一种利用抗原单向扩散法测定抗体滴度的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于测量抗体效价的方法技术领域，具体设及一种利用抗原单向扩散法测 定抗体滴度的方法。
【背景技术】
[0002] 抗体蛋白是高等动物广泛表达的一类防御性大分子，能够识别病原体（抗原分 子）并与之结合。现有抗体滴度（效价）的测定方法基于抗体与抗原亲和的特性。包括 ELISA法、琼脂糖双扩散法、Becker法和免疫比浊法。1968年Becker发表了一种基于琼脂 糖上抗原与抗体免疫单扩散形成免疫沉淀复合物的原理进而测定抗体效价的方法。该方 法使质量已知的抗原在含有未知滴度抗体的琼脂糖平板上单向扩散，使形成免疫复合物沉 淀，通过测定沉淀区大小来计算抗体滴度。Becker法测定出的抗体滴度单位为毫克每毫升， 相比于W最大稀释倍数表示滴度（效价）的化ISA和琼脂糖双扩散滴度更加准确，且测抗 体滴度相对其他抗体效价测定方法操作简便，不依赖精密设备。但becker法需要通过测量 沉淀环直径和琼脂糖厚度来计算得到抗体滴度。而半固体性质的琼脂糖凝胶，其厚度测量 相对困难；Becker法在测定时因为抗原溶液的动态扩散方向并不均一，扩散圈直径测量也 有偏差，导致依据测量结果计算的沉淀环面积误差较大。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是解决现有抗体滴度的测定方法存在易导致测量结果存在偏差、测 量过程繁琐的技术问题，提供一种利用抗原单向扩散法测定抗体滴度的方法。
[0004] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为： 阳〇化]一种利用抗原单向扩散法测定抗体滴度的方法，包括W下步骤：
[0006] 1)用胶纸密封一个具有刻度的玻璃管的一端；
[0007] 2)向玻璃管中灌注含有待测抗体的琼脂糖烙融溶液；
[0008] 3)待琼脂糖烙融溶液凝固后，打开玻璃管一端密封的胶纸，将玻璃管垂直竖立于 底部放置有吸水材料的底座上；
[0009] 4)在竖立的玻璃管的上端加入0. 01~0. 05毫升的已知浓度抗原；
[0010] 5)加入抗原后用胶纸密封玻璃管的上端，防止溶液从上端蒸发；然后将玻璃管置 于37°C的恒溫箱中保溫8小时，W使抗原完全扩散进入琼脂糖凝胶内部；
[0011] 6)抗原在含有抗体的琼脂糖柱中完全扩散W后，形成乳白色免疫沉淀区；
[0012] 7)通过下列公式计算出抗体滴度：
[0013]
[0014] 其中：C-加入玻璃管内的抗原的浓度，VI-加入玻璃管内的抗原体积，V2-玻 璃管内乳白色免疫沉淀区体积，V3-玻璃管内琼脂糖烙融溶液体中加入的待测抗体体积， V4-玻璃管内含有待测抗体的琼脂糖烙融溶液体积。
[0015] 本发明采用W上技术方案，基于免疫单扩散原理，将现有测定方法中使用的中屯、 福射状单扩散，在刻度玻璃管中约束为单一垂直径向单扩散，W消除Becker法偏差，更加 快速准确的测量抗体滴度。该方法可通过刻度玻璃管上的刻度直接读出单扩散形成的免疫 沉淀区体积，无需通过厚度和直径测量，获得结果更加快捷和准确。此外，本发明亦可W将 已知浓度的抗原分散在琼脂糖凝胶中，使未知浓度的抗体向凝胶中扩散。因此，与【背景技术】 相比，本发明具有操作简单和测量准确的优点。
【具体实施方式】
[0016] 实施例1
[0017] 本实施例中的一种利用抗原单向扩散法测定抗体滴度的方法，包括W下步骤：
[0018] 1)用胶纸密封一个具有刻度的玻璃管的一端，玻璃管内径4mm，外径5. 5mm;
[0019] 2)向玻璃管中灌注含有待测抗体的琼脂糖烙融溶液，含有待测抗体的琼脂糖烙融 溶液的体积为5毫升，琼脂糖烙融溶液体中加入的待测抗体体积为125微升；
[0020] 3)待琼脂糖烙融溶液凝固后，打开玻璃管一端密封的胶纸，将玻璃管垂直竖立于 底部放置有吸水材料的底座上；
[0021] 4)在竖立的玻璃管的上端加入0.01毫升的已知浓度抗原，加入抗原的浓度为 3mg/ml；
[0022] 5)加入抗原后用胶纸密封玻璃管的上端，防止溶液从上端蒸发；然后将玻璃管置 于37°C的恒溫箱中保溫8小时，W使抗原完全扩散进入琼脂糖凝胶内部；
[0023] 6)抗原在含有抗体的琼脂糖柱中完全扩散W后，形成乳白色免疫沉淀区，乳白色 免疫沉淀区的体积为0. 75ml;
[0024] 7)通过下列公式计算出抗体滴度： 阳0巧]
[0026] 其中：C-加入玻璃管内的抗原的浓度，VI-加入玻璃管内的抗原体积，V2-玻 璃管内乳白色免疫沉淀区体积，V3-玻璃管内琼脂糖烙融溶液体中加入的待测抗体体积， V4-玻璃管内含有待测抗体的琼脂糖烙融溶液体积，
[0027] 通过上述公式计算出抗体滴度为1.6mg/ml，即代表每毫升该抗体可W中和1.6mg 的相应抗原。 阳0測 实施例2
[0029] 本实施例中的一种利用抗原单向扩散法测定抗体滴度的方法，包括W下步骤：
[0030] 1)用胶纸密封一个具有刻度的玻璃管的一端，玻璃管内径4mm，外径5. 5mm;
[0031] 2)向步骤1)的玻璃管中灌注含有待测抗体的琼脂糖烙融溶液，含有待测抗体的 琼脂糖烙融溶液的体积为5毫升，琼脂糖烙融溶液体中加入的待测抗体体积为300微升；
[0032] 3)待琼脂糖烙融溶液凝固后，打开玻璃管一端密封的胶纸，将玻璃管垂直竖立于 底部放置有吸水材料的底座上；
[0033] 4)在竖立的玻璃管的上端加入0.05毫升的已知浓度抗原，加入抗原的浓度为 3mg/ml；
[0034] 5)加入抗原后用胶纸密封玻璃管的上端，防止溶液从上端蒸发；然后将玻璃管置 于37°C的恒溫箱中保溫8小时，W使抗原完全扩散进入琼脂糖凝胶内部；
[0035]6)抗原在含有抗体的琼脂糖柱中完全扩散W后，形成乳白色免疫沉淀区，乳白色 免疫沉淀区体积为1. 60ml ;
[0036] 7)通过下列公式计算出抗体滴度：
[0037]
[0038] 其中：C-加入玻璃管内的抗原的浓度，VI-加入玻璃管内的抗原体积，V2-玻 璃管内乳白色免疫沉淀区体积，V3-玻璃管内琼脂糖烙融溶液体中加入的待测抗体体积， V4-玻璃管内含有待测抗体的琼脂糖烙融溶液体积，
[0039] 通过上述公式计算出抗体滴度为1.56mg/ml，即代表每毫升该抗体可W中和 1. 56mg的相应抗原。 W40] 实施例3
[0041] 本实施例中的一种利用抗原单向扩散法测定抗体滴度的方法，包括W下步骤：
[0042] 1)用胶纸密封一个具有刻度的玻璃管的一端，玻璃管内径4mm，外径5. 5mm;
[0043] 2)向步骤1)的玻璃管中灌注含有待测抗体的琼脂糖烙融溶液，含有待测抗体的 琼脂糖烙融溶液的体积为4. 8毫升，琼脂糖烙融溶液体中加入的待测抗体体积为240微 升；
[0044] 3)待琼脂糖烙融溶液凝固后，打开玻璃管一端密封的胶纸，将玻璃管垂直竖立于 底部放置有吸水材料的底座上；
[0045] 4)在竖立的玻璃管的上端加入0.03毫升的已知浓度抗原，加入抗原的浓度为 15m邑/ml;
[0046] 5)加入抗原后用胶纸密封玻璃管的上端，防止溶液从上端蒸发；然后将玻璃管置 于37°C的恒溫箱中保溫8小时，W使抗原完全扩散进入琼脂糖凝胶内部；
[0047] 6)抗原在含有抗体的琼脂糖柱中完全扩散W后，形成乳白色免疫沉淀区，乳白色 免疫沉淀区体积为1. 27ml ;
[0048] 7)通过下列公式计算出抗体滴度：
[0049]
[0050] 其中：C-加入玻璃管内的抗原的浓度，VI-加入玻璃管内的抗原体积，V2-玻 璃管内乳白色免疫沉淀区体积，V3-玻璃管内琼脂糖烙融溶液体中加入的待测抗体体积， V4-玻璃管内含有待测抗体的琼脂糖烙融溶液体积，
[0051] 通过上述公式计算出抗体滴度为7. 09mg/ml，即代表每毫升该抗体可W中和 7. 09mg的相应抗原。
【主权项】
1. 一种利用抗原单向扩散法测定抗体滴度的方法，其特征在于：包括以下步骤： 1) 用胶纸密封一个具有刻度的玻璃管的一端； 2) 向玻璃管中灌注含有待测抗体的琼脂糖熔融溶液； 3) 待琼脂糖熔融溶液凝固后，打开玻璃管一端密封的胶纸，将玻璃管垂直竖立于底部 放置有吸水材料的底座上； 4) 在竖立的玻璃管的上端加入0.0 l~0. 05毫升的已知浓度抗原； 5) 加入抗原后用胶纸密封玻璃管的上端，防止溶液从上端蒸发；然后将玻璃管置于 37°C的恒温箱中保温8小时，以使抗原完全扩散进入琼脂糖凝胶内部； 6) 抗原在含有抗体的琼脂糖柱中完全扩散以后，形成乳白色免疫沉淀区； 7) 通过下列公式计算出抗体滴度：其中：C一加入玻璃管内的抗原的浓度，Vl-加入玻璃管内的抗原体积，V2-玻璃管内 乳白色免疫沉淀区体积，V3-玻璃管内琼脂糖熔融溶液体中加入的待测抗体体积，V4-玻 璃管内含有待测抗体的琼脂糖熔融溶液体积。
【专利摘要】本发明属于测量抗体效价的方法技术领域，具体涉及一种利用抗原单向扩散法测定抗体滴度的方法。本发明主要解决了现有抗体滴度的测定方法存在易导致测量结果存在偏差、测量过程繁琐的技术问题。本发明将现有测定方法中使用的中心辐射状单扩散，在刻度玻璃管中约束为单一垂直径向单扩散，以消除Becker法偏差，更加快速准确的测量抗体滴度；通过刻度玻璃管上的刻度直接读出单扩散形成的免疫沉淀区体积，无需通过厚度和直径测量，获得结果更加快捷和准确。
【IPC分类】G01N33/559
【公开号】CN105181961
【申请号】CN201510540046
【发明人】吴红艳, 苏少博, 李光飞
【申请人】山西瑞亚力科技有限公司
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年8月28日