R-苯甲酸阿格列汀光学纯度的测定方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种R-苯甲酸阿格列汀光学纯度的测定方法。
【背景技术】
[0002] 苯甲酸阿格列汀，化学名为2-[[6-[(3R)-3-氨基-1-哌啶基]-3, 4-二氢-3-甲 基-2, 4-二氧代-1(2H)_嘧啶基]甲基]苯甲腈苯甲酸盐，是新型的二肽基肽酶-IV (DPP-IV)抑制剂，用于治疗II型糖尿病，结构式见式1。
[0003]式1
R-苯甲酸阿格列汀的合成是以3-甲基-6-氯尿嘧啶与2-溴甲基苄腈反应生 成2-[(6-氯-3, 4-二氢-3-甲基-2, 4-二氧代-1 (2H)-嘧啶基）甲基]苯甲腈， 2_ [ (6-氯-3, 4-二氢-3-甲基-2, 4-二氧代-1 (2H)-嘧啶基）甲基]苯甲腈再与R-3-氨 基哌啶双盐酸盐反应生成R-阿格列汀，R-阿格列汀再与苯甲酸成盐得到的R-苯甲酸阿格 列汀。
[0004]目前，R-苯甲酸阿格列汀的光学纯度是通过测定旋光度，计算ee值进行描述。旋 光度的测定除了受偏振光波长、溶液的浓度、温度、溶剂等因素影响外，还受旋光性的杂质 影响。因此通过测定旋光度计算ee值的方法来测定R-苯甲酸阿格列汀的光学纯度有较大 的误差，可信度不够高。
[0005] 随着手性液相分离技术的发展，高效液相色谱法已经成为能够准确测定物质光学 纯度的可靠的方法。但是R-苯甲酸阿格列汀的手性分离方法尚没有公开的文献方法。究 其原因，是由于其手性中心能够与手性色谱柱填料产生氢键、偶极_偶极或空间作用的作 用力较小，常规手性色谱柱的分离效能较低，无法实现有效的分离。为了有效的控制产品质 量，迫切的需要一种快速、准确的检测方法。
[0006] 本发明的目的：为了解决分离效能较低这一问题，我们开发了采用添加离子对的 流动相的手性色谱法测定R-苯甲酸阿格列汀光学纯度的方法。该方法是利用在流动相中 添加离子对，使离子对与手性填料先作用，改变了手性填料对R-苯甲酸阿格列汀与S-苯甲 酸阿格列汀的键合作用，从而提高了R-苯甲酸阿格列汀与S-苯甲酸阿格列汀之间的分离 效能，实现了用手性色谱法进行光学纯度的测定，首次创新性地解决了R-苯甲酸阿格列汀 光学纯度测定这一技术难题。
【发明内容】
[0007] 本发明的技术方案： 一种R-苯甲酸阿格列汀光学纯度的测定方法，其特征在于， 弟一步制备对照品和供试品洛液： R，S-苯甲酸阿格列汀对照品溶液：分别精密称取R-苯甲酸阿格列汀对照品、S-苯甲酸 阿格列汀对照品各适量，置同一容量瓶中，加无水乙醇稀释制成每lml约含R-苯甲酸阿格 列汀0. 2mg和S-苯甲酸阿格列汀0. 5mg的溶液； S-苯甲酸阿格列汀对照品溶液：精密称取S-苯甲酸阿格列汀对照品适量，加无水乙醇 定量稀释制成每lml约含0. 2mg的溶液； R-苯甲酸阿格列汀对照品溶液：精密称取R-苯甲酸阿格列汀对照品适量，加无水乙醇 定量稀释制成每lml约含0. 2mg的溶液； R-苯甲酸阿格列汀供试品溶液：精密称取R-苯甲酸阿格列汀供试品适量，加无水乙醇 定量稀释制成每lml约含0. 5mg的溶液； 第二步R-苯甲酸阿格列汀光学纯度色谱条件准备及检测 色谱条件：色谱系统为高效液相色谱仪，色谱柱填料为直链淀粉-三（3, 5-二甲苯基氨 基甲酸酯)，即AD-H手性色谱柱（250_X4. 6mm, 5 y m);流速：0. 8ml/min，柱温：25°C，检测 波长：278nm，进样量20耵， 流动相为正己烷：〇. 2%三氟乙酸和0. 1%二乙胺的乙醇溶液=80:20,配制后经0. 20Mm 有机膜过滤，超声脱气； 首先分别对R，S-苯甲酸阿格列汀对照品溶液与S-苯甲酸阿格列汀对照品溶液进样， 进行系统适应性分析，再对R-苯甲酸阿格列汀供试品溶液进行光学纯度测定，按面积归一 化法计算样品的光学纯度。
[0008] 系统适应性试验： R，S-苯甲酸阿格列汀达到了基线分离，分离度约2. 0,见说明书附图3,与S-苯甲酸阿 格列汀对照品色谱图（说明书附图4)对比，确定RT=8. 733为S构型，RT=10. 700为R构型。
[0009] 本发明技术方案中，所述R-苯甲酸阿格列汀对照品与S-苯甲酸阿格列汀对照品 的确认： 色谱条件：色谱系统为高效液相色谱仪，色谱柱填料为十八烷基硅烷键合硅胶（250_ X4. 6mm, 5 y m)，流速：1.0ml/min，柱温：25°C，检测波长：278nm，进样量2〇Ml，流动相：乙 腈为流动相A，含0. 2%的三乙胺水溶液(用20%磷酸调节pH值约为6. 4)为流动相B，按下 表程序进行梯度洗脱：
纯度测定：分别精密称取R-苯甲酸阿格列汀对照品与S-苯甲酸阿格列汀对照品适量， 加乙腈定量稀释制成每lml约含0. 5mg的溶液，进样检测，按峰面积归一化法计算纯度，纯 度应大于99. 0%; 有益效果：本发明通过在流动相中添加离子对，使离子对与手性填料先作用，改变了手 性填料对R-苯甲酸阿格列汀与S-苯甲酸阿格列汀的键合作用，从而提高了R-苯甲酸阿格 列汀与S-苯甲酸阿格列汀之间的分离效能，使苯甲酸阿格列汀的一对对映异构体在AD-H 手性色谱柱上完全分离。首次创新性地建立了在流动相中添加离子对的手性色谱法测定 R-苯甲酸阿格列汀的光学纯度的方法，为R-苯甲酸阿格列汀的光学纯度的准确检测提供 了保障。
[0010]
【附图说明】： 图1:RS-苯甲酸阿格列汀纯度测定色谱图。
[0011] 图2:RS-苯甲酸阿格列汀色谱峰光谱图。
[0012] 图3:RS_苯甲酸阿格列汀光学纯度测定色谱图。
[0013] 图4:S_苯甲酸阿格列汀光学纯度测定色谱图。
[0014] 图注：EP/JP表示欧洲药典和日本药典高效液相色谱法分离度计算方法。
[0015] 实施例1 R-苯甲酸阿格列汀样品的光学纯度的测定 仪器与试剂：高效液相色谱仪（日本日立公司；赛默飞世尔科技有限公司）；C18色谱柱 (250mmX4. 6mm, 5ym;赛默飞世尔科技有限公司）；AD-H手性色谱柱（250mmX4. 6mm, 5ym; 大赛璐药物手性技术有限公司）;恒温水浴锅(江苏金坛科兴仪器厂）；电子恒速搅拌器(上海 申生科技有限公司）。
[0016] 正己烷(色谱纯，天津市彪士奇科技有限公司）；无水乙醇(色谱纯，天津市彪士奇 科技有限公司）;三氟乙酸(色谱纯，阿拉丁试剂公司）;二乙胺(分析纯，天津广成化学试剂有 限公司）；R-苯甲酸阿格列汀对照品（纯度3 99. 9%，迪沙药业集团药物研究院）；S-苯甲酸 阿格列汀对照品（纯度3 99. 0%，迪沙药业集团药物研究院)。
[0017] 按技术方案所述检测方法检测R-苯甲酸阿格列汀的光学纯度。
【主权项】
1. 一种R-苯甲酸阿格列汀光学纯度的测定方法，其特征在于， 第一步制备对照品和供试品溶液： R，S-苯甲酸阿格列汀对照品溶液；分别精密称取R-苯甲酸阿格列汀对照品、S-苯甲酸 阿格列汀对照品各适量，置同一容量瓶中，加无水己醇稀释制成每Iml约含R-苯甲酸阿格 列汀0. 2mg和S-苯甲酸阿格列汀0. 5mg的溶液； S-苯甲酸阿格列汀对照品溶液：精密称取S-苯甲酸阿格列汀对照品适量，加无水己醇 定量稀释制成每Iml约含0. 2mg的溶液； R-苯甲酸阿格列汀对照品溶液：精密称取R-苯甲酸阿格列汀对照品适量，加无水己醇 定量稀释制成每Iml约含0. 2mg的溶液； R-苯甲酸阿格列汀供试品溶液：精密称取R-苯甲酸阿格列汀供试品适量，加无水己醇 定量稀释制成每Iml约含0. 5mg的溶液； 第二步R-苯甲酸阿格列汀光学纯度色谱条件准备及检测： 色谱条件：色谱系统为高效液相色谱仪，色谱柱填料为直链淀粉-H(3, 5-二甲苯基氨 基甲酸醋)，即AD-H手性色谱柱250mmX4. 6mm，5Um;流速；0. 8ml/min，柱温；25°C，检测波 长；278nm，进样量20W, 流动相为正己焼：0. 2%H氣己酸和0. 1%二己胺的己醇溶液=80 ;20,配制后经0. 20化 有机膜过滤，超声脱气； 首先分别对R，S-苯甲酸阿格列汀对照品溶液与S-苯甲酸阿格列汀对照品溶液进样， 进行系统适应性分析，再对R-苯甲酸阿格列汀供试品溶液进行光学纯度测定，按面积归一 化法计算样品的光学纯度。2. 权利要求1所述R-苯甲酸阿格列汀对照品与S-苯甲酸阿格列汀对照品，其特征在 于，按W下方法确认： 色谱条件：色谱系统为高效液相色谱仪，色谱柱填料为十八烷基娃焼键合硅胶 250mmX4. 6mm，5ym，流速；1.Oml/min，柱温；25°C，检测波长；278皿，进样量20W，流动相： 己腊为流动相A，抑值约为6. 4的0. 2%的H己胺水溶液为流动相B，按下表程序进行梯度 洗脱：纯度测定：分别精密称取R-苯甲酸阿格列汀对照品与S-苯甲酸阿格列汀对照品适量， 加己腊定量稀释制成每Iml约含0. 5mg的溶液，进样检测，按峰面积归一化法计算纯度，纯 度应大于99. 0%。
【专利摘要】本发明涉及一种R-苯甲酸阿格列汀光学纯度的测定方法。本发明的技术方案是：色谱系统为高效液相色谱仪，色谱柱填料为直链淀粉-三（3,5-二甲苯基氨基甲酸酯），流速：0.8ml/min，柱温：25℃，检测波长：278nm，进样量20μl，其流动相为：正己烷:含有0.2%三氟乙酸和0.1%二乙胺的乙醇溶液=80:20，首先分别对R,S-苯甲酸阿格列汀对照品溶液与S-苯甲酸阿格列汀对照品溶液进样，进行系统适应性分析，再对R-苯甲酸阿格列汀供试品溶液进行光学纯度测定，按面积归一化法计算样品的光学纯度。
【IPC分类】G01N30/88
【公开号】CN105203678
【申请号】CN201510402633
【发明人】张曼玉, 付婷婷
【申请人】迪沙药业集团有限公司, 威海迪素制药有限公司
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2015年7月10日