一种凝血酶时间测定试剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种凝血试剂及其制备方法，特别设及一种凝血酶时间测定试剂及其 制备方法。
【背景技术】
[0002] 凝血酶时间（TT)用来检测凝血、抗凝及纤维蛋白溶解系统功能，是临床上常用的 检测项目之一。TT测定试剂的主要成份为凝血酶，作为生物大分子，凝血酶很容易失活。为 了避免凝血酶变性，需要在试剂中添加稳定性组份。目前，市场上现有的TT测定试剂，大 多采用多醇或多糖类或盐酸盐作为凝血酶的稳定剂，同时添加叠氮酸钢作为抗菌剂或稳定 剂，其中包括专利US4696812、W0 01/23536。多醇或多糖类物质，能够提升凝血酶的稳定 性，但运类物质的过量加入，会增加混合液的粘度，从而降低采用光学法测定的TT值的准 确度。而过量氯酸盐的加入，在调节溶液的离子强度的同时，会导致混合液的玻璃化溫度降 低。叠氮酸钢具有较好的抗菌性能 <Xichstein,H.C. ;Soule,M.H.Studiesoftheeffect ofsodiumazideonmicrobicgrowthandrespiration:I.Theactionofsodiumazide onmicrobicgrowth".JournalofBacteriology47(3) :221 - 230)，但是它的毒性较大， 临床研究表明，吸入叠氮酸钢，可引起鼻、眼刺激，头痛、眩晕、软弱无力、支气管炎、血压降 低等症状，同时，在受到冲击的条件下，叠氮酸钢易于引爆，因此，增添了生产过程中原料的 使用和控制难度。本发明在实验研究的基础上，克服现有产品的不足，采用牛凝血酶为主要 原料，通过优化牛凝血酶稳定试剂种类，制备凝血酶时间测定试剂。W本发明配比制备的凝 血酶时间测定试剂，具有较好的稳定性。
【发明内容】
[0003] 本发明针对现有TT测定试剂中稳定剂的不足，提供一种新型的TT测定试剂及其 制备方法，生产安全性更高、稳定性效果更强、检测准确度更高。
[0004] 一种凝血酶时间测定试剂，组分包括：牛凝血酶和稳定剂，所述的稳定剂为鄉 氨酸和香豆酸，所述鄉氨酸的加入量为质量体积比0.5-2. 5%，所述香豆酸的加入量为 0.l-4mM。 阳〇化]优选地，鄉氨酸的加入量为质量体积比1 %、香豆酸的加入量为2mM。
[0006] 所述牛凝血酶的用量为5-10U/血。
[0007] 进一步的，上述凝血酶时间测定试剂中还包括其它稳定剂，包括：牛血清白蛋白、 氯化巧、聚乙二醇、甘露醇、麦芽糖中的一种或几种。
[0008] 所述其它稳定剂的加入量为：牛血清白蛋白0. 05-0. 5%、氯化巧8-12. 5mM、聚乙 二醇0. 05-0. 5 %、甘露醇2-5 %、麦芽糖1-3 %，其中的百分比均为质量体积百分比。
[0009] 优选地，其它稳定剂的加入量为：牛血清白蛋白0. 2%、氯化巧12. 5mM、聚乙二醇 0. 2%、甘露醇2%、麦芽糖1. 5%。
[0010] 进一步优选地，所述凝血酶时间测定试剂的抑为7. 2-7. 5,优选7. 3。
[0011] 上述凝血酶时间测定试剂的制备过程包括，配制50mM的Tris缓冲液，调节抑至 中性，向该缓冲液中加入稳定剂，混合均匀后，添加牛凝血酶，混匀即得凝血酶时间测定试 剂。
[0012] 上述凝血酶时间测定试剂的制备过程包括，先配制50mM的Tris缓冲液，其中含 lOOmM的氯化钢，调节pH值为7. 2-7. 5,向该缓冲液中添加牛血清白蛋白0. 05-0. 5%、鄉氨 酸0. 5-2. 5%、氯化巧8-12. 5mM、聚乙二醇0. 05-1 %、甘露醇2-5%、麦芽糖1-3%和香豆酸 0.l-4mM，将该混合液充分揽拌均匀后，添加牛凝血酶5-10U/mU混匀即得凝血酶时间测定 试剂。
[001引与现有的凝血酶时间测定试剂相比，本发明试剂有如下优势：（1)采用香豆酸作 为抗氧化剂，香豆酸中含有邻苯二酪结构，邻苯二酪结构具有很强的金属离子垫合能力，从 而降低了二价金属离子对氧化反应的催化作用；同时，香豆酸中的邻苯二酪结构能够与过 氧自由基发生反应，从而终止蛋白质过氧化链反应，从而进一步提升了试剂的稳定性能。 (2)在制备凝血试剂的过程中，所用原料中的少量重金属离子，会导致活化部分凝血酶时间 测定试剂不稳定，香豆酸与其它抗氧化剂共同使用时可W增强对金属离子的馨合效果，比 如香豆酸可与鄉氨酸一起，起到类似邸TA钢盐或钟盐对金属离子的馨合作用。（3)剔除了 一般稳定剂中毒性较大的组份，选用香豆酸替代常用的叠氮酸钢，凝血酶时间测定试剂的 生产和使用过程更安全。（4)去掉叠氮酸钢后，用W提升试剂稳定性的多糖或多醇类聚合物 用量减少甚至完全不用，大大提高了采用光学法测定的凝血酶时间值的准确度。（5)在一般 稳定剂的基础上，配合鄉氨酸和香豆酸共同作用，凝血酶时间测定试剂的稳定性也更高。
【具体实施方式】
[0014] 下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。 阳〇1引实施例1
[0016] 称取6.2gTris、2.5g氯化钢，加入体积为1.化的玻璃瓶中，加去离子水至500mL， 揽拌溶解，用稀盐酸调节至pH为7. 3,加入2g牛血清白蛋白、1. 4g氯化巧、2g聚乙二醇、15g 甘露醇、lOg麦芽糖、0.5g叠氮酸钢，经充分混合均匀后，定容至1L，加入牛凝血酶，使牛凝 血酶浓度为抓/ml,经揽拌混匀后，即得凝血酶时间测定试剂。
[0017] 实施例2
[0018] 称取6. 2gTris、2. 5g氯化钢，加入体积为1.化的玻璃瓶中，加去离子水至500mL， 揽拌溶解，用稀盐酸调节至抑为7. 3,加入1. 5g牛血清白蛋白、1. 4g氯化巧、2g聚乙二醇、 15g甘露醇、lOg麦芽糖、0. 5g叠氮酸钢、lOg鄉氨酸，经充分混合均匀后，定容至1L，加入牛 凝血酶，使牛凝血酶浓度为抓/ml,经揽拌混匀后，即得凝血酶时间测定试剂。
[0019] 实施例3
[0020] 称取6. 2gTris、2.5g氯化钢，加入体积为1.化的玻璃瓶中，加去离子水至500mL， 揽拌溶解，用稀盐酸调节至pH为7. 3,加入1. 5g牛血清白蛋白、1. 4g氯化巧、2g聚乙二醇、 15g甘露醇、lOg麦芽糖、lOg鄉氨酸、2mM香豆酸，经充分混合均匀后，定容至1L，加入牛凝血 酶，使牛凝血酶浓度为抓/ml,经揽拌混匀后，即得凝血酶时间测定试剂。
[0021] 对实施例1、实施例2和实施例3所得试剂，分别进行2-8°C稳定性和37°C条件下 稳定性实验。
[0022] 1)2-8°C条件下稳定性实验
[0023] 将实施例1、实施例2和实施例3配制的凝血酶时间测定试剂，用CA1500全自动 血凝仪对正常人新鲜血浆的凝血酶时间进行测定。具体地，将实施例1、实施例2和实施例 3制备的立种凝血酶时间测定试剂，在2-8°C条件下保存，每月定时取样一次，连取12个月， 检测=种试剂的凝血酶时间，结果见表1。
[0024] 表1不同组份凝血酶时间测定试剂的检测结果单位：秒 阳0巧]
[0027] 上述结果表明，增添鄉氨酸后的凝血酶时间测定试剂的稳定性增强，而用香豆酸 替代叠氮酸钢后，凝血酶时间测定试剂的稳定性进一步提升。说明鄉氨酸与香豆酸发挥了 共同作用特点，抗氧化性能相互促进，组合效果既优于各自作用效果，也明显优于鄉氨酸与 叠氮酸钢的组合。
[0028] 2)37°C条件下稳定性实验
[0029] 将实施例1、实施例2和实施例3配制的凝血酶时间测定试剂，用CA1500全自动 血凝仪对正常人新鲜血浆的凝血酶时间进行测定。具体地，将实施例1、实施例2和实施例 3制备的=种凝血酶时间测定试剂，在37°C条件下保存，每天定时取样一次，连取1个月，检 测=种试剂的凝血酶时间，结果见表2。
[0030] 表2 37°C条件下不同组份凝血酶时间测定试剂的检测结果单位：秒
[0031]
[0032] 上述结果表明，在37°C条件下，增添鄉氨酸后的凝血酶时间测定试剂的稳定性增 强，而用香豆酸替代叠氮酸钢后，凝血酶时间测定试剂的稳定性进一步提升。说明鄉氨酸与 香豆酸发挥了共同作用特点，抗氧化性能相互促进，组合效果既优于各自作用效果，也明显 优于鄉氨酸与叠氮酸钢的组合。
【主权项】
1. 一种凝血酶时间测定试剂，其特征在于，组分包括：牛凝血酶和稳定剂，所述的稳定 剂为缬氨酸和香豆酸，所述缬氨酸的加入量为质量体积比0. 5-2. 5%，所述香豆酸的加入量 为 0?l-4mM〇2. 根据权利要求1所述的凝血酶时间测定试剂，其特征在于，缬氨酸的加入量为质量 体积比1 %、香豆酸的加入量为2mM。3. 根据权利要求1所述的凝血酶时间测定试剂，其特征在于，所述牛凝血酶的用量为 5-10U/mL〇4. 根据权利要求1或3所述的凝血酶时间测定试剂，其特征在于，组分中还包括其它稳 定剂，包括：牛血清白蛋白、氯化钙、聚乙二醇、甘露醇、麦芽糖中的一种或几种。5. 根据权利要求4所述的凝血酶时间测定试剂，其特征在于，所述其它稳定剂的加入 量为：牛血清白蛋白0. 05-0. 5%、氯化钙8-12. 5mM、聚乙二醇0. 05-0. 5%、甘露醇2-5%、麦 芽糖1-3%，其中的百分比均为质量体积百分比。6. 根据权利要求4所述的凝血酶时间测定试剂，其特征在于，所述其它稳定剂的加入 量为：牛血清白蛋白0.2%、氯化钙10mM、聚乙二醇0.2%、甘露醇2%、麦芽糖1.5%，其中 的百分比均为质量体积百分比。7. 根据权利要求1或3所述的凝血酶时间测定试剂，其特征在于，试剂的pH为 7. 2-7. 5。8. 根据权利要求1或3所述的凝血酶时间测定试剂，其特征在于，试剂的pH为7. 3。9. 根据权利要求1或3所述的凝血酶时间测定试剂的制备方法，其特征在于，过程如 下：配制50mM的Tris缓冲液，调节pH至中性，向该缓冲液中加入稳定剂，混合均匀后，添加 牛凝血酶，混匀即得凝血酶时间测定试剂。10. 根据权利要求1所述的凝血酶时间测定试剂的制备方法，其特征在于，过程如下： 先配制50mM的Tris缓冲液，其中含IOOmM的氯化钠，调节pH值为7. 2-7. 5,向该缓冲液中 添加牛血清白蛋白0. 05-0. 5%、缬氨酸0. 5-2. 5%、氯化钙8-12. 5mM、聚乙二醇0. 05-1%、 甘露醇2-5%、麦芽糖1-3%和香豆酸0.l-4mM，将该混合液充分搅拌均匀后，添加牛凝血酶 5-10U/mL，混匀即得凝血酶时间测定试剂。
【专利摘要】本发明涉及一种凝血酶时间测定试剂，组分包括：牛凝血酶和稳定剂，所述的稳定剂为缬氨酸和香豆酸，所述缬氨酸的加入量为质量体积比0.5-2.5％，所述香豆酸的加入量为0.1-4mM。上述凝血酶时间测定试剂的制备过程包括，配制50mM的Tris缓冲液，调节pH至中性，向该缓冲液中加入稳定剂，混合均匀后，添加牛凝血酶，混匀即得凝血酶时间测定试剂。本发明试剂选用缬氨酸和香豆酸替代常用的叠氮酸钠作为稳定剂，凝血酶时间测定试剂生产和使用过程更安全、且试剂的稳定性也更高。
【IPC分类】G01N33/86
【公开号】CN105181978
【申请号】CN201510611775
【发明人】胡小伟, 黄翔宇, 王 华
【申请人】青岛古高生物科技有限公司
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年9月23日
【公告号】CN105181978B