一种检测淀粉样多肽聚集及其聚集抑制剂评估的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及淀粉样多肽，特指一种检测淀粉样多肽聚集及其聚集抑制剂评估的方 法。
【背景技术】
[0002] 目前已知蛋白质及多肽的异常集聚和40多种疾病相关，如神经退行性疾病阿尔 茨海默氏病和帕金森综合症等；淀粉样蛋白质（多肽）的寡聚体及其集聚所形成的斑块被认 为是这些疾病的主要病因之一；基础医学以淀粉样蛋白为靶点开始进行研宄，发展药物减 少淀粉样多肽的产生和降低淀粉样多肽的集聚及毒性；目前在科研和医药产业中，针对疾 病的相关靶多肽和蛋白的特效药物开发是十分重要的研宄领域，具有极其重要的研宄价值 和经济价值。
[0003] 医药学关于药物研发的严肃性要求新发现的抑制剂在进入临床使用前需要进行 严格的使用效果及安全性的评价，主要是基于生物细胞毒理性实验和动物模型实验，这些 评价流程非常严格和繁琐复杂；阿尔茨海默氏病的药物研宄通常需要培养大批量细胞供实 验使用并建立特殊的动物模型，例如人神经细胞瘤细胞系SK-N-SH和通过分子生物学方 式诱导产生淀粉样多肽在动物脑内来构建阿尔茨海默氏病的动物模型，而实验结果读取需 要使用酶联免疫吸附测定法和蛋白质印迹法获得，虽然实验结果相对可靠，但实验周期很 长而且成本很高，很大程度上减缓了对原有的和新开发的抑制剂筛选和评价进程；由于生 物体内影响因素很多，即使细胞和动物实验筛选到有效果的抑制剂，也难以最终确定抑制 剂的作用机制；相比之下，将候选药物在体外进行初步筛选和评价，可以节约大量的时间和 资源。由于淀粉样多肽的聚集与其毒性密切相关，所以可以通过检测淀粉样多肽的聚集，以 及设计分子抑制淀粉样多肽聚集来初步评价淀粉样多肽以及其聚集抑制剂效果；目前，多 肽聚集抑制剂的体外筛选已经取得了一些研宄进展，如2006年基于绿色荧光融合蛋白技 术，Kim等人通过荧光分析技术筛选了三嗪类衍生物化合物分子库，发现了新的抑制剂分 子；2011年Mook-Jung研宄组利用金纳米粒子开展了淀粉样多肽聚集抑制剂的筛选和评价 工作，取得了一定的成果；在2013年，国内的周飞艨课题组研宄利用二茂铁标记的荧光淀 粉样多肽结合高效液相色谱（HPLC)筛选淀粉样多肽的聚集抑制剂；但目前已知在体外筛 选多肽聚集抑制剂的各种方法中，大多采取荧光探针技术，是否可以开发一种免标记方法， 测定淀粉样多肽聚集状态，并对其相关的聚集抑制剂进行筛选评价，是研宄者一直关注的 问题。
[0004] 石英晶体微天平（quartz crystal microbalance，QCM)是一种非常灵敏的质量检 测仪器，理论上可以检测到相当于单分子层或原子层的几分之一的质量变化；在科学研宄 上，QCM早期主要用于检测真空和气态环境下的表面质量变化，而现在已逐渐扩展到液态环 境下检测，尤其是在生物学检测领域，国内的QCM研宄发展十分迅速；计剑、刘光明等人和 杜滨阳研宄组分别利用QCM研宄表面多层膜的组装制备和高分子薄膜；马宏伟研宄组应用 QCM研宄了茎环ssDNA开环和嗜酸性古生菌细胞膜耐酸的机理等；张广照课题组利用QCM 研宄磷脂膜表面和疏水基团的相互作用和温敏高分子刷。
[0005] 由于石英晶体微天平对于表面质量增加非常灵敏，可以用来研宄淀粉样多肽在表 面上的实时生长和集聚行为，无需荧光标记，这和传统的方法相比具有优势：传统方法硫磺 素染色（Thioflavin T binding，ThT)通常需要几个小时甚至更长时间才能测定多肽的集 聚行为，QCM方法在数分钟内就能得到结果，同时QCM作为一种无标记方法也能避免如荧 光检测法带来的繁琐操作和毒性；基于QCM可以开展较大规模的多肽相关药物评价和筛 选，为药物的细胞及动物实验创造较好基础，大大加快相关药物的研发。
[0006] QCM检测液相条件固体表面质量的变化 石英晶体微天平（Quartz crystal microbalance，QCM)是一种利用石英晶体压电效应 检测表面质量变化的仪器；当外部施加一个电场时，晶体会产生机械振动，当石英晶体的厚 度为电极的机械振荡波半波长奇数倍时就会发生共振，关于真空中其共振频率变化（Δ/η )与面均质量变化的关系由Sauerbrey方程可以得到。
【主权项】
1. 一种检测淀粉样多肽聚集及其聚集抑制剂评估的方法，其特征在于具体步骤如下： 将淀粉样多肽充分溶解分散在六氟异丙醇中得到溶液A，对溶液A进行干燥，干燥后的 淀粉样多肽使用去离子水进行溶解，配置成浓度为250-1000yg/mL的淀粉样多肽水溶液， 称为溶液B; 得到QCM共振频率基线后，取上述溶液B溶液通入石英晶体微天平传感器中，随着多肽 分子在芯片表面的吸附集聚，QCM频率信号和能量耗散将发生改变，检测到的信号作为抑制 剂组的阳性对照B; 将浓度为10-200yg/mL的聚集抑制剂的水溶液称为溶液C，在得到QCM共振频率基线 后，将溶液C通入QCM传感器得到的QCM频率和能量耗散信号作为聚集抑制剂评价的阴性 对照C使用； 在得到QCM共振频率基线后，将待评价的淀粉样多肽水溶液和抑制剂水溶液混合得到 混合溶液D，混合溶液D中淀粉样多肽的浓度与前述阳性对照--溶液B的浓度一致，抑制 剂分子的浓度与阴性对照一一溶液C的浓度一致；将混合液D所得到的QCM能量频率信号 与阳性对照B及阴性对照C进行比较，QCM频率信号下降的数值越大，证明在表面上集聚的 多肽越多；如果：阴性对照组的频率变化〉抑制剂组的频率变化〉阳性对照组的频率变化， 说明该抑制剂对于多肽集聚具有抑制效果。
2. 如权利要求1所述的一种检测淀粉样多肽聚集及其聚集抑制剂评估的方法，其特征 在于将淀粉样多肽充分溶解分散在六氟异丙醇中得到溶液A指：每Iml六氟异丙醇中加入 Img淀粉样多肽，晃动溶液A使多肽干粉能够充分溶解分散，得到浓度为lmg/mL多肽溶液 A0
3. 如权利要求2所述的一种检测淀粉样多肽聚集及其聚集抑制剂评估的方法，其特征 在于：晃动溶液A以使之充分溶解的时间为24h。
4. 如权利要求1所述的一种检测淀粉样多肽聚集及其聚集抑制剂评估的方法，其特征 在于所述得到QCM共振频率基线指：将去离子水通入QCM传感器，待水进入传感器使QCM 频率曲线达到稳定状态后即为基线状态。
5. 对如权利要求1所述方法验证的方法，其特征在于：采用原子力显微镜检测芯片表 面形貌验证，在表面进行完QCM试验后，将芯片干燥后，对抑制剂组和对照组芯片进行AFM 形貌观测，验证QCM结果；如果AFM图中有大量多肽纤维出现，则证明多肽抑制效果差，反 之，如果所得AFM图很少见到多肽的纤维，则证明多肽抑制剂作用很强。
【专利摘要】本发明涉及淀粉样多肽，特指一种检测淀粉样多肽聚集及其聚集抑制剂评估的方法。该方法利用石英晶体微天平(QCM)能检测质量微小变化的优势，将淀粉样蛋白（多肽）及其淀粉样蛋白（多肽）与聚集抑制剂分子混合溶液在石英晶体微天平的芯片表面上孵育，经过一定时间后，淀粉样蛋白（多肽）将在芯片表面集聚，引发石英晶体微天平信号，由石英晶体微天平产生信号强弱可判断多肽聚集抑制剂分子的抑制作用，另外结合原子力显微镜（AFM）表征可以对QCM结果进行确认，综合两种测量方法综合评估淀粉样多肽抑制剂效果。<b/>
【IPC分类】G01N5-00, G01N1-28, G01Q60-24
【公开号】CN104729946
【申请号】CN201410781868
【发明人】汪杰, 刘磊, 董明东
【申请人】江苏大学
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2014年12月18日