酵母、真菌、病毒、类风湿因子、IgG、IgM、IgA和IgE抗体、癌胚抗原、链球菌A类抗原、病毒抗原、自身免疫疾病相关抗原、变应原、肿瘤抗原、链球菌B类抗原、HIVI或HIVII抗原、抗体、病毒、RSV特异性抗原、抗原、酶、激素、多糖、蛋白、脂类、糖类、药物、核酸、脑膜炎奈瑟菌A类、B类、C类、Y类和W类135亚类、肺炎链球菌、大肠杆菌K1、B型流感嗜血菌、来源于微生物的抗原、半抗原、滥用药物、治疗药物、环境药剂或肝炎特异性抗原。
16.权利要求15的生物传感器，其中的分析物为细菌、酵母、真菌或病毒。
17.权利要求16的生物传感器，其中的真菌为念珠菌。
18.权利要求16的生物传感器，其中的细菌为沙门氏菌。
19.权利要求1的生物传感器，其中的蛋白物质选自蛋白A、蛋白G、蛋白L，或其重组形式。
20.一种制备生物传感器的方法，包括在聚合物膜上印制某种模式的抗体结合蛋白层并随后加上抗体层。
21.权利要求20的方法，其中抗体结合蛋白层的印制模式能够使该生物传感器在与分析物结合的情况下将透射光衍射而形成一种衍射图像。
22.权利要求20的方法，其中的聚合物膜进一步含有一种金属涂层。
23.权利要求22的方法，其中的金属选自金、银、铬、镍、铂、铝、铁、铜、锆，或其氧化物。
24.权利要求22的方法，其中的金属为金。
25.权利要求24的方法，其中金涂层的厚度约为1纳米-1000纳米。
26.权利要求20的方法，其中的聚合物膜选自对苯二甲酸亚乙酯、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯、丙烯腈-丙烯酸甲酯共聚物、玻璃纸，纤维素聚合物如乙基纤维素、醋酸纤维素、醋酸丁酸纤维素、丙酸纤维素、三醋酸纤维素、三醋酸纤维素，聚乙烯、聚乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、离子交联聚合物(乙烯聚合物)、聚乙烯-尼龙共聚物、聚丙烯、甲基戊烯聚合物、聚氟乙烯或芳香聚砜。
27.权利要求26的方法，其中的聚合物膜为对苯二甲酸亚乙酯。
28.权利要求20的方法，其中的聚合物膜为光学透明的。
29.权利要求28的方法，其中的聚合物膜具有5％-95％的光学透明度。
30.权利要求28的方法，其中的聚合物膜具有约20％-80％的光学透明度。
31.权利要求20的方法，其中的抗体结合蛋白层由具有以下通式的化合物形成X-P-Ab其中X能够与聚合物膜上的金属或金属氧化物反应；P是一种抗体结合蛋白；并且Ab是一种目标分析物特异性抗体。
32.权利要求31的方法，其中X为不对称的或对称的二硫化物(-SSY’、-SSY)、硫化物(-’SY’、-SY)、二硒化物(-’Se-SeY’)、硒化物(-SeY’、-SeY)、硫醇(-SH)、腈(-CN)、异腈、硝基(-NO2)、硒醇(-SeH)、三价磷化合物、异硫氰乙酸、黄原乙酸、硫氨基甲乙酸、膦、硫羰酸或二硫羰酸、羧酸、羟基酸和异羟肟酸。
33.权利要求20的方法，其中分析物选自细菌、酵母、真菌、病毒、类风湿因子、IgG、IgM、IgA和IgE抗体、癌胚抗原、链球菌A类抗原、病毒抗原、自身免疫疾病相关抗原、变应原、肿瘤抗原、链球菌B类抗原、HIVI或HIVII抗原、抗体、病毒、RSV特异性抗原、抗原、酶、激素、多糖、蛋白、脂类、糖类、药物、核酸、脑膜炎奈瑟菌A类、B类、C类、Y类和W类135亚类、肺炎链球菌、大肠杆菌K1、B型流感嗜血菌、来源于微生物的抗原、半抗原、滥用药物、治疗药物、环境剂或肝炎特异性抗原。
34.权利要求33的方法，其中的分析物为细菌、酵母、真菌或病毒。
35.权利要求20的方法，其中的蛋白物质选自蛋白A、蛋白G、蛋白L，或其重组形式。
36.一种检测介质中的分析物的方法，包括将含有分析物的待测介质与一种生物传感装置相接触，该生物传感装置包括一种聚合物膜；以及在该聚合物膜上模式印制的一种抗体结合蛋白层，其中该抗体结合蛋白层上带有一种对分析物具有特异性的蛋白物质；以及用一种光透射该聚合物膜；并且通过检测透射光的衍射图像来检测与蛋白物质结合的分析物的存在情况。
37.权利要求36的方法，其中的衍射图像用裸眼可以看到。
38.权利要求36的方法，其中聚合物膜进一步含有一种金属涂层。
39.权利要求38的方法，其中的金属为金。
40.一种生物传感器，包括一种聚合物膜；以及在该聚合物膜上模式印制的一种抗体结合蛋白层，其中该抗体结合蛋白层可作为分析物的一种受体。
41.权利要求40的生物传感器，其中抗体结合蛋白层的印制模式能够使该生物传感器在与分析物结合的情况下将透射光衍射而形成一种衍射图像。
42.权利要求41的生物传感器，其中的衍射图像用裸眼可以看到。
43.权利要求40的生物传感器，其中聚合物膜进一步含有一种金属涂层。
44.权利要求43的生物传感器，其中的金属选自金、银、铬、镍、铂、铝、铁、铜、锆，或其氧化物。
45.权利要求43的生物传感器，其中的金属为金。
46.权利要求45的生物传感器，其中金涂层的厚度约为1纳米-1000纳米。
47.权利要求40的生物传感器，其中的聚合物膜选自对苯二甲酸亚乙酯、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯、丙烯腈-丙烯酸甲酯共聚物、玻璃纸，纤维素聚合物如乙基纤维素、醋酸纤维素、醋酸丁酸纤维素、丙酸纤维素、三醋酸纤维素、三醋酸纤维素，聚乙烯、聚乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、离子交联聚合物(乙烯聚合物)、聚乙烯-尼龙共聚物、聚丙烯、甲基戊烯聚合物、聚氟乙烯或芳香聚砜。
48.权利要求47的生物传感器，其中的聚合物膜为对苯二甲酸亚乙酯。
49.权利要求40的生物传感器，其中的聚合物膜为光学透明的。
50.权利要求40的生物传感器，其中的聚合物膜具有5％-95％的光学透明度。
51.权利要求40的生物传感器，其中的聚合物膜具有约20％-80％的光学透明度。
52.权利要求40的生物传感器，其中的抗体结合蛋白层由具有以下通式的化合物形成X-P其中X能够与聚合物膜上的金属或金属氧化物反应；P是一种抗体结合蛋白。
53.权利要求52的生物传感器，其中X为不对称的或对称的二硫化物(-SSY’、-SSY)、硫化物(-’SY’、-SY)、二硒化物(-’Se-SeY’)、硒化物(-SeY’、-SeY)、硫醇(-SH)、腈(-CN)、异腈、硝基(-NO2)、硒醇(-SeH)、三价磷化合物、异硫氰乙酸、黄原乙酸、硫氨基甲乙酸、膦、硫羰酸或二硫羰酸、羧酸、羟基酸和异羟肟酸。
54.权利要求40的生物传感器，其中分析物选自诸如IgG、IgM、IgA和IgE等抗体。
55.权利要求40的生物传感器，其中的蛋白物质选自蛋白A、蛋白G、蛋白L，或其重组形式。
56.权利要求40的生物传感器，该生物传感器进一步包含一种衍射增强元件，其中该衍射增强元件包括能够与分析物结合的抗体。
全文摘要
本发明提供一种廉价而又灵敏的装置以及用来对介质中的分析物进行检测和定量的方法。该装置含有一种金属化薄膜,膜上印有预定模式的特定抗体结合蛋白。一旦目标分析物附着于印有蛋白的塑料薄膜的特定区域,即可通过该分析物的确定尺寸和特定精确位置产生透射光衍射和/或反射光衍射。产生的衍射图像可用眼睛方便地观察,也可选择性地使用一种传感装置。
文档编号G01N21/47GK1338052SQ99814625
公开日2002年2月27日 申请日期1999年11月22日 优先权日1998年12月17日
发明者K·麦格拉斯, R·M·凯洛, D·S·埃维尔哈特 申请人:金伯利-克拉克环球有限公司