检测外周血单核细胞中HBcAg的表达的方法
【技术领域】
[0001] 本申请涉及一种检测外周血单核细胞中HBcAg表达及分布的方法。
【背景技术】
[0002] 乙型肝炎病毒（HBV)核心抗原（HBcAg)存在于完整的Dane颗粒的核心内，该核心 是HBV的结构蛋白即病毒核壳蛋白，具有重要的生物学特征和临床病理意义。既往研宄证 明血HBcAg阳性可以提供肝内HBV合成的信息，是病毒存在的直接标志。HBcAg感染的肝细 胞是细胞免疫效应攻击的靶细胞，肝细胞溶解后HBcAg可以直接释放入血，故能直接反映 肝细胞损害和病情进展的阶段。
【发明内容】
[0003] 本发明提供一种新的检测HBcAg表达及分布的方法。
[0004] 本发明提供一种检测外周血单核细胞中HBcAg表达及分布的方法，其使用共聚焦 显微镜进行检测。
[0005] 所述方法包括如下步骤：a)提取外周血单核细胞；b)将外周血单核细胞进行免疫 荧光抗体包被；c)利用激光共聚焦显微镜检测。
[0006] 所述步骤C中，建立二条通道，分别为一条用于寻找细胞的DAPI通道和一条用于 观察HBcAg绿色荧光的GFP通道。
[0007] -种使用共聚焦显微镜检测外周血单核细胞中HBcAg分布的方法。
[0008] 本发明的有益效果是：激光共聚焦显微镜可以动态监测外周血单核细胞（PBMC) 中HBcAg表达水平及分布的变化，从而评估HBV DNA复制水平，能够应用在慢性乙型肝炎抗 病毒治疗疗效及患者免疫状态的研宄上。
【附图说明】
[0009] 图1是本实施方式利用Spearman's分析第一组所有血和PBMC标本中HBV DNA表 达水平相关性的结果图；
[0010] 图2是在63X3放大倍数下，PBMC中的HBcAg阳性表达图，其中A为抗乙型肝炎 核心抗原的抗体；B为DEPI，C为前两图叠加效果；
[0011] 图3是在63X3放大倍数下，PBMC中的HBcAg阴性表达图，其中A为抗乙型肝炎 核心抗原的抗体；B为DEPI，C为前两图叠加效果；
[0012] 图4是在63X放大倍数下计数HBcAg表达阳性的PBMC图，其中A为抗乙型肝炎 核心抗原的抗体；B为DEPI，C为前两图叠加效果；
[0013] 图5是利用Spearman' s分析阳性PBMC百分比与PBMC中HBV DNA水平相关性的 结果图。
【具体实施方式】
[0014] 下面通过【具体实施方式】结合附图对本发明作进一步详细说明。
[0015] -、患者与分组
[0016] 该实验纳入的患者为北京大学深圳医院感染科门诊及住院部确诊的慢性乙型病 毒性肝炎患者。健康对照组成员为该院医务工作者，血清中HBsAg与HBcAb均阴性。所有 受试者血中HIV、HCV、HDV抗体阴性。
[0017] 第一组：25个未抗病毒治疗的慢乙肝患者（包括免疫清除、免疫耐受及HBV或 HBsAg携带等所有免疫阶段的患者，见表1);
[0018] 第二组：12个干扰素治疗疗程1年后血病毒转阴的慢乙肝患者；
[0019] 第三组：3个健康患者。
[0020] 二、实验方法：
[0021] 1 :外周血单核细胞（PBMC)提取：抽取受试者外周血4毫升，在4小时内通过梯度 离心法获得细胞，使用PBS洗涤3次，随后悬浮于500ulPBS中存于4°C冰箱。
[0022] 2 :外周血单核细胞免疫荧光方法
[0023] 1)涂片：将提取的细胞打勾，用枪转移适量至PLL处理好的载玻片上，用枪头平着 推开液滴，铺平。自然风干（时间约15~20分钟）。
[0024] 2)多聚甲醛固定30min ;
[0025] 3) PBS (PH7. 4)浸洗 3 次，每次 3min ;
[0026] 4) 0· 3 % TritonX-lOOPBS，室温孵育 30min (配方：IOxPBS 稀释成 lxPBS，加入 0. 3% TritonX-100)；
[0027] 5) PBS (PH7. 4)浸洗 3 次，每次 3min ;
[0028] 6)去电荷试剂4滴孵育30分钟，PBS浸洗1次5min ;
[0029] 7)每块标本滴加50 μ 1稀释后的一抗体（购买于Millipore公司，稀释倍数1 : 100)，4°C孵育 16h ;
[0030] 8) PBST 浸洗 5 次，每次 5min ;
[0031] 9)每张片滴加50 μ 1稀释后的焚光二抗（购买于Invitrogen公司，按照1:200与 PBST进行稀释，PBST配制：0. 2% Tween-20加入到PBST中）避光孵育40min，PBS洗2min ;
[0032] 10) PBST 浸洗 3 次，每次 IOmin ;
[0033] 11)每张片滴加50 μ I DAPI，室温放置3min ;
[0034] 12) PBST 浸洗 5 次，每次 5min ;
[0035] 13)使用滤纸吸除明显水分，使用抗荧光淬灭剂（20 μ 1，避免过多）进行封片，避 光4°C保存。
[0036] 3.激光共聚焦
[0037] 将激光输出功率调节到30%，打开系列扫描通道，建立2条通道，分别为1通道 DAPI，颜色较亮，便于寻找细胞；2通道GFP，用于观察HBcAg绿色荧光，图像叠加20层。拍 片步骤：将载玻片倒置固定于显微镜上，从低倍镜开始用DAPI寻找细胞，将细胞调至视野 中央，使用63x前降低镜头调至63x，取下载玻片在镜头上涂专用油，再固定载玻片，调焦。
[0038] 4.统计学：秩和检验，Spearman rank correlation. Ρ〈0· 05为具有统计学意义。 所有的统计结果使用SPSS 13. 0统计软件。
[0039] 5.结果：
[0040] 1)检测第一组血与PBMC中HBV DNA表达量
[0041] 第一组中20个患者血HBV DNA阳性，其中17个患者PBMC标本HBV DNA阳性 (85% )。3个PBMCHBVDNA阴性标本来自于血HBeAg阴性患者（表1)。PBMC HBV DNA阳性 患者中，对于 HBV DNA 表达水平，血 3. 26 X 106IU/ml (范围 L 06 X IO3到 L 27 X 10 8IU/ml)， PBMC3. 38X 103IU/yg(范围 I. 52X 102到 I. 47X 105IU/yg)。血HBeAg 阳性患者血HBV DNA 表达量（11 = 9，中位数4.61\107叨/1111，范围1.36\106到1.27\108几/1111)明显高于血 HBeAg 阴性患者（η = 8,中位数 3. 88X 104,范围 L 06X IO3到 5. 32 X 10 6IU/ml ;Ρ〈0· 001)。 相对于HBeAg阳性患者（中位数2. 10 X 104,范围1.88 X IO3到1.47 XlO5)，HBeAg阴性患者 PBMC HBV DNA表达量显著下降（中位数 I. 13Χ103,范围 I. 52Χ102到4· 66Χ103;Ρ〈0· 001)。
[0042] 表1.第一组患者情况
[0043]
【主权项】
1. 一种检测外周血单核细胞中HBcAg的表达的方法，其特征在于，使用共聚焦显微镜 进行检测。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤： a) 提取外周血单核细胞； b) 将外周血单核细胞免疫荧光； c) 利用激光共聚焦显微镜检测。
3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤c中，建立两条通道，分别为一条用 于寻找细胞的DAPI通道和一条用于观察HBcAg绿色荧光的GFP通道。
4. 一种使用共聚焦显微镜检测外周血单核细胞中HBcAg的分布的方法。
【专利摘要】本发明公开了一种检测外周血单核细胞中HBcAg的表达的方法，其使用共聚焦显微镜进行检测。激光共聚焦显微镜可以检测外周血PBMC中HBcAg表达及分布，从而评估HBV DNA复制水平，能够应用在慢性乙型肝炎抗病毒治疗疗效及患者免疫状态的研究上。
【IPC分类】G01N21-64, G01N33-68
【公开号】CN104777309
【申请号】CN201410840073
【发明人】彭雁忠, 熊晓佳, 童新灯, 胡国信, 罗晓斌, 李建新
【申请人】北京大学深圳医院
【公开日】2015年7月15日
【申请日】2014年12月30日