一种用于检测眼病的试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于检测眼病的试剂盒及其检测方法。
【背景技术】
[0002] 甲状腺相关眼病（thyroid associated ophthalmopathy, ΤΑ0)是内分泌科常见 疾病之一，也是目前世界上治疗最为困难的疾病之一。ΤΑ0病程较长，各年龄段均可发生， 以女性多发。轻者可影响生活、工作质量，损伤外貌，重者可导致视力下降，甚至失明，给患 者带来了沉重的经济及心理负担。近年来，由于生活方式的改变，工作压力的增加，社会环 境状况的变化，食用加碘盐的普及，以及不正规用药等因素，ΤΑ0的发病率明显上升，住院率 高。目前由于本病原因未明，临床主要以激素、免疫抑制剂、生长激素类似物、抗甲状腺药 物、眶内放射、眼眶减压术等综合治疗为主，但由于种种原因，效果并不尽人意，迄今为止尚 无任何一种药物能有效治疗ΤΑ0,并获长期缓解。因此，研究治疗甲状腺相关眼病的药物是 亟待解决的技术问题。而检测所述疾病更是本领域积极研究的方向。
[0003]近年来的研究表明，细胞间粘附分子-1的表达与自身免疫甲状腺病免疫病理过 程密切相关。甲状腺炎患者的甲状腺组织内浸润淋巴细胞、内皮细胞的sICAM-1和sICAM-1 表达异常活跃。另外，发现伴有突眼的患者血清sICAM-1水平异常增高，这是因为患者眼球 后组织强烈表达sICAM-1，所以血清sICAM-1升高的水平多与眶周炎症浸润程度密切相关。 此外，研究还发现，在药物的治疗过程中，甲状腺功能和临床症状的好转与血清sICAM-1水 平的下降并不同步，往往甲状腺功能的恢复在很大程度上要早于sICAM-1的恢复。综上所 述，可溶性细胞间粘附分子-1的浓度变化可能对于判断GD的自身免疫紊乱水平、停药与否 和是否复发等具有重要意义。细胞间粘附分子-1的表达与甲状腺相关眼病有直接关联，因 此，检测细胞间粘附分子-1的表达情况，可以直接用于鉴定甲状腺相关眼病。然而传统的 检测细胞间粘附分子-1的表达情况具有操作复杂，费时的缺点。
[0004] 核酸适体（Aptamer,又称适配体，适配子)是能高亲和性、高特异性的结合某种生 物革E1标的单链寡核酸分子（ssDNA或ssRNA)。核酸适体是通过指数富集配体系统进化技 术（Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment, SELEX)从人工合 成的DNA/RNA文库中筛选得到的能够高度特异性结合靶标分子的单链DNA/RNA。已报道核 酸适体的靶标包括金属离子、有机小分子、多肽、蛋白质、细胞甚至组织等。核酸适体的分子 识别功能与抗体类似，具有与抗体分子相当甚至更强的靶标识别能力，但与抗体相比具有 很多优良的特性，如分子量小，能批量生产，不易失活，无免疫原性、容易合成与标记、快速 的穿透组织、良好的代谢动力学、不同批次之间产品不会存在差异和具有很好化学稳定性， 在生物检测、疾病诊断治疗等领域具有重要的应用前景。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种特异结合sICAM-1的核酸适体及其试剂盒。
[0006]本发明提供的核酸适体，是序列表的序列1-15所示的单链DNA。
[0007] 所述核酸适体与sICAM-1蛋白具有较好的亲和能力。
[0008] 还可将所述核酸适体进行修饰或改造，得到所述核酸适体的衍生物。
[0009] 所述核酸适体的衍生物可为如下任意一种： a) 将所述核酸适体删除部分或增加部分互补的核苷酸，得到的与所述核酸适体具有相 同功能的核酸适体的衍生物； b) 将所述核酸适体进行核苷酸取代或部分修饰，得到的与所述核酸适体具有相同功能 的核酸适体的衍生物； c) 将所述核酸适体的骨架改造为硫代磷酸酯骨架，得到的与所述核酸适体具有相同功 能的核酸适体的衍生物； d) 将核酸适体改造为肽核酸，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生 物； e) 将所述核酸适体连接上荧光、放射性和治疗性物质后，得到的与所述核酸适体具有 相同功能的核酸适体的衍生物。
[0010] 所述核酸适体可用于制备检测SICAM-1的试剂盒。
[0011] 利用本发明的核酸适体，可以捕获血液中的sICAM-1，从而用于甲状腺相关眼病筛 查。利用本发明的核酸适体，部分代替单克隆抗体捕获sICAM-1进行检测，具有高灵敏、成 本低、易制备、易保存的优点。本发明具有很高的应用价值。
【具体实施方式】
[0012] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0013] 实施例1、核酸适体的筛选和制备 设计两端包含大约20个核苷酸、中间包括39个核苷酸的随机核酸文库如下： 5' -ACGACTAACGTGTMCAG (N39) CAGTGCATGATGCTACGAA-3' ；N39 代表 39 个随机核苷 酸。
[0014] 将单链DNA文库扩增为双链DNA，产物经2%琼脂糖凝胶电泳并切胶回收纯化；以 回收的双链DNA为模板，体外转录出单链RNA随机文库，转录产物经PAGE纯化。75 μ g RNA 文库经硝酸纤维素膜反筛去除与膜结合的RNA分子，然后与2ug sICAM-1蛋白（通过陈志 鸿等，人细胞间黏附分子-1的真核细胞表达与鉴定中公开的方法，表达得到的目的蛋白）， 37° C孵育30min，反应液经硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜；然后将滤膜剪碎，置于洗脱缓冲 液（6mol/L 尿素，0. 55mol/L 醋酸铵，1.5mmol/LEDTA，0. 15%SDS)中煮沸 5min，离心，取 上清，无水乙醇沉淀RNA，并重新溶解于20 μ 1 DEPC水中；以RNA为模板RT-PCR扩增双链 DNA，体外转录出RNA文库用于下一轮筛选；每轮筛选过程中RT-PCR得到双链DNA文库，以 该双链DNA为模板体外转录出RNA适配子库，筛选共进行10轮。得到了 15个适配子，其序 列分别为SEQ ID Ν0:1-15所示。具体序列如下所示： sICAM-1-1 ：ACGACTAACGTGTAACAGTCCAAGTATTCATACATACCATAAATTCATTGTCATTAA CAGTGCATGATGCTACGAA (SEQ ID N0:1) sICAM-1-2 ：ACGACTAACGTGTAACAGCAGACACCATATATACTATCTACTACCACATACCTCTAC CAGTGCATGATGCTACGAA (SEQ ID NO:2) sICAM-1-3 ：ACGACTAACGTGTAACAGCTAACTTCTTATAACTTAAGATACTTCTTCCAAACAACA CAGTGCATGATGCTACGAA (SEQ ID NO:3) sICAM-1-4 ：ACGACTAACGTGTAACAGTACATCACTCTAATCTTCACGCCTCAGTTACATTCCCTT CAGTGCATGATGCTACGAA (SEQ ID NO:4) sICAM-1-5 ：ACGACTAACGTGTAACAGATGTATATTCCTTATATGACTATAATTCTTACCTATAAA CAGTGCATGATGCTACGAA (SEQ ID NO:5) sICAM-1-6 ：ACGACTAACGTGTAACAGACCTCTATCTCACTCTTCCCTTTCGCCTACACATCCGAA CAGTGCATGATGCTACGAA (SEQ ID NO:6) sICAM-1-7 ：ACGACTAACGTGTAACAGAGATTCACTAATATTTCTTCGCCTCGCCATACTTAAGAT CAGTGCATGATGCTACGAA (SEQ ID NO:7) sICAM-1-8 ：ACGACTAACGTGTAACAGTACCCATCCACCTTCTTACTACTGCTCTCTCAATCTACA CAGTGCATGATGCTACGAA (SEQ ID NO:8) sICAM-1-9 ：ACGACTAACGTGTAACAGACAGATACATTCATATCAAGTTACACATCTCCATGTTAA CAGTGCATGATGCTACGAA (SEQ ID NO:9) sICAM-1-10： ACGACTAACGTGTAACAGCAGAACACAAATCTATACAAATCAGCATCACACTCATAC CAGTGCATGATGCTACGAA (SEQ ID NO:10) sICAM-1-11： ACGACTAACGTGTAACAGATACCAATCGCCACCTACACTTACATCTAGACACTCTAT CAGTGCATGATGCTACGAA (SEQ ID NO:11) sICAM-1-12： ACGACTAACGTGTAACAGTATCTACACATAGATCCTCCACTTAATAACAATCTGTCA CAGTGCATGATGCTACGAA (SEQ ID NO:12) sICAM-1-13： ACGACTAACGTGTAACAGATACCTCATCAGATATTACATTCGCCAATATTTCTCTAT CAGTGCATGATGCTACGAA (SEQ ID NO:13) sICAM-1-14： ACGACTAACGTGTAACAGTCTATAACGCCTAACTACACCACTCCACTCATTATAATA CAGTGCATGATGCTACGAA (SEQ ID NO:14) sICAM-1-15： ACGACTAACGTGTAACAGATCTATTTCACCATTAAGAACCATATCGCATCACCCTTC CAGTGCATGATGCTACGAA (SEQ ID NO:15) 实施例2 sICAM-1蛋白结合适配子的性能测定 将RNA适配子分别取2. Ομg，用牛小肠碱性磷酸酶（CIP) 37° C消化lh，纯化回 收去磷酸化的RNA ;通过T4多核苷酸激酶标记[γ -32P]ATP于去磷酸化的RNA分子末 端。lOnmol放射性标记的RNA适配子分别与不同浓度（1-200ηΜ)的sICAM-1 37° C孵育 30min，各组反应液经硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜，干燥滤膜，液闪计数仪测定滤膜上残留 的放射量，同一样品平行做两次测定。计算各个适配子与sICAM-1的解离常数。结果如下：
实施例3所述适配子特异性分析以及稳定性分析 分别采用人血白蛋白，免疫血清球蛋白，霍乱弧菌VgrG3C蛋白，大肠杆菌外膜蛋白A， Lp-PLA2蛋白，与15条适配子进行特异性检测，经过结合试验发现，这些适配子都不与这些 蛋白相结合，而只与sICAM-1结合保持较高的特异性。
[0015] 将所述的适配子，取0.2ug，分别置于常温的血清、水溶液中，放置二周。通过 RT-PCR检测，发现二周的放置其结构稳定，没有被降解。
[0016] 实施例4所述适配子疾病的诊断 将15个适配子分别与10个甲状腺相关眼病患者以及正常人的血液混合30min，通过生 物素分离，定量分析其中的sICAM-1蛋白的含量，通过分析发现，10个甲状腺相关眼病患者 中sICAM-1蛋白的含量相对于正常人显著增加。
[0017] 以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人 员来说，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本 发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种用于眼病检测的试剂盒，其特征在于：包含核酸适体。2. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述核酸适体为SEQIDNo:1-15任一所 述。 3. SEQIDNo:1-15任一所述的适体在制备检测眼病的试剂盒中的应用。4. 一种检测眼病的方法，其特征在于利用权利要求1所述的试剂盒。5. 如权利要求1-2所述的试剂盒，其特征在于：所述眼病为甲状腺相关眼病。6. 如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述眼病为甲状腺相关眼病。
【专利摘要】本发明公开了一种特异结合sICAM-1的核酸适体及试剂盒。本发明提供的核酸适体，与sICAM-1具有较好的亲和能力。利用本发明的核酸适体，可以捕获溶液中的sICAM-1，将其制备成为相应的试剂盒，将用于眼病的筛查。利用本发明的试剂盒，具有高灵敏、成本低的特点，适合大规模的筛查。
【IPC分类】G01N33/68
【公开号】CN105334327
【申请号】CN201510723711
【发明人】李倩
【申请人】李倩
【公开日】2016年2月17日
【申请日】2015年11月1日