动物血清中次野鸢尾黄素含量的测定方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种使用高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS)测定动物血清中 次野鸢尾黄素含量的方法，属于药物分析领域。
【背景技术】
[0002] 射干是鸢尾科射干属植物射干的干燥根茎，为常用药材，具有清热解毒、利咽祛痰 的功效，临床主要用于咽喉疼痛、痰咳气喘等症。次野鸢尾黄素是射干中重要的异黄酮类成 分之一，也是药典中评价射干药材质量的标示性成分。目前，次野鸢尾黄素的含量测定多见 于体外测定，而在动物体内血药浓度的检测方法尚未见报道。近年来，越来越多的研宄表明 射干中次野鸢尾黄素等异黄酮类物质具有多种药理作用，如抗病毒、抗氧化、抗肿瘤及抗炎 等活性，而次野鸢尾黄素在动物体内的吸收、分布、代谢及排泄过程有待进一步研宄，因此， 次野鸢尾黄素在血清中的含量测定方法亟需研宄。
[0003] 液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS)联用技术是二十世纪九十年的发展起来的一 门综合分析技术，LC的高分离效能与MS的高灵敏度、高选择性使其成为当代最重要的分离 和鉴定分析方法之一，同时近年来也成为药物研宄中最可靠实用的分析手段。该分析技术 需样量少、检测限低，尤其适用于药物在机体代谢等因素的作用下所产生的分解物或代谢 物的结构研宄和量的变化。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供了 一种方便快捷、准确的检测 动物血清中次野鸢尾黄素的含量的方法。
[0005] 本发明的目的通过以下技术方案来具体实现：
[0006] -种动物血清中次野鸢尾黄素含量的测定方法，将高效液相色谱-质谱联用技术 应用于动物血清中次野鸢尾黄素的含量测定，以山奈酚为内标，测定动物血清中次野鸢尾 黄素的含量。
[0007] 作为优选方案，上述的动物血清中次野鸢尾黄素含量的测定方法，具体步骤如 下：
[0008] 1)标准品溶液及内标液的配制
[0009] 精密称取次野鸢尾黄素标准品适量，用甲醇溶解并定容得到次野鸢尾黄素标准品 溶液；精密称取山奈酚适量，用甲醇溶解并定容得到内标溶液；
[0010] 2)标准血清溶液的制备
[0011] 向动物空白血清中加入次野鸢尾黄素标准品溶液、内标溶液，涡旋混合，加NaCl， 涡旋混匀，加乙酸乙酯，充分涡旋混匀，离心分离有机层，于40°C水浴中氮气吹干，加超纯水 溶解残渣，过微孔滤膜，得标准血清溶液；
[0012] 3)供试品溶液的制备
[0013] 取给药后的动物血清，加入内标溶液，涡旋混合，加入NaCl，涡旋混匀，加乙酸乙 酯，充分涡旋混匀，离心分离有机层，于40°C水浴中氮气吹干，加超纯水溶解残渣，过微孔滤 膜，得供试品溶液；
[0014] 4)测定
[0015] 分别吸取标准血清溶液和供试品溶液各2 y 1，用微孔滤膜过滤后进HPLC-MS/MS 分析。
[0016] 进一步优选的，所述步骤2)中，空白血清：次野鸢尾黄素标准品溶液：内标溶液： NaCl :乙酸乙酯为 0? 5ml :10 y L :10 y L :0? lg :2mL。
[0017] 进一步优选的，所述步骤3)中，空白血清：内标溶液：NaCl :乙酸乙酯为0.5ml : 10 u L :0. lg :2mL。
[0018] 进一步优选的，所述微孔滤膜有孔径为0. 22 ym。
[0019] 进一步优选的，所述步骤4)中，测定条件为：
[0020] 色谱条件：C18反相色谱柱；流动相：乙腈和0. 1%甲酸水溶液，二元梯度洗脱；柱 温30°C ;进样体积为2uL ;
[0021] 色谱条件：采用电喷雾电离源；毛细管电压为4kv ;雾化温度：350°C ;雾化气： 50kPa ;干燥气体流速：10L ? mirT1;碰撞能量：48v ;扫描方式为多反应监测。
[0022] 所述梯度洗脱的程序优选为：0min- 2min- 6min-lOmin- 15min、乙腈15% -25%- 40%- 80%- 15% ;流速为 0? 4mL?mirT1。
[0023] 进一步优选的，所述步骤4)中，测定后，根据得到的总离子流图和质谱图，测定峰 面积，以次野鸢尾黄素和内标的峰面积比为Y轴对血清中次野鸢尾黄素浓度为X轴进行线 性回归，得线性关系和回归方程，计算待测物浓度。
[0024] 进一步优选的，所述步骤1)，具体为：精密称取次野鸢尾黄素标准品适量，用甲醇 溶解并定容得到〇. 1 U g mr1次野鸢尾黄素溶液；精密称取山奈酚适量，用甲醇溶解并定容 得到0. 1 y g ? mr1内标溶液。
[0025] 上述所述动物可为家兔、鼠及禽类等。
[0026] 本发明提供的动物血清中次野鸢尾黄素含量的测定方法方法，将高效液相色 谱-质谱联用技术应用于动物血清中次野鸢尾黄素的含量测定，以山奈酚为内标，能准确 测定动物血清中次野鸢尾黄素的含量。本发明方法样品处理方法简便易操作，方法回收率 满足分析检测要求。采用本发明将HPLC-MS/MS技术应用于动物血清中次野鸢尾黄素的检 测，被测组分检测灵敏度提高，分离度好，分析时间短，需样量少，溶剂用量少，含量测定结 果准确，重复性、稳定性好。次野鸢尾黄素具有多种药理活性，如抗病毒、抗肿瘤及抗氧化等 活性。本发明能方便快捷、准确的检测动物血清中次野鸢尾黄素的含量，为次野鸢尾黄素在 动物体内的药代动力学和生物等效性研宄奠定了方法学基础。
【具体实施方式】
[0027] 以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用 于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
[0028] 实施例1 :
[0029] 为了进一步说明本发明的实质，申请对本发明方法进行了以下实验分析。
[0030] 本发明所使用的射干提取物由兰州畜牧与兽药研宄所制备，以山奈酚为内标物 质。
[0031] 1材料与方法
[0032]1. 1仪器6410型三重四极杆质谱（美国Aglient)，200型高效液相色谱 仪（美国Aglient)，电喷雾离子源（ESI)，高速离心机（Allegra X-15R)，漩涡混合器 (Equl-Glascol)〇
[0033] 1. 2药品与试剂次野鸢尾黄素标准品（中国药品生物制品检定所）；射干提取物 (兰州畜牧与兽药研宄所制备）；山奈酚（sigma);乙腈为色谱纯，乙酸乙酯为化学纯，甲酸 为优级纯，水为超纯水。
[0034] 1. 3色谱条件色谱柱为Aglient Zorbax 018柱（2. lX50mm，3. 5um);流动相为乙 腈和0. 1 %甲酸水，二元梯度洗脱，具体见表1。流速0. 4mL ? mirT1;柱温30°C ;进样体积为 2uL〇
[0035] 表1流动相梯度洗脱
【主权项】
1. 一种动物血清中次野鸢尾黄素含量的测定方法，其特征在于：将高效液相色谱-质 谱联用技术应用于动物血清中次野鸢尾黄素的含量测定，以山奈酚为内标，测定动物血清 中次野鸢尾黄素的含量。
2. 根据权利要求1所述的动物血清中次野鸢尾黄素含量的测定方法，其特征在于：具 体步骤如下： 1) 标准品溶液及内标液的配制 精密称取次野鸢尾黄素标准品适量，用甲醇溶解并定容得到次野鸢尾黄素标准品溶 液；精密称取山奈酚适量，用甲醇溶解并定容得到内标溶液； 2) 标准血清溶液的制备 向动物空白血清中加入次野鸢尾黄素标准品溶液、内标溶液，涡旋混合，加NaCl，涡旋 混匀，加乙酸乙酯，充分涡旋混匀，离心分离有机层，于40°C水浴中氮气吹干，加超纯水溶解 残渣，过微孔滤膜，得标准血清溶液； 3) 供试品溶液的制备 取给药后的动物血清，加入内标溶液，涡旋混合，加入NaCl，涡旋混匀，加乙酸乙酯，充 分涡旋混匀，离心分离有机层，于40°C水浴中氮气吹干，加超纯水溶解残渣，过微孔滤膜，得 供试品溶液； 4) 测定 分别吸取标准血清溶液和供试品溶液各2 y 1，用微孔滤膜过滤后进HPLC-MS/MS分 析。
3. 根据权利要求2所述的动物血清中次野鸢尾黄素含量的测定方法，其特征在于：所 述步骤2)中，空白血清：次野鸢尾黄素标准品溶液：内标溶液：NaCl :乙酸乙酯为0. 5ml : 10uL:10]iL:0.1g :2mL〇
4. 根据权利要求2所述的动物血清中次野鸢尾黄素含量的测定方法，其特征在于：所 述步骤3)中，空白血清：内标溶液：NaCl :乙酸乙酯为0. 5ml :10yL :0.1 g :2mL。
5. 根据权利要求2所述的动物血清中次野鸢尾黄素含量的测定方法，其特征在于：所 述微孔滤膜有孔径为〇. 22 y m。
6. 根据权利要求2所述的动物血清中次野鸢尾黄素含量的测定方法，其特征在于：所 述步骤4)中，测定条件为： 色谱条件：C18反相色谱柱；流动相：乙腈和0. 1%甲酸水溶液，二元梯度洗脱；柱温 30°C ;进样体积为2uL ; 色谱条件：采用电喷雾电离源；毛细管电压为4kv ;雾化温度：350°C ;雾化气：50kPa ; 干燥气体流速：l〇L ? miiT1;碰撞能量：48v ;扫描方式为多反应监测。
7. 根据权利要求6所述的动物血清中次野鸢尾黄素含量的测定方法，其特 征在于：所述梯度洗脱的程序为：〇min - 2min - 6min - IOmin - 15min、乙腈 15% - 25% - 40% - 80% - 15% ;流速为 0? 4mL ? mirT1。
8. 根据权利要求2所述的动物血清中次野鸢尾黄素含量的测定方法，其特征在于：所 述步骤4)中，测定后，根据得到的总离子流图和质谱图，测定峰面积，以次野鸢尾黄素和内 标的峰面积比为Y轴对血清中次野鸢尾黄素浓度为X轴进行线性回归，得线性关系和回归 方程，计算待测物浓度。
9.根据权利要求2所述的动物血清中次野鸢尾黄素含量的测定方法，其特征在 于：所述步骤1)，具体为：精密称取次野鸢尾黄素标准品适量，用甲醇溶解并定容得 到0.Iyg^mr1次野鸢尾黄素溶液；精密称取山奈酚适量，用甲醇溶解并定容得到 0.Iyg?mr1内标溶液。
【专利摘要】本发明公开了一种动物血清中次野鸢尾黄素含量的测定方法，将高效液相色谱-质谱联用技术应用于动物血清中次野鸢尾黄素的含量测定，以山奈酚为内标，测定动物血清中次野鸢尾黄素的含量。本发明方法样品处理方法简便易操作，方法回收率满足分析检测要求。采用本发明将HPLC-MS/MS技术应用于动物血清中次野鸢尾黄素的检测，被测组分检测灵敏度提高，分离度好，分析时间短，需样量少，溶剂用量少，含量测定结果准确，重复性、稳定性好。
【IPC分类】G01N30-06, G01N30-02
【公开号】CN104849359
【申请号】CN201510055264
【发明人】辛蕊华, 李维, 郑继方, 罗永江, 谢家声, 王贵波, 罗超应, 李锦宇
【申请人】中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2015年2月3日