吸附己烯雌酚类药物的免疫亲和搅拌棒及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于食品安全检测技术领域，涉及吸附己烯雌酚类药物免疫亲和搅拌棒及 其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 随着我国经济的发展，人们生活水平的日益提高，对各种动物源性食品的需求量 也逐渐增大，食品安全问题自然成为大家关注的焦点。近年来关于雌激素残留引起的对人 身体健康造成危害的报道屡见不鲜，相关食品安全部门也致力于检测方法的研究。由于生 物样品的成分复杂、雌激素与样品成分之间易互相结合和残留浓度低等均给样品中药物的 提取净化带来了很大的困难，因此分析方法的选择性和灵敏度直接决定了检测的成功与 否。
[0003] 免疫亲和搅拌棒（Imunoaffinity stir bar)是免疫亲和固相微萃取 (Immunoaffinity solid phase microextraction, Immunoaffinity SPME) 的一种 装置形式，将固相微萃取（Solid phase microextraction, SPME)与免疫亲和色谱 (IAC, immunoaff inity chromatography)相结合，既具有SPME易于操作、使用溶剂少和节 省时间的优点，又有免疫亲和色谱高度选择性和高亲和性的特点，使SPME在兽药残留分析 中，选择性、亲和性和灵敏度方面得到了很大的提升。Immunoaffinity stir bar常被用作 样品的萃取，尤其适用于复杂基质中痕量分析物的提取，与多种检测手段结合使用进行分 析测定，具有广阔的应用前景。
[0004] 二苯乙烯类化合物主要包括己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚和丁烯雌酚，四种药物 具有相似的药理作用。己烯雌酚（Diethylestilbestrol, DES)是人工合成的一种雌性激 素，是二苯乙烯类化合物中的代表药物。1940年-1971年，当时美国曾用DES来防止流产和 临床治疗，之后为增加动物体重而被非法用作畜禽生长促进剂。DES在动物源性食品中即使 残留量微小都会使人类的正常机能受到潜在威胁。由于DES的致畸、致突变和致癌性质，在 大多数国家已经被禁止使用。然而因为利益的驱使，目前己烯雌酚的滥用现象仍十分严重。
[0005] 己烯雌酚主要用于动物的催情、胎衣不下、排出死胎还可以治疗子宫炎等，如治疗 母猪乏情不孕和诱导母兔发情等。由于己烯雌酚可以促进动物蛋白质合成、减少脂肪提高 饲料利用率等优点，目前已经被养殖业广泛使用。己烯雌酚为亲脂物质，不能像多数天然的 雌激素那样被机体肝脏分解，导致其容易在动物体内残留，人食用了此类动物源性食品后 也会在体内富积而导致相关疾病的发生，危害人体健康。目前已知的己烯雌酚的不良反应 主要有：孕妇服用此药，其女性后代在青春期后宫颈和阴道的腺病及腺癌发生率升高，男性 后代生殖道异常和精子异常发生率也增加。其他参见雌激素。可有恶心，呕吐，食欲不振， 头痛，长期使用可使子宫内膜增生过度而致子宫出血和肥大。在亚洲方面，韩国、日本等国 家也早有规定，激素类物质禁止在国内养殖业中使用，含有雌激素的动物及动物源性食品 国家禁止进口。
[0006]目前用于DES检测的主要技术有：气相色谱法（GC)、液相色谱法、气相色谱-质谱 联用分析法（GC/MS )、液相色谱-质谱联用分析法（LC/MS )、薄层色谱法（TLC )、放射免疫分 析（RIA)和酶联免疫吸附分析（ELISA)等方法。由于样品基质成分复杂，在萃取过程中很 容易将待测药物与其他性质相似的成分一起提取出来，给检测造成困难。因此，在检测之前 "净化"工作是必不可少的，通常采用净化方法主要有液-液萃取（LLE)和固相萃取（SPE)。 LLE过程需要使用大量有机溶剂，而一些有机溶剂性质稳定，不易降解，对环境造成污染，而 且操作繁琐。SPE操作简单、省时，但特异性不强是其主要的缺点。Immunoaffinity SPME 技术首次于2001年被提出，用Immunoaffinity stir bar净化二苯乙烯类化合物目前还尚 未见报道，更无商品化的Immunoaffinity stir bar出售。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种吸附二苯乙烯类化合物的免疫亲和搅拌棒及其制备方 法。
[0008] 为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容： 一种吸附己烯雌酚类药物的免疫亲和搅拌棒，其特征在于是由固相载体和与其偶联的 己烯雌酚鼠单克隆抗体组成，其中固相载体与偶联的己烯雌酚DES-6B4鼠单克隆抗体的偶 联长度与重量比为1 cm : 2 mg;所述的固相载体为10 cmX4 mm玻璃棒，偶联抗体的有效 长度为2. 5 cm。所述的单克隆杂交瘤细胞株DES-6B4注入小鼠腹腔，纯化小鼠腹水得到。
[0009] 所述DES-6B4中DES代表己烯雌酚、6代表细胞融合过程使用第6块96孔板，B4 中的字母和数字分别代表96孔板的横纵编号，96孔板中1-12为横向编号，A-H为纵向编 号。B4代表融合后的杂交瘤细胞株在96孔板中的位置。
[0010] 本发明进一步公开了吸附己烯雌酚类药物的免疫亲和搅拌棒的制备方法，其特征 在于按如下的步骤进行： (1)固相载体表面的处理：将玻璃棒下半部分浸入到双氧水和浓硫酸混合溶液中1 h， 依次用超纯水、无水乙醇和超纯水彻底冲洗；其中双氧水：浓硫酸的体积比为30:70 ;浓硫 酸进行清洁和形成粗糙表面。
[0011] (2)硅烷化反应：将玻璃棒下半部分浸入ATPES乙醇溶液中，其中ATPES:超纯水： 无水乙醇的体积比为5:5:90,室温下反应24 h; (3) 氨基的固定：超纯水和纯乙醇依次冲洗玻璃棒，放入真空干燥箱中80°C并通入氮 气氮吹15h ; (4) 玻璃棒的活化：玻璃棒浸入2. 5% (w/w)的戊二醛PBS (磷酸盐缓冲液，即1L中含 有 0.2 g KH2P04,0.2 g KC1，2.9 g Na2HP04.12H20,8.8 g NaCl 的溶液。）溶液中 5 h，之后 用超纯水冲洗； (5) 偶联反应：玻璃棒浸入单克隆杂交瘤细胞株DES-6B4分泌的单克隆抗体PBS溶液， 0? 5 mg/mL 抗体 +0? 05 mg/mL NaN3* 4 °C 轻微揽祥 24 h; (6) 将玻璃棒上未反应的戊二醛用乙醇胺水溶液（0. 3 M)去活化1 h ; (7) 稳固共价键：置于PBS+0.05 mg/mL NaN3+0.2 mg/mL恥0他113混合溶液中4 °C反应 48 h，将酰亚胺还原为胺使共价键结合更加牢固；所述固相载体为高硼硅玻璃棒、高纯硅玻 璃棒或石英玻璃棒。
[0012] 本发明所述的单克隆抗体指的是对己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚和丁烯雌酚四 种二苯乙烯类化合物具有特异反应的单克隆杂交瘤细胞株DES-6B4分泌的单克隆抗体。
[0013] 本发明更进一步公开了吸附己烯雌酚类药物的免疫亲和搅拌棒在制备吸附4种 二苯乙烯类化合物方面的应用。
[0014] 本发明的方法对组分净化的同时还可提供定性信息。本发明的提纯方法结合色谱 法可以使样品中的待测组分得到有效分离和浓缩，便于己烯雌酚、乙烷雌酚、双烯雌酚和丁 烯雌酚的含量检测，弥补了单纯免疫测定技术直接测定样本的信息量太少、定量准确差，或 理化方法选择性低等不足，体现了免疫学技术和常规理化技术在分析机制的互补性。
[0015]
【主权项】
1. 一种吸附己烯雌酚类药物的免疫亲和搅拌棒，其特征在于是由固相载体和与其偶联 的己烯雌酚鼠单克隆抗体组成，其中固相载体与偶联的己烯雌酚DES-6B4鼠单克隆抗体的 偶联长度与重量比为I cm : 2 mg;所述的固相载体为10 cmX4 mm玻璃棒，偶联抗体的有 效长度为2. 5cm，所述的单克隆杂交瘤细胞株DES-6B4注入小鼠腹腔，纯化小鼠腹水得到。
2. 权利要求1所述吸附己烯雌酚类药物的免疫亲和搅拌棒的制备方法，其特征在于按 如下的步骤进行： (1) 固相载体表面的处理：将玻璃棒下半部分浸入到双氧水和浓硫酸混合溶液中lh， 依次用超纯水、无水乙醇和超纯水彻底冲洗；其中双氧水：浓硫酸的体积比为30:70 ; (2) 硅烷化反应：将玻璃棒下半部分浸入ATPES乙醇溶液中，其中ATPES:超纯水：无水 乙醇的体积比为5:5:90,室温下反应24 h; (3) 氨基的固定：超纯水和纯乙醇依次冲洗玻璃棒，放入真空干燥箱中80°C并通入氮 气氮吹15h; (4) 玻璃棒的活化：玻璃棒浸入2. 5% (w/w)的戊二醛PBS溶液中5h，之后用超纯水冲 洗； (5)偶联反应：玻璃棒浸入单克隆杂交瘤细胞株DES-6B4分泌的单克隆抗体PBS溶液 (0?5mg/mL抗体 +0?05 mg/mL NaN3)中4°C轻微揽祥24h; (6) 将玻璃棒上未反应的戊二醛用乙醇胺水溶液（0. 3M)去活化Ih; (7) 稳固共价键：置于PBS+0. 05mg/mLNaN3+0.2mg/mL恥0他113混合溶液中4°C反应 48h，将酰亚胺还原为胺使共价键结合更加牢固；所述固相载体为高硼硅玻璃棒、高纯硅玻 璃棒或石英玻璃棒。
3. 权利要求2所述吸附己烯雌酚类药物的免疫亲和搅拌棒的制备方法，其特征在于所 述的固相载体表面使用体积比30:70的双氧水：浓硫酸进行清洁和形成粗糙表面。
4. 权利要求2所述吸附己烯雌酚类药物的免疫亲和搅拌棒的制备方法，其特征在于所 述的单克隆抗体指的是对己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚和丁烯雌酚四种二苯乙烯类化合 物具有特异反应的单克隆杂交瘤细胞株DES-6B4分泌的单克隆抗体。
5. 权利要求1所述吸附己烯雌酚类药物的免疫亲和搅拌棒在制备吸附4种二苯乙烯类 化合物方面的应用；所述的4种二苯乙烯类化合物指的是：己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚 和丁烯雌酚。
【专利摘要】本发明公开了一种吸附己烯雌酚类药物的免疫亲和搅拌棒及其制备方法与应用，它是由固相载体和与其偶联的己烯雌酚鼠单克隆抗体组成，其中固相载体与偶联的己烯雌酚DES-6B4鼠单克隆抗体的偶联长度与重量比为1cm:2mg。本发明的提取方法结合色谱法可以使样品中的待测组分得到有效分离和浓缩，便于二苯乙烯类化合物含量的检测，弥补了单纯免疫测定技术直接测定样本的信息量太少、定量准确差，或理化方法选择性低等不足，体现了免疫学技术和常规理化技术在分析机制的互补性。
【IPC分类】G01N33-577
【公开号】CN104698179
【申请号】CN201510117235
【发明人】李存, 姚凯, 张伟, 杨琳燕, 彭涛, 赵思俊, 丁巧玲, 何建丽
【申请人】天津农学院
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2015年3月18日