一种免疫亲和方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种免疫亲和方法。
【背景技术】
[0002] 作为一项样品前处理技术，固相萃取柱已得到实验室广泛地应用。随着固相萃取 技术的不断发展，一种新型萃取柱一一免疫亲和柱正悄然代替传统固相萃取柱。免疫亲和 柱（IAC)基于抗原抗体反应，利用生物大分子具有对一类生物大分子特异识别和可逆结合 的特性而制作的一种分离萃取柱，具有独特的选择专一性和良好的吸附净化性能。处理过 的样品提取液在缓慢通过免疫亲和柱时，样品提取液中的分析物与柱内的抗体结合，而未 被结合的其它杂质经洗涤后除去，再用洗脱液冲洗柱体，收集分析物。较传统固相萃取柱， 免疫亲和柱对目标物的选择性更强，吸附净化效果更好，且所消耗的试剂更少。
[0003] 利用上述免疫亲和柱进行免疫亲和时存在以下几个问题： 1.免疫亲和由于使用抗体基质代替传统固相填料，为保持柱内抗体活性，需将抗体置 于活性液中。而目前免疫亲和柱通常体积较小，无法有足够的体积储存活性液，且活性液经 常存在溢出、漏液等情况。
[0004] 2.单根免疫亲和柱的抗体数量是固定的，这也决定了单根免疫亲和的可容纳目标 物浓度是有限的。当目标物超过柱内抗体所能结合的抗原限度，将导致目标物流失，无法有 效定量分析目标物浓度。
[0005] 3.在使用免疫亲和柱的过程中，常出现分析样品液较混浊导致亲和柱堵塞的现 象，影响亲和柱的抗体抗原结合能力，甚至无法正常开展淋洗、洗脱等后续步骤。
[0006] 上述因素限制了免疫亲和柱的推广使用和商品化，需要一种简单、有效的装置来 解决这些问题。
【发明内容】
[0007] 本发明针对现有技术的不足，提供了一种免疫亲和方法。
[0008] 本发明解决技术问题所采取的技术方案为： 本发明方法具体是： 首先根据分析对象的具体目标物，在免疫亲和柱中填充相对应的抗体基质，具体是：首 先在空柱腔中放入下筛板，接着填入抗体基质，再放入上筛板，下压上筛板使抗体基质分布 均匀，并起到固定抗体填充区的作用。
[0009] 其次灌入抗体活性液保持抗体活性，活性液的最高液面低于免疫亲和柱的最高液 面刻度线，拧紧上下堵头，置于合适的环境温度待使用。
[0010] 然后根据目标物的浓度范围，选择单根免疫亲和柱或者多根免疫亲和柱组合使 用，确定免疫亲和柱的根数；具体是：将要使用的免疫亲和柱取出，去掉上下堵头，固定免 疫亲和柱于合适位置；待活性液全流出后，根据实验需要加入待分析样品液；确认分析样 品液全流出后，加入适量淋洗液，并将其挤干弃去。
[0011] 最后加入目标物洗脱液，收集分析免疫亲和柱流出的洗脱液。
[0012] 所述的免疫亲和柱采用伸缩型螺旋组合式免疫亲和柱，所述伸缩型螺旋组合式免 疫亲和柱包括上堵头、下堵头和上样管。
[0013] 所述上堵头周向带有外螺纹，上堵头与上样管进口螺纹配合。
[0014] 所述下堵头周向带有内螺纹，下堵头与上样管出口螺纹配合。
[0015] 所述上样管包括进口、柱腔和出口，进口周向带有内螺纹，用于结合固定上堵头或 者组合固定另一免疫亲和柱的出口；出口周向带有外螺纹，用于结合固定下堵头或者组合 固定另一免疫亲和柱的进口。
[0016] 所述柱腔包括伸缩区和免疫亲和区；伸缩区设置于进口下方，免疫亲和区位于出 口上方，免疫亲和区内从上至下设置有上筛板、抗体填充区和下筛板；在柱腔外壁标识有最 高液面刻度线，该最高液面刻度线位于伸缩区下方。
[0017] 进一步说，若分析样品较混浊，则拧紧上堵头，挤压伸缩区。
[0018] 本发明的有益效果在于： 1.伸缩型螺旋组合式免疫亲和柱由于柱腔容量大，并配有上下两堵头拧于进出口，提 高了活性液体积，增强了免疫亲和的整体密封性，在保证有充足的抗体活性液同时，又达到 了防溢出、漏液等情况的出现。
[0019] 2.采用多根伸缩型螺旋组合式免疫亲和柱方式，使免疫亲和过程中的抗体数量成 倍数增长，从根本上解决了免疫亲和方法中的可容纳目标物浓度有限的问题。
[0020] 3.伸缩型螺旋组合式免疫亲和柱带有伸缩区，在使用免疫亲和过程中可将上堵头 拧紧进口，可通过侧面挤压或者向下压缩伸缩区，增大柱腔内压力，达到提高柱腔溶液流速 和充分排除残留液的目的，同时还可防止柱腔堵塞。
【附图说明】
[0021] 图1为本发明中伸缩型螺旋组合式免疫亲和柱结构示意图； 图2为本发明中使用单根免疫亲和柱示意图； 图3为本发明中使用多根免疫亲和柱示意图。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述。
[0023] 如图1所示，伸缩型螺旋组合式免疫亲和柱主要包括以下部分：上堵头1、下堵头 2、上样管3。上堵头1高L5-L 8 cm，具外翻螺纹，外径0.8-0. 9 cm，螺旋式拧于上样管进 口；下堵头2高L 6-2.0 cm，具内陷螺纹，内径0.4-0. 5 cm，螺旋式拧于上样管出口。上样管 3高9. 0-10.0 cm，外壁材料为聚乙烯，包括进口 4、柱腔5和出口 6。进口 4高0· 9-1.0 cm， 具内陷螺纹，内径为0.9-1. 0 cm，外径1.0 -Ll cm，用于结合固定上堵头1或者组合固定另 一免疫亲和柱的出口 6。出口 6高0.9-1. 0 cm，具外翻螺纹，内径0· 1-0.2 cm，外径0.3-0. 4 cm，用于结合固定下堵头2或者组合固定另一免疫亲和柱的进口 4。柱腔5高7. 0-8.0 cm， 内径L 4-1. 5 cm，外径L 5-1. 6 cm，可容纳分析体积为6-7 mL，柱腔5包括伸缩区7、免疫 亲和区8及最高液面刻度线9。伸缩区7设置于离进口 4距为0.7-0. 8 cm，未伸缩高度为 I. 1-1. 2 cm，厚度偏薄，为0.1-0. 2 cm。免疫亲和区8位于出口 6上方，高度L 3-1. 4 cm， 从上至下设置有上筛板10、抗体填充区11和下筛板12。最高液面刻度线9位于柱腔外壁 具伸缩区7下方0. 9-1. 0 cm。
[0024] 利用上述免疫亲和柱，进行免疫亲和的方法： 根据分析对象的具体目标物，填充相对应的抗体基质，具体是：首先在空柱腔中放入下 筛板，接着填入抗体基质，再放入上筛板，下压上筛板使抗体基质分布均匀，并起到固定抗 体填充区的作用。
[0025] 然后灌入抗体活性液保持抗体活性，活性液的最高液面要低于免疫亲和柱的最高 液面刻度线，拧紧上下堵头，置于合适的环境温度待使用。根据目标物的浓度范围，选择单 根免疫亲和柱或者多根组合使用，确定免疫亲和柱的根数。将要使用的免疫亲和柱取出，去 掉上下堵头，固定免疫亲和柱于合适位置(若是多根组合使用，优先组合免疫亲和柱)。待活 性液全流出后，根据实验需要加入合适体积的待分析样品液(若分析样品较混浊，可拧紧上 堵头，挤压伸缩区)。确认分析样品液全流出后，加入适量淋洗液，并将其挤干弃去。最后加 入合适的目标物洗脱液，收集分析免疫亲和柱流出的洗脱液。
[0026] 实施例：水产品中河豚毒素的免疫亲和净化应用。
[0027] 将河豚毒素抗体填入到柱腔内，高度为1. 2-1. 3 cm，盖好筛板，并注入活性液，拧 紧上下堵头，保存于〇_5°C环境，待使用。
[0028] 准确称取已充分均质马面鱼样品2. 00 g于50 mL具塞离心管中，加入10 mL含有 1%乙酸的甲醇溶液，涡旋振荡2 min，60°C水浴超声提取15 min，冷却至室温后，6000 r/min 离心5 min。移取5 mL上清液至另一 50 mL离心管中，加入20 ml PBS溶液进行稀释，用1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7~8,待净化。
[0029] 取出免疫亲和柱，去掉上下堵头，放出柱内保存活性液后，上样品液。上样结束后， 用8 mL水淋洗亲和柱，挤干柱内残留液，并弃去以上全部流出液，最后用4 mL含有1%乙酸 的甲醇溶液洗脱，收集的洗脱液于60°C氮气吹干，用I mL流动相定容溶解，经0.22 μπι滤 膜后供液相色谱-质谱分析。按照上述步骤平行测定6次，结果如表1所示。在1.50 Pg/ kg添加水平下，六次测定的平均回收率为96. 7%，相对标准偏差为3. 24%。整个免疫亲和净 化过程耗时为30 min。
[0030] 表1利用免疫亲和净化测定水产品中河豚毒素的残留量结果（/7=6)
实验结果表明使用本发明方法能有效吸附目标物，从而达到净化的效果。同时整个净 化过程时间短，操作简单，具有较高的实际应用价值。
[0031] 以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利 范围，因此依本发明要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。
【主权项】
1. 一种免疫亲和方法，其特征在于该方法具体是： 首先根据分析对象的具体目标物，在免疫亲和柱中填充相对应的抗体基质，具体是：首 先在空柱腔中放入下筛板，接着填入抗体基质，再放入上筛板，下压上筛板使抗体基质分布 均匀，并起到固定抗体填充区的作用； 其次灌入抗体活性液保持抗体活性，活性液的最高液面低于免疫亲和柱的最高液面刻 度线，拧紧上下堵头，置于合适的环境温度待使用； 然后根据目标物的浓度范围，选择单根免疫亲和柱或者多根免疫亲和柱组合使用，确 定免疫亲和柱的根数；具体是：将要使用的免疫亲和柱取出，去掉上下堵头，固定免疫亲和 柱于合适位置；待活性液全流出后，根据实验需要加入待分析样品液；确认分析样品液全 流出后，加入适量淋洗液，并将其挤干弃去； 最后加入目标物洗脱液，收集分析免疫亲和柱流出的洗脱液； 所述的免疫亲和柱采用伸缩型螺旋组合式免疫亲和柱，所述伸缩型螺旋组合式免疫亲 和柱包括上堵头、下堵头和上样管； 所述上堵头周向带有外螺纹，上堵头与上样管进口螺纹配合； 所述下堵头周向带有内螺纹，下堵头与上样管出口螺纹配合； 所述上样管包括进口、柱腔和出口，进口周向带有内螺纹，用于结合固定上堵头或者组 合固定另一免疫亲和柱的出口；出口周向带有外螺纹，用于结合固定下堵头或者组合固定 另一免疫亲和柱的进口； 所述柱腔包括伸缩区和免疫亲和区；伸缩区设置于进口下方，免疫亲和区位于出口上 方，免疫亲和区内从上至下设置有上筛板、抗体填充区和下筛板；在柱腔外壁标识有最高液 面刻度线，该最高液面刻度线位于伸缩区下方。2. 根据权利要求1所述的一种免疫亲和方法，其特征在于：若分析样品较混池，则拧紧 上堵头，挤压伸缩区。
【专利摘要】本发明公开了一种免疫亲和方法。本发明首先根据分析对象的具体目标物，在免疫亲和柱中填充相对应的抗体基质。其次灌入抗体活性液保持抗体活性，活性液的最高液面低于免疫亲和柱的最高液面刻度线，拧紧上下堵头，置于合适的环境温度待使用。然后根据目标物的浓度范围，选择单根免疫亲和柱或者多根免疫亲和柱组合使用，确定免疫亲和柱的根数。最后加入目标物洗脱液，收集分析免疫亲和柱流出的洗脱液。所述的免疫亲和柱采用伸缩型螺旋组合式免疫亲和柱。本发明提高了活性液体积，增强了免疫亲和的整体密封性，在保证有充足的抗体活性液同时，又达到了防溢出、漏液等情况的出现。
【IPC分类】G01N30/02, G01N33/53, G01N30/60
【公开号】CN105136915
【申请号】CN201510396382
【发明人】张小军, 严忠雍, 喻亮, 李佩佩, 方益, 祝银
【申请人】浙江省海洋水产研究所
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年7月8日