一种新型细菌内毒素检测试纸及检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物检测技术领域，具体的说是涉及一种新型细菌内毒素检测试纸及检测方法。
【背景技术】
[0002]细菌内毒素(Endotoxin)广泛存在于自然界中，主要由革兰氏阴性菌产生，是细菌细胞壁上的特有组分。内毒素主要成分是类脂和多糖，因此也被称为脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)。当细菌死亡自溶或者黏附在其它细胞表面时，释放出来的内毒素会引发人或动物发热、白细胞增高、腹泻、血管舒缩机能紊乱，糖代谢紊乱，严重时甚至发生休克。所以细菌内毒素也被称之为“热原”。鉴于内毒素在自然界的广泛存在以及其可能引发的强烈“热原反应”，生物制品、化学药品、注射用药剂、透析液以及很多的医疗器械如一次性输液设备、植入性生物材料等等都需要经过严格的细菌内毒素检测合格后才能使用。
[0003]在药品药理检测中，目前有两种常用的热原检测方法:细菌内毒素法(鲎试剂法)和家兔法。家兔法仅用于定性检验。而目前得到最广泛使用的鲎试剂法是基于1956年的一个发现，美洲鲎血液遇到革兰氏阴性菌会快速产生凝结反应。而后基于鲎试剂建立起了各种各样的方法。包括凝胶法，动态浊度法、终点浊度法、动态显色法、终点显色法等技术。其中凝胶法是通过观察有无凝胶形成作为反应的终点，可以进行定性或者半定量检测。终点浊度法和动态浊度法都属于浊度法。浊度法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化，通过浊度仪测定内毒素含量的方法。
[0004]终点显色法和动态显色法都是属于显色基质法。显色基质法系利用鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特定底物显色释放出的呈色团的多少，通过分光光度计或者荧光光度计测定内毒素含量的方法。近年来显色方法得到了进一步发展。基于重组C因子开发出来的荧光检测技术进一步提高了内毒素检测的速度以及灵敏度。因此显色法逐步成为内毒素检测的主流方法。除此之外，基于气质联用(GC/MS)的检测技术也有得到使用。但是在目前的检测方法中，凝胶法的主观性太强，而且操作复杂，无法进行简便的定性或者半定量检测，而显色法包括荧光法，以及GC/MS技术对检验设备有强烈的依靠。很难做到快捷，方便的现场检测。对于很多需要随时进行有效监测的应用造成很大困难。本发明旨在建立一种基于侧向层析技术的快速半定量内毒素检测方法，以便于内毒素快速监测或POCT检验等方面的需要。
【发明内容】
[0005]本发明为了克服现有技术存在的不足，提供一种能够快捷、方便的对细菌内毒素进行现场检测的新型细菌内毒素检测试纸及检测方法。
[0006]本发明是通过以下技术方案实现的:一种新型细菌内毒素检测试纸，其为内毒素侧向层析检测试纸，所述内毒素侧向层析检测试纸由底板、吸水板、硝酸纤维素膜、特异性磷酸基团结合标记分子垫、内毒素结合分子多粘菌素B、磷酸化质控肽和玻璃纤维样品吸液层组成；所述硝酸纤维素膜设置于底板的中部，在所述硝酸纤维素膜上设置有多条内毒素反应检测线和一条固化的磷酸化质控肽控制线；在底板的一端端头设置有所述吸水板，在底板的另一端端头设置有所述玻璃纤维样品吸液层，硝酸纤维素膜的两端分别与吸水板和所述特异性磷酸基团结合标记分子垫互相交叠连接，在特异性磷酸基团结合分子垫上压有所述玻璃纤维样品吸液层。
[0007]—种采用新型细菌内毒素检测试纸检测新型细菌内毒素的检测方法，当带有内毒素的待测样本上样后，样品中内毒素分子上的磷酸基团能够与特异性磷酸基团结合标记分子发生特异结合，而内毒素的类脂肪A同时与固定在硝酸纤维素薄膜检测线上的多粘菌素B结合，而样品中过量而未固定在第一条检测线上的内毒素-磷酸化标记分子复合物继续沿着层析方向，在下面的多条固化了多粘菌素B的检测线上重新结合固定，根据检测线所固定的标记分子达到快捷半定量的内毒素含量监测目标(如图4所示)。
[0008]内毒素分子是革兰氏阴性菌外膜上的一种脂多糖分子。根据结构特点分为三个部分(如图1所示)。1、由重复的3-5寡糖链单元组成的O抗原；2、含有2-酮基-3-脱氧辛酸(KDO)的核心寡糖(Core antigen) ;3、由磷酸化的N-乙酰氨基葡糖二聚体及6_7个脂肪酸链组成的类脂A。
[0009]多粘菌素B是由多粘芽胞杆菌产生的一组多肽类抗生素(如图2所示)。由于其与内毒素分子类脂A能形成稳定结合的复合物，因此被广泛用于内毒素分离以及临床上敏感菌引起的感染及绿脓杆菌引起的泌尿系统感染以及眼、气管、脑膜炎、败血症、烧伤感染以及皮肤粘膜感染等。在本发明中起到结合和固化待测样品中内毒素的作用。
[0010]Phos - tag ? (http: //www.phos-tag.com/english/)是由日本广岛大学医药分子功能科学研究室开发的一种在生理(中性PH)条件下捕捉磷酸单酯阴离子的小分子化合物。通过对该分子进行改构，增加一个可修饰臂，在此基础上进行生物素或其它发色基团，或者有色纳米聚苯乙烯微球修饰，成为一个高灵敏的磷酸基团检测分子(如图3所示)。在本发明中作为特异性磷酸基团结合标记分子，起到结合并且标记内毒素的作用。
[0011]本发明的有益效果是:现有技术中的内毒素检测技术包括凝胶法、动态浊度法、终点浊度法、动态显色法和终点显色法。凝胶法是利用内毒素与鲎试剂形成凝胶的速度以及凝固的程度，与标准品对比，人工定性判定内毒素的含量。与凝胶法检测技术相比，本发明具有操作简便，反应时间短，而且避免人工判读的主观性。其它方法学，也都是基于内毒素能与鲎血液的快速凝结反应。虽然这些衍生出来的方法学从反应操作简便性，以及定量准确性，灵敏度方面较凝胶法有大幅度提高，但是检测反应高度依赖检测设备，很难做到便携，及时快速检测。而本发明不是基于内毒素对鲎试剂的特殊凝集反应，而是采用了一种类似侧向层析的快速检测技术，对检测设备没有特别要求，而且检测条携带方便，反应时间短，非常适合各种及时监测内毒素水平的需要。如:室外条件没有固定设备条件的环境监测；饮用水水质及时监测，研发过程中随时监测核酸蛋白纯化中内毒素水平等。
【附图说明】
[0012]图1是细菌内毒素分子的分子结构图；
图2是多粘菌素B的分子结构图； 图3是特异性磷酸基团结合标记分子的分子结构图；
图4是磷酸化质控肽的序列；
图5是内毒素侧向层析检测试纸的监测结果示意图。
【具体实施方式】
[0013]以下结合附图对本发明作详细描述。
[0014]如图1至图5所示，一种新型细菌内毒素检测试纸，其为内毒素侧向层析检测试纸，所述内毒素侧向层析检测试纸由底板、吸水板、硝酸纤维素膜、特异性磷酸基团结合标记分子垫、内毒素结合分子多粘菌素B、磷酸化质控肽和玻璃纤维样品吸液层组成；所述硝酸纤维素膜设置于底板的中部，在所述硝酸纤维素膜上设置有多条内毒素反应检测线和一条固化的磷酸化质控肽控制线；在底板的一端端头设置有所述吸水板，在底板的另一端端头设置有所述玻璃纤维样品吸液层，硝酸纤维素膜的两端分别与吸水板和所述特异性磷酸基团结合标记分子垫互相交叠连接，在特异性磷酸基团结合分子垫上压有所述玻璃纤维样品吸液层。
[0015]—种采用新型细菌内毒素检测试纸检测新型细菌内毒素的检测方法，当带有内毒素的待测样本上样后，样品中内毒素分子上的磷酸基团能够与特异性磷酸基团结合标记分子发生特异结合，而内毒素的类脂肪A同时与固定在硝酸纤维素薄膜检测线上的多粘菌素B结合，而样品中过量而未固定在第一条检测线上的内毒素-磷酸化标记分子复合物继续沿着层析方向，在下面的多条固化了多粘菌素B的检测线上重新结合固定，根据检测线所固定的标记分子达到快捷半定量的内毒素含量监测目标。
[0016]最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。
【主权项】
1.一种新型细菌内毒素检测试纸，其特征在于:所述新型细菌内毒素检测试纸为内毒素侧向层析检测试纸，所述内毒素侧向层析检测试纸由底板、吸水板、硝酸纤维素膜、特异性磷酸基团结合标记分子垫、内毒素结合分子多粘菌素B、磷酸化质控肽和玻璃纤维样品吸液层组成；所述硝酸纤维素膜设置于底板的中部，在所述硝酸纤维素膜上设置有多条内毒素反应检测线和一条固化的磷酸化质控肽控制线；在底板的一端端头设置有所述吸水板，在底板的另一端端头设置有所述玻璃纤维样品吸液层，硝酸纤维素膜的两端分别与吸水板和所述特异性磷酸基团结合标记分子垫互相交叠连接，在特异性磷酸基团结合分子垫上压有所述玻璃纤维样品吸液层。2.根据权利要求1所述的采用新型细菌内毒素检测试纸检测新型细菌内毒素的检测方法，其特征在于:当带有内毒素的待测样本上样后，样品中内毒素分子上的磷酸基团能够与特异性磷酸基团结合标记分子发生特异结合，而内毒素的类脂肪A同时与固定在硝酸纤维素薄膜检测线上的多粘菌素B结合，而样品中过量而未固定在第一条检测线上的内毒素-磷酸化标记分子复合物继续沿着层析方向，在下面的多条固化了多粘菌素B的检测线上重新结合固定，根据检测线所固定的标记分子达到快捷半定量的内毒素含量监测目标。
【专利摘要】本发明公开了一种新型细菌内毒素检测试纸及检测方法，当带有内毒素的待测样本上样后，样品中内毒素分子上的磷酸基团能够与特异性磷酸基团结合标记分子发生特异结合，而内毒素的类脂肪A同时与固定在硝酸纤维素薄膜检测线上的多粘菌素B结合，而样品中过量而未固定在第一条检测线上的内毒素-磷酸化标记分子复合物继续沿着层析方向，在下面的多条固化了多粘菌素B的检测线上重新结合固定，根据检测线所固定的标记分子达到快捷半定量的内毒素含量监测目标。本发明采用了一种类似侧向层析的快速检测技术，对检测设备没有特别要求，而且检测条携带方便，反应时间短，非常适合各种及时监测内毒素水平的需要。
【IPC分类】G01N33/558
【公开号】CN105116142
【申请号】CN201510473601
【发明人】陈文峻, 卢毅, 黄晓春
【申请人】上海拜攸生物科技有限公司
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年8月5日