微生物细胞表面抗原的筛选与鉴定方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种简便、快捷筛选和鉴定微生物细胞表面蛋白抗原的方法。
【背景技术】
[0002] 业已证明，采用疫苗接种是预防微生物疾病有效、经济的免疫干预途径。微生物 细胞表面蛋白由于定位于细胞表面，与宿主免疫系统直接接触，其刺激机体产生的特异性 抗体与相应的微生物细胞表面蛋白结合后，通过中和作用抑制微生物感染，或介导免疫细 胞的吞噬，在病原体入侵最初阶段即可发挥作用。因此微生物细胞表面蛋白是良好的疫苗 候选蛋白，也是研究的热点。如学者发现弧菌细胞表面蛋白OmpA、OmpU等具有良好的免疫 原性和免疫保护性，可作为疫苗的候选蛋白。在微生物细胞表面蛋白抗原筛选方面，常规免 疫蛋白组学采用的是先分离微生物细胞表面蛋白、然后进行免疫印记筛选，但提取细胞表 面蛋白，特别是外膜蛋白存在一定的困难，而且分离外膜蛋白的二维电泳操作繁琐，重复性 差，对低拷贝蛋白、极端等电点蛋白不能展示。而且现提取分析微生物细胞表面蛋白，破坏 了细胞表面蛋白的天然结果，不能很好反应出体内免疫反应的过程。这在一定程度上限制 了它的应用。
【发明内容】
[0003] 本发明旨在提供一种简单、快捷的筛选和鉴定微生物细胞表面抗原的方法，其技 术是利用免疫沉淀使微生物全细胞与微生物抗血清中的微生物细胞表面蛋白抗体发生免 疫反应，超声处理抗体与微生物全细胞复合物，再用蛋白A/G琼脂糖捕捉抗原抗体复合物。 SDS-PAGE简单分离抗原抗体复合物，确定具有免疫原性的蛋白质，最后采用质谱技术分析 和鉴定这些免疫原。
[0004] 本发明所说的微生物细胞表面抗原的筛选和鉴定方法的具体步骤如下：
[0005] 1)用微生物全细胞免疫沉淀分离出细胞表面蛋白抗体：微生物细胞收集后与微生 物抗血清按体积比抗血清：微生物=1 :500加入抗血清冰浴孵育，阴性血清作为对照，离心 去除抗血清细胞表面抗体外其他成份,收集微生物细胞与细胞表面抗体复合物；
[0006] 2)将分离出的微生物细胞与细胞表面抗体复合物，超声波破碎后，用蛋白A/G琼 脂糖与冰浴孵育，捕捉抗原抗体复合物，洗涤三次后，洗脱抗原抗体复合物；
[0007] 3)洗脱后的抗原抗体复合物SDS-PAGE分析，用银染观察结果，阴性对照没有或很 少，实验组有或很多的蛋白条带，该条带中的所有蛋白即具有免疫原性，再使用超滤管对抗 原抗体复合物进行浓缩后在进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色出现的阳性条带准备进 行质谱；
[0008] 4)免疫原的定性：取出具有免疫原性的全部考染蛋白质条带，按常规质谱样品处 理方法进行样品制备，然后进行质谱和生物信息分析，以确定抗原的蛋白质种类。
[0009] 所说的微生物为细菌，真菌。
[0010] 超声破碎时所采用的输出功率、时间、次数和时间间隔可按研究对象进行调整，一 般可采用每次3秒，间隔4秒，超声2min。 toon] 所说的微生物抗血清是用微生物全细胞免疫动物得到的特异性抗血清。
[0012] 本发明所采取的策略与传统的免疫蛋白组学不同，是先进行微生物细胞表面蛋白 与抗血清进行免疫反应，再简单分离具有免疫原性的微生物细胞表面蛋白，最后利用质谱 技术和生物信息学分析确定这些微生物表面蛋白抗原的种类。从而建立了一种新的基于免 疫沉淀的微生物细胞表面蛋白抗原筛选技术，用于高通量筛选具有免疫原性的微生物细胞 表面蛋白质以作为多价疫苗的候选靶位。根据免疫原的丰度和与抗体的亲和力，可以确定 其作为免疫原的可能性及其作用的效果。本发明可迅速确定某种微生物细胞表面的具有免 疫原性的全部蛋白质，从而达到高效、快速、经济、实用的优选免疫原的目的。本发明能够高 通量筛选具有免疫原性的疫苗候选位点，为确定作为多价疫苗靶位的基因奠定了基础，提 高了制备多价疫苗靶点的效率。由于所有微生物作为抗原免疫动物后，机体均会产生针对 其抗原的特异性抗体，这些抗体可以用来免疫沉淀实验，筛选免疫原，而且本发明不用二维 电泳分离细胞表面蛋白，极大得简化了实验步骤。故本实验的原理和方法具有普遍性，操作 步骤简单快捷，可高效用于细菌、真菌等微生物细胞表面抗原的鉴定。
[0013] 本发明进一步发展了免疫沉淀技术的应用，即建立了一种基于免疫沉淀的微生物 细胞表面抗原筛选技术，从而可以确定与微生物抗血清反应的微生物细胞表面蛋白质。由 于这一设计是基于最简单的实验技术，故不仅可以快速确定某种微生物所具有的细胞表面 抗原，还可以得知其在细胞表面的丰度和与抗体的亲和力。根据这些免疫原的细胞表面丰 度和与抗体的亲和力，确定作为多价靶位疫苗的可能性和判断其作用效果。
【附图说明】
[0014] 图1为微生物细胞表面蛋白抗原筛选的实验流程图
[0015] 图2为病原微生物副溶血弧菌VPL4-90表面蛋白抗原筛选的电泳结果。
[0016] 其中，A、副溶血弧菌VPL4-90表面蛋白抗原筛选的银染SDS-PAGE图谱，包括对照 组和实验组；B、副溶血弧菌VPL4-90表面蛋白抗原筛选的实验组考染SDS-PAGE图谱。
[0017] 图3为病原微生物拟态弧菌ATCC33653表面蛋白抗原筛选的电泳结果。
[0018] 其中，A、拟态弧菌ATCC33653表面蛋白抗原筛选的银染SDS-PAGE图谱，包括对照 组和实验组；B、拟态弧菌ATCC33653表面蛋白抗原筛选的实验组考染SDS-PAGE图谱。
【具体实施方式】
[0019] 以下实施将结合附图对本发明的工艺步骤及其突出效果作进一步说明。
[0020] 实施例1
[0021] 1、细菌培养、计数和收集：微生物采用副溶血弧菌VPL4-90,为本实验室保存菌 种。将VPL4-90接种于LB培养基，28°C摇床培养18h。培养结束后，取2mL菌液进行平板菌 落计数。其余培养液于5000rpm离心10min，收集菌体，用生理盐水洗涤菌体3次。用生理 盐水调整其浓度为IO 9CFUAiL。
[0022] 2、抗病原菌抗血清的制备：向制备的VPL4-90菌体悬液加入体积分数0. 025%甲 醒，30°C下作用4h，制成灭活病原，5000rpm转速IOmin,再用生理盐水洗漆三次，最后再用 生理盐水调整其浓度为10 9CFU/mL，注射新西兰大白兔，每只lmL，对照组注射生理盐水；每 隔一周注射一次，第四次免疫的第7天处死大白兔取血，静置；4000rpm离心10min，取出血 清，分装，_20°C保存。
[0023] 3、微生物细胞表面蛋白抗体的免疫沉淀，5mL的109CFU/mLVPL4-90PBS悬液加入 1 μ LVPL4-90菌体抗血清，5mLVm PBS悬液加入1 μ LVm菌体抗血清振荡混匀，冰浴，50rpm摇 床过夜，同时各自加阴性血清作为对照。离心收集菌体，PBS洗涤三次，各加入0. 5ml的免 疫沉淀裂解液重悬，超声破碎（300W，4s，3s，2min)，加入装有树脂和用塞子塞住的免疫沉淀 柱中，冰浴，50rpm8h。免疫沉淀柱用免疫沉淀洗涤液洗涤三次，用条件缓冲液洗涤一次，再 用洗脱液孵育5min后洗脱。
[0024] 4、SDS-PAGE电泳和银染观察：将收集到的免疫沉底复合物以及阴性对照进行 SDS-PAGE电泳，电泳结束后，用硝酸银染色，扫描，输出照片。参见图1-A，结果显示，除抗体 重链和轻链连个条带外，比较清楚的蛋白条阳性蛋白条带有8个。
[0025] 5、样品浓缩和考染质谱：收集10个实验组的免疫沉淀柱的样品，用超滤管在 5000rpm30min浓缩10倍后，上样进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后，扫描，输出照片。参见图 1-B，除抗体重链和轻链连个条带外，比较清楚的条带有8个。将与银染一致的6个条带切 出送到华大基因和上海博苑进行基质辅助激光解吸附的串联质谱分析和鉴定，鉴定结果见 表1。6个蛋白条带鉴定出6个蛋白，其中有4个为副溶血弧菌细胞表面的外膜蛋白抗原，2 个是副溶血弧菌胞内蛋白，但在一些研究中表明，从蛋白质组学中分析，一些胞内蛋白亦在 微生物细胞表面发现，其机制原理有待于深入研究。
[0026] 表1副溶血弧菌细胞表面抗原的MALDI-T0F-T0F/MS鉴定
【主权项】
1. 微生物细胞表面抗原的筛选与鉴定方法，其特征在于其步骤如下： 1) 用微生物全细胞免疫沉淀分离出细胞表面蛋白抗体：微生物细胞收集后与微生物抗 血清按体积比抗血清：微生物=1:500加入抗血清冰浴孵育，阴性血清作为对照，离心去除 抗血清细胞表面抗体外其他成份，收集微生物细胞与细胞表面抗体复合物； 2) 将分离出的微生物细胞与细胞表面抗体复合物，超声波破碎后，用蛋白A/G琼脂糖 与破碎液冰浴孵育，捕捉抗原抗体复合物，洗涤三次后，洗脱抗原抗体复合物； 3) 洗脱后的抗原抗体复合物SDS-PAGE分析，用银染观察结果，确定阳性条带，再使用 超滤管对抗原抗体复合物进行浓缩后在进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色准备进行质 谱； 4) 免疫原的定性：取出具有免疫原性的全部考染蛋白质条带，按常规质谱样品处理方 法进行样品制备，然后进行质谱和生物信息分析，以确定抗原的蛋白质种类。
2. 如权利要求1所述的微生物细胞表面抗原的筛选与鉴定方法，其特征在于所说的微 生物为细菌，真菌。
3. 如权利要求1所述的微生物细胞表面抗原的筛选与鉴定方法，其特征在于采用微生 物全细胞免疫沉淀将微生物细胞表面蛋白的抗体从抗血清中分离出来。
4. 如权利要求1所述的微生物细胞表面抗原的筛选与鉴定方法，其特征在于超声破碎 每次3s，间隔4s，超声2min。
5. 如权利要求1所述的微生物细胞表面抗原的筛选与鉴定方法，其特征在于用银染观 察确定免疫原性蛋白条带，用考马斯亮蓝染色进行质谱分析。
【专利摘要】微生物细胞表面蛋白抗原的筛选与鉴定方法，涉及一种简便、快捷筛选和鉴定微生物细胞表面蛋白抗原的方法。用微生物全细胞免疫沉淀分离出细胞表面蛋白的抗体，蛋白A/G琼脂糖捕捉抗原抗体复合物，洗脱得到抗原抗体复合物，再用SDS-PAGE分析免疫沉淀的蛋白。分析免疫原的丰度、抗体对抗原的亲和力、免疫原的定性、确定抗原的蛋白种类。建立基于免疫沉淀的蛋白质组学技术，用于高通量筛选具有免疫原性的蛋白质作为多价疫苗的候选靶位。根据免疫原的丰度和抗体对抗原的亲和力，能确定其作为疫苗蛋白的可能性。迅速确定某种微生物细胞表面具有免疫原性的蛋白，高效、快速、经济、实用。方法具有普遍性，不仅可以用于细菌，还可以用于真菌等微生物免疫原的鉴定。
【IPC分类】G01N33-68
【公开号】CN104634979
【申请号】CN201310574194
【发明人】胡忠, 袁传飞, 伦镜盛, 张设熙
【申请人】汕头大学
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2013年11月15日