一种利用hplc测定磺酸酯类基因毒性杂质的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物分析领域，具体地，涉及一种利用HPLC (高效液相色谱）测定磺酸 酯类基因毒性杂质的方法。
【背景技术】
[0002] 药物合成中，甲磺酸、苯甲磺酸等磺酸类物质与微量的低级醇在合成反应中生成 烷基磺酸酯如甲磺酸甲酯（丽S)、甲磺酸乙酯（EMS)，正丁基甲磺酸酯（NBMS)，以及芳基磺 酸酯如苯磺酸甲酯（MBS)，苯磺酸乙酯（EBS)、对甲苯磺酸酯（MP-TS)，这些物质可与DNA发 生烷基化反应，从而可能成为引发癌症的诱因，这些潜在基因毒性杂质的存在引起了管理 机构的高度重视，规定在原料药中进行有关物质的严格控制，欧盟规定基因毒性杂质的限 度为最大日服量为1.5 μ g。
[0003] 现有技术中存在使用HPLC法测定磺酸酯类杂质，HPLC-UV法是比较常用的检测 方法，如PR-HPLC法测定苯磺酸氨氯地平中MBS、EBS，该方法采用Inretsil ODS色谱柱 (150mmX 4. 6mm，5Mm)，流动相为1%三乙胺（Ph 3. 0)-乙腈，其分离度和峰形较好，但是检测 限较低，而且当被测物浓度较低时，可能不能检测到紫外吸收，从而影响测定。
[0004] 目前，我国常规药物检测分析方法的灵敏度仅为10至60ppm，根本无法对基因毒 性杂质进行定性和定量的分析，只能通过合成路线的不断调整，避开可能会产生基因毒性 杂质的中间体和起始物料。
[0005] 本专利申请人发现，用以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，有机相与醋 酸盐缓冲液的混合溶剂作为流动相梯度洗脱，可检测出磺酸酯类杂质，且灵敏度高（灵敏 度可达0. 75ppm)，可以有效控制原料药质量，解决了基因毒性无法定性定量分析检测的难 题。
【发明内容】
[0006] 本发明提供一种利用HPLC测定磺酸酯类基因毒性杂质的方法，从而实现对痕量 磺酸酯类基因毒性杂质在原料药中的控制。
[0007] 本发明的技术方案：提供一种利用HPLC测定磺酸酯类基因毒性杂质的方法， 选择十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以有机相与缓冲液的混合溶剂作为流动相梯度 洗脱。
[0008] 检测步骤如下： (1) 设定色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以有机相与缓冲液的 混合溶剂作为流动相梯度洗脱，柱温20°c~30°C，流速为0.8~1.2mL/min，检测波长为 260nm± IOnm ; (2) 配制样品洛液：米用有机洛剂或有机洛剂和水的混合液将待检测样品配制成样品 溶液； (3) 分离分析：将样品溶液10 μ L，注入高效液相色谱仪，完成磺酸酯类基因毒性杂质 的测定。
[0009] 所述有机相为选自乙腈。
[0010] 所述缓冲液为醋酸盐冲液。缓冲液的浓度范围为〇· 〇〇5mol/L~0· 05mol/L，优选 0.01mol/L〇
[0011] 所述缓冲液的pH值为3. 0~5. 1。
[0012] 所述流动相为有机相与缓冲液的混合溶剂梯度洗脱，梯度洗脱0~5min时，缓冲 液、有机相的比例为体积比90%: 10% ;5~Hmin时，缓冲液体积比减小为80%，有机相体积 比增加为20% ;14~15min,缓冲液比例为体积比减少为10%,有机相的比例为体积比增加 为90% : 15~25min时，缓冲液、有机相的比例为体积比10%: 90%不变；25~30min时，缓 冲液体积比增加为90%，有机相体积比减少为10% ;30~35min时，缓冲液、有机相的比例 为体积比90%: 10%不变。
[0013] 所述的检测条件：柱温20°C~30°C，优选25°C ;流速为0· 8~L 2mL/min，优选 1.0 mL/min。检测波长为 260nm± 10nm，优选 260nm。
[0014] 本发明所述的检测方法，可以依照以下方法实现： (1)取待检测样品适量，用乙腈或它与水的混合溶剂溶解，配制成合适浓度的样品溶 液。
[0015] (2)取磺酸酯类杂质适量，用乙腈或它与水的混合溶剂溶解，配制成合适浓度的对 照品洛液。
[0016] (3)设置流动相流速为0. 8~I. 2mL/min，流动相的流速优选为1.0 mL/min ;检测 波长260nm ;色谱柱温度为20°C~30°C，优选为25°C。
[0017] (4)分别取（1)、2)的样品溶液和对照品溶液10μ L，注入高效液相色谱仪，完成磺 酸酯类毒性杂质的含量测定。
[0018] 本发明的技术效果：通过利用HPLC，对原料药中基因毒性杂质(或疑似基因毒性） 磺酸酯类毒性杂质进行痕量检测分析，灵敏度可达〇. 75ppm。
【具体实施方式】
[0019] 下面详细描述本发明的实施例，需要说明的是下面描述的实施例是示例性的，仅 用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。另外，如果没有明确说明，在下面的 实施例中所采用的所有试剂均为市场上可以购得的，或者可以按照文本或已知的方法合成 的，对于没有列出的反应条件，也均为本领域技术人员容易获得的。
[0020] 实施例1 仪器：Agilentl260高效液相色谱仪，1260紫外检测器 色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱（250 X 4. 6mm，5 μ m); 流动相A :0· 01m〇l/L的醋酸铵缓冲液（ρΗ5· I) 流动相B :乙腈 梯度洗脱见下表；
流速：1. OmL/min 检测波长：260nm 柱温：25°C 进样体积：1〇 μ L 稀释剂：乙腈 试验步骤： 供试品溶液：称取苯磺酸氨氯地平样品I. 〇〇14g置IOmL量瓶，用稀释剂溶解并稀释 至刻度，摇匀。
[0021] 对照品溶液：精密称取对苯磺酸甲酯对照品7. 48mg置IOOmL量瓶中，用水溶解 并稀释至刻度，摇匀，作为贮备液A。精密量取1.0 mL贮备液A置IOOmL量瓶中，用稀释剂 稀释至刻度，摇匀，作为贮备液B，精密量取1.0 mL贮备液B置IOmL量瓶中，用稀释剂稀释 至刻度，摇匀，作为对照品溶液（0. 75ppm)。
[0022] 分别取对照品、供试品溶液，在上述色谱条件下进行高效液相色谱分析，记录色谱 图，图中保留时间为6. 282min色谱峰为的苯磺酸甲酯色谱峰，采用面积归一化法计算杂质 含量。
[0023] 结论：苯磺酸氨氯地平样品中的苯磺酸甲酯小于0. 75ppm。
[0024] 实施例2 仪器：Agilentl260高效液相色谱仪，1260紫外检测器 色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱（250 X 4. 6mm，5 μ m); 流动相A :0· Olmol/L的醋酸铵缓冲液（ρΗ3· 0) 流动相B :乙腈 梯度洗脱见下表； 流速：1. OmL/min
检测波长：250nm 柱温：20°C 进样体积：1〇 μ L 稀释剂：乙腈 试验步骤： 供试品洛液：称取甲横Ife加雷沙星粗品l.〇〇14g直IOmL量瓶，用f布释剂洛解并f布释 至刻度，摇匀。
[0025] 对照品溶液：精密称取甲磺酸甲酯对照品37. 42mg置IOOmL量瓶中，用稀释剂溶 解并稀释至刻度，摇匀，作为贮备液A。精密量取1.0 mL贮备液A置IOOmL量瓶中，用 稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为贮备液B，精密量取1.0 mL贮备液B置IOOmL量瓶中，用稀 释剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液（3. 75ppm)。
[0026] 分别取对照品、供试品溶液，在上述色谱条件下进行高效液相色谱分析，记录色谱 图，图中保留时间为4. 545min色谱峰为甲磺酸甲酯色谱峰，采用面积归一化法计算杂质含 量。
[0027] 结论：本方法适用于检测甲磺酸加雷沙星样品中不同浓度范围的甲磺酸甲酯的含 量。
[0028] 对照例1 采用现有技术中的GC-FID方法对苯磺酸氨氯地平的基因毒性杂质进行检测分析，进 一步验证本发明所采用方法的准确度和灵敏度。
[0029] 供试品溶液的制备：取苯磺酸氨氯地平适量，精密称定，先用少许水溶解，再用丙 酮稀释并定容制成20mg/ml，作为供试品溶液；取苯磺酸甲酯对照品适量，精密称定，用丙 酮溶解并稀释制成〇. 〇5mg/ml溶液，作为对照品溶液；分别取上述供试品溶液与对照品溶 液依法顶空进样，记录色谱图，以峰面积外标法计算结果。
[0030] 色谱条件： 进样口 ：分流，温度250°C ; 色谱柱：聚乙二醇为固定相或极性相近； 柱温：程序升温150°C保持4分钟然后以20°C每分钟升温到240°C保持5分钟； 柱流速：2. Oml/min ; 检测器：氢火焰离子化检测器（FID)，温度280°C ; 分流进样：分流比10:1 ; 进样模式：顶空进样； 顶空进样器：炉温150°c保温10分钟，针温度150°C，进样量lml。
[0031 ] 根据对照品溶液与供试品溶液的出峰时间确定有苯磺酸甲酯存在，且根据苯磺酸 甲酯的出峰面积确定供试品中的苯磺酸甲酯的含量与本发明测定的结果相符。
【主权项】
1. 一种利用HPLC测定磺酸酯类基因毒性杂质的方法，其特征在于： (1)色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以有机相与缓冲液的混 合溶剂作为流动相梯度洗脱，柱温20°C~30°C，流速为0.8~1.2mL/min，检测波长为 260nm± IOnm ; (2 )样品溶液的配制：采用有机溶剂或有机溶剂和水的混合液将待检测样品配制成样 品洛液； (3)分离分析：将样品溶液IOu L，注入高效液相色谱仪，完成磺酸酯类毒性杂质的测 定。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述流动相为有机相与缓冲液的混合溶 剂梯度洗脱，梯度洗脱〇~5min时，缓冲液、有机相的比例为体积比90%:10% ;5~14min 时，缓冲液体积比减小为80%，有机相体积比增加为20% ;14~15min，缓冲液比例为体积比 减少为10%，有机相的比例为体积比增加为90% ;15~25min时，缓冲液、有机相的比例为 体积比10%: 90%不变；25~30min时，缓冲液体积比增加为90%，有机相体积比减少为10% ;30~35min时，缓冲液、有机相的比例为体积比90%: 10%不变。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述有机相为乙腈。4. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述缓冲液为选自醋酸盐缓冲液。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述缓冲液的浓度范围为0.005mol/L ~0? 05mol/L，优选 0? 01mol/L。6. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述缓冲液的pH值为3. 0~5. 1。7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：流动相的流速为1.0 mL/min。8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：柱温为25°C。9. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：检测波长为260nm。
【专利摘要】本发明公开了一种利用HPLC测定磺酸酯类基因毒性杂质（或疑似基因毒性）的方法。选择十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，以有机相与缓冲液的混合溶剂梯度洗脱作为流动相直接进行检测。该检测方法检测灵敏度高、专属性强、精密度高、准确性强、操作方便，且该方法的适用性很广，有效控制原料药的质量。
【IPC分类】G01N30/88
【公开号】CN105092754
【申请号】CN201410215531
【发明人】严洁, 李轩
【申请人】天津市汉康医药生物技术有限公司
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2014年5月21日