一种测定药用植物中有机酸解离平衡常数的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种基于分析型反相高效液相色谱保留模型和保留时间数据高效测 定药用植物提取物复杂化合物混合体系中有机酸解离平衡常数（PKa)的方法。该方法可以 在无需获得纯品的前提下同时测定多种有机酸的解离平衡常数，适用于不易得到纯品的天 然产物中的有机酸的解离平衡常数的高效测定。
【背景技术】
[0002] 随着现代生活水平的提高，人们对健康日益重视，回归自然的呼声高涨，天然药物 在世界范围内得到了前所未有的重视和应用，其研制开发也成为了各国新药研发的热点。 药用植物提取物成分复杂，化合物种类繁多，有机酸便是其中具有多种生物活性的一类重 要物质。
[0003] 有机酸广泛存在于动植物以及微生物体内，数量众多，是一类重要的天然产物。现 有研宄表明，有机酸大多具有显著的生物活性，如抗癌、止咳平喘、抑菌、抗内毒素、抗炎、抗 氧化活性，还可以治疗血液和心血管系统疾病。它们是药用植物中重要的有效成分，但是它 们在植物中的含量一般都较低，大多不高于1%。因此，如何合理有效地制备取得这些有机 酸便成为了一个值得研宄的问题。
[0004] 有机酸是弱电解质，其固有的物性参数一一解离平衡常数决定了它们在不同的溶 液和酸碱性条件下的存在形态，如分子型亦或离子型。通过了解化合物的这一重要物性参 数，可以有效地指导化合物的提取分离过程。解离平衡常数（PKa)是溶液中具有一定离解 度的溶质的极性参数，是弱酸和弱碱性化合物的一个重要物性参数。在临床用药中，大约 有95%的药物属于微酸或微碱性。这些药物在生物体内以离子状态或者分子状态存在，而 其解离程度取决于该化合物的解离平衡常数以及体内微环境的PH值。一般而言，在生物体 内，分子型药物较离子型药物有更好的脂溶性、更易吸收。根据药物分子的解离平衡常数， 可以预测药物在体内的吸收部位和药理作用强度。对于结构非特异性药物，如局部麻醉药、 巴比妥类镇静催眠药，解离平衡常数决定了在生理状态下，药物的分子态与离子态的比例， 进而决定了药物是否能在靶位达到有效浓度。除此之外，解离平衡常数反映了药物分子酸 碱性的强弱，对于判定其对皮肤、粘膜、肌肉、内脏等是否有刺激性具有重要意义。因此，在 药物化学中，解离平衡常数是药物的一个重要物性参数。另外，解离平衡常数还可以在液相 色谱分离化合物的过程中指导分离条件的选择，在产品开发中作为最佳工艺和质量选择的 依据。
[0005] 传统的测定解离平衡常数的方法主要有PH滴定法、电位滴定法和紫外分光光度 法等。这些方法都是建立在获得了一定量的待测定化合物纯品的基础上的。然而，植物中 的化学成分复杂，各化合物的含量差异巨大，要得到一定量的单一化合物纯品并不是一件 容易的事情。因此，至今为止仍然有许多天然产物的解离平衡常数不为人们所知。由此可 见，开发一种快速、高通量、可靠的测定植物提取物复杂化合物混合体系中有机酸/碱化合 物解离平衡常数的方法显得尤为必要。
[0006] 随着近现代色谱技术的发展，其逐渐成为取代传统的解离平衡常数测定方法的新 手段。自1958年，Debska等人首次采用纸层析法测定了白屈菜碱和原鸦片碱的pKb值，De Wit、Xie和Dyrssen、Cleveland分别采用离子交换色谱、气相色谱、毛细管电泳法测定了简 单有机酸、生物碱的解离平衡常数。1977年，Horvdth的研宄小组在以疏水介质为填料的高 效液相色谱柱上，采用有机相等度洗脱的方法测定了人工混合样品中7种有机酸：安息香 酸、肉桂酸、2-甲基安息香酸、2-氯肉桂酸、4-溴苯甲酸、4-氯肉桂酸和2, 6-二氯肉桂酸的 PKa值。这是反相高效液相色谱法首次用于化合物解离平衡常数的测定。随着反相高效液相 色谱技术的进一步发展，有机相梯度洗脱、PH梯度洗脱和有机相/pH双梯度洗脱等方法逐 渐用于同时分析组成和结构更为复杂的人工混合样品中有机酸碱的解离平衡常数的测定， 使得反相高效液相色谱法在测定化合物解离平衡常数上进一步具备了快速、高通量和高精 度的优点。
[0007] 不过，现有的利用反相高效液相色谱法测定化合物混合体系中各成分的解离平衡 常数的研宄主要还停留在对人工混合的已知有机酸或生物碱类化合物样品解离平衡常数 的测定阶段，混合物体系相对简单可控。然而，天然产物提取物中的有机酸类化合物不仅在 含量和种类上差别巨大，而且混合物体系中往往还有大量其他种类的化合物与之共存。因 此，如何在繁杂的化学成分混合物体系中判定有机酸的类物质，让它们逐一实现理想的色 谱分离，并且在此基础上同时平行地测定多种有机酸的解离平衡常数还是一个亟待研宄的 问题。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是针对先有技术的不足，提供一种测定药用植物中有机酸解离平衡 常数的方法。
[0009] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种测定药用植物中有机酸解离平衡 常数的方法，该方法包括如下步骤：
[0010] (1)通过水提醇沉的方法对药用植物中有机酸类物质进行粗提，得到粗提物。
[0011] (2)通过反相液相色谱法对步骤1得到的粗提物进行色谱分离，判定其中的有机 酸类物质。
[0012] (3)鉴定步骤2中被判定为有机酸类物质的各物质的化学结构；
[0013] (4)通过反相液相色谱法对步骤1得到的粗提物在不同的色谱分离条件下进行色 谱分离，采集步骤3鉴定为有机酸类物质的各物质在不同色谱分离条件下的保留时间&数 值；
[0014] (5)根据步骤4的采集得到的一系列保留时间tK数值，通过公式1拟合计算各有 机酸类物质的PKa值：
【主权项】
1. 一种测定药用植物中有机酸解离平衡常数的方法，其特征在于，该方法包括如下步 骤： (1) 通过水提醇沉的方法对药用植物中有机酸类物质进行粗提，得到粗提物。 (2) 通过反相液相色谱法对步骤1得到的粗提物进行色谱分离，判定其中的有机酸类 物质。 (3) 鉴定步骤2中被判定为有机酸类物质的各物质的化学结构； (4) 通过反相液相色谱法对步骤1得到的粗提物在不同的色谱分离条件下进行色谱分 离，采集步骤3鉴定为有机酸类物质的各物质在不同色谱分离条件下的保留时间t K数值； (5) 根据步骤4的采集得到的一系列保留时间tK数值，通过公式1拟合计算各有机酸 类物质的PKa值：
其中，t为时间，h为柱子死体积对应的死时间，t κ为步骤4采集到的各有机酸类物质 在不同色谱分离条件下的保留时间； 针对一元酸，
其中，pH(t)为流动相在时刻t时的pH值；X是指以水相标准溶液为参照溶液，在 水相和有机相混合前测定的水相缓冲液中的pKa值，α是斜率参数；7#,,(1)是有机酸的一 级解离平衡常数；a -级解离离子的斜率参数；是t时刻流动相中有机相的百分含 量；kw(l和kwl分别表示弱酸分子和酸根离子在流动相为纯水时的保留因子；SdP S1分别表 示弱酸分子和酸根离子与色谱系统相关的常数；是指t时刻，以水相标准溶液为参 照溶液，在水相缓冲液和有机相的混合后的流动相中测定的pH值； 针对多元酸，通过公式3~5拟合计算多元有机酸的pKa值：
式中，η为有机酸的元数（一元酸，η = 1 ;二元酸，η = 2......)，r = 1，2,......，n ;kQ是 未解离的弱酸分子的保留因子，& =U(rSi'w，匕是弱酸分子解离后的各级离子的保留 因子，<=U()_Vn' 是各级离子的解离平衡常数，[H+]为氢离子浓度。
【专利摘要】本发明涉及一种基于分析型反相高效液相色谱保留模型和保留时间数据高效测定药用植物提取物复杂化合物混合体系中有机酸解离平衡常数（pKa）的方法。该方法是针对药用植物提取物混合体系，将化合物分离（separation）、结构鉴定（structure identification）以及物性参数pKa的测定（pKa determination）集成在一个过程中实现的方法。具体是由富含有机酸类物质的提取、有机酸类物质的判定、有机酸类物质的结构鉴定、有机酸类物质的保留时间采集以及有机酸类物质的pKa拟合计算这五个步骤组成。该方法具有良好的推广性，可以成为药用植物资源开发利用的有力辅助工具。
【IPC分类】G01N30-02
【公开号】CN104655760
【申请号】CN201510088517
【发明人】卢丹
【申请人】浙江大学
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2015年2月26日