一种同时测定人肝微粒体中7种cyp450酶探针底物代谢产物的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种时测定人肝微粒体中7种CYP450酶探针底物代谢产物的方法，属 于生物检测技术领域。
【背景技术】
[0002] 在药物的生物转化过程中，CYP450酶参与大多数内源性和外源性化合物的体内 代谢，是药物代谢的关键酶，其活性决定药物的代谢速率和清除率；而CYP450酶同时又可 以被多种药物抑制或诱导，从而产生代谢性药物相互作用，影响药效，产生不良反应。FDA 于2012年颁布的《药物相互作用研宄指南》中明确指出，进行药物相互作用研宄时，需首先 考察药物对CYP450酶活性的影响。细胞色素P450(CYP450)是人体中重要的氧化酶，包括 CYP1A2, 2B6, 2C8, 2C9, 2C19, 2D6和3A4/5等，超过90%以上的药物经其代谢。CYP450酶的 抑制或诱导是引起代谢性药物相互作用的主要原因，特别是由代谢酶抑制所致的药物相互 作用约占全部相互作用的70 %。因此，研宄药物对代谢酶的抑制作用，对临床合理用药和避 免潜在的药物相互作用具有重要的指导意义。
[0003] 高效液相-串联质谱法（HPLC-MS/MS)是检测药物浓度最常用的方法，具有其灵敏 度高、特异性强等特点，可以对多种微量化合物同时进行检测，通过检测CYP450酶探针药 物代谢产物的浓度，从而来判断代谢酶代谢能力的变化，是目前研宄药物代谢酶活性最常 用的一种检测方法。通过建立该检测方法可以应用于研宄药物对CYP450酶的抑制和诱导 作用。
[0004] 目前经过系统验证的HPLC-MS/MS方法只能同时检测5种代谢产物：（1)同时测定 5种CYP450酶探针药代谢产物的检测方法。专利申请号-:CN201010559684,吉林大学；（2) Ahigh-throughputinhibitionscreeningofmajorhumancytochromeP450enzymes usinganinvitrococktailandliquidchromatography-tandemmassspectrometry. BiomedChromatogr. 2014, 28(2):197_203〇
[0005] 经检索，检测7种代谢产物的方法也具有缺陷性：如7种代谢产物并不是同时进行 检测，而是采用HPLC和HPLC-MS/MS分别进行检测（曹秀珍，张伟，姚志红，等。甲基原薯蓣 皂苷对人肝微粒体中7种CYP450酶活性的影响。沈阳药科大学学报，2008);检测方法学没 有经过严格的系统性验证（如：专属性、标准曲线、准确度、精密度等）。（刘丽雅，韩永龙，余 奇，等.消癌平注射液等4种抗肿瘤中药注射剂对人肝微粒体中CYP450酶7种亚型的体外 抑制作用研宄.中国临床药理学与治疗学，2014,15(9) :522-527 ;刘海燕，张乐多，向志雄， 等.体外"鸡尾酒法"研宄5-羟基雷公藤内酯醇对人肝微粒体CYP450酶亚型的抑制.中 国临床药理学与治疗学，2013,18(11) :1211-1218)。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的提供一种能够准确、高效的检测人肝微粒体中7种CYP450酶探针 底物代谢产物的方法，从而应用于CYP450酶7种亚型活性的评价。
[0007] 按照本发明提供的技术方案，一种测定人肝微粒体中7种CYP450酶探针底物代谢 产物的方法，步骤为：
[0008] (1)人肝微粒体的孵化：选取不同的代谢酶探针底物，分别与人肝微粒体 和Tris-HCL缓冲液（50mmol/L，pH= 7. 4) 37°C预温孵 5~lOmin后，再加入 20yL NADPH(0.lmmol/L)启动反应，温孵不同的反应时间，反应总体积为200yL(有机溶剂体积 〈0.5%总体积）（见表1)。
[0009] 表1CYP450酶探针底物在人肝微粒体温孵体系中的反应条件和生成代谢产物
【主权项】
1. 一种同时测定人肝微粒体中7种CYP450酶探针底物代谢产物的检测方法，其特征是 步骤为： (1) 人肝微粒体的孵化：选取不同的代谢酶探针底物，分别与人肝微粒体和Tris-HCL 缓冲液37°C预温孵5~10min后，再加入20 y L 0. lmmol/L的NADPH启动反应，温孵不同的 反应时间，反应总体积为200 y L ;其中有机溶剂体积小于0. 5%总体积； (2) 人肝微粒体样品预处理：在温孵后人肝微粒体样品，加入内标，即扎托布洛芬的冰 乙腈终止反应；涡旋混匀离心取上清液； (3) 色谱：将步骤（2)预处理后的人肝微粒体样品进行液相色谱分离； (4) 质谱：对步骤（3)所得到的人肝微粒体样品继续进行质谱分离，记录； (5) 计算：采用内标法，以不同的探针底物代谢产物和内标扎托布洛芬的峰面积比值分 别代入各自的标准曲线方程，计算温孵后人肝微粒体样品中代谢产物的浓度。
2. 如权利要求1所述同时测定人肝微粒体中7种CYP450酶探针底物代谢产物的检测 方法，其特征是步骤（2)具体步骤如下：温孵后的200 y L人肝微粒体样品，加入200 y L含 500ng/mL内标扎托布洛芬的冰乙腈终止反应；祸旋混勾5~10min，13000rpm离心10~15min， 离心后取上清液。
3. 如权利要求1所述同时测定人肝微粒体中7种CYP450酶探针底物代谢产物的检测 方法，其特征是步骤（3)中色谱条件为： 色谱条件中色谱柱：ZORBXA Eclipse-plus C18柱；流动相：甲醇（A):水，水中还含有 质量浓度 〇? 1% 的甲酸；梯度洗脱 〇 - 〇? 8 min，5% A ;0? 8 - 5. 0 min，95% A ;5. 0 - 7. 0 min，5% A ;流速：200~300 y L/min ;柱温：30~35°C ;进样量：5~10 y L。
4. 如权利要求1所述同时测定人肝微粒体中7种CYP450酶探针底物代谢产物的检测 方法，其特征是步骤（4)中质谱条件为： 电喷雾离子化正离子ESI+ ;喷雾电压4000V ;离子传输毛细管温度：350°C ;雾化气压 力：30psi ;干燥气流速：10L/min ;扫描方式：选择性反应监测SRM ; 监测离子对和碰撞能量：对乙酰氨基酚152/110,16eV、l-羟基安非他酮256/238， 10eV、4-羟基双氯芬酸312/230, 30eV、6-羟基紫杉醇870/286, 34eV、4-羟基美芬妥英 235/150,19eV、右啡烷258/157, 37eV、1-羟基咪达唑仑342/203, 24eV、内标：扎托布洛芬 299/225,17eV。
5. 如权利要求1所述同时测定人肝微粒体中7种CYP450酶探针底物代谢产物的检测 方法，其特征是步骤（3)中色谱柱长度为100mm，内径为2. 1mm，填料粒径为3. 5 ym。
6. 如权利要求1所述同时测定人肝微粒体中7种CYP450酶探针底物代谢产物的检测 方法，其特征是：所述 7 种代谢酶为 CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6 和 CYP3A4/5。
【专利摘要】本发明涉及一种同时测定人肝微粒体7种CYP450酶探针底物代谢产物的检测方法，属于生物检测技术领域。将CYP450酶的特异性探针底物与人肝微粒体温孵不同的反应时间后，生成相应的代谢产物，以扎托布洛芬为内标，蛋白沉淀法预处理后，采用高效液相色谱-串联质谱法可同时检测7种探针底物的代谢产物浓度。本发明方法特异性强、灵敏度高、操作简便，已成功运用于黄芩苷对人肝微粒体CYP450酶抑制作用的研究。
【IPC分类】G01N30-02
【公开号】CN104849371
【申请号】CN201510268995
【发明人】黄凯, 洪远, 张娜, 蔡建美, 贺晴
【申请人】无锡市人民医院
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2015年5月22日