一种唇癌特异性检测的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于检测唇癌的试剂盒及其检测方法。
【背景技术】
[0002] 唇癌是指发生于上下口唇的恶性肿瘤为口腔常见恶性肿瘤之一，在口腔癌中占第 立位，占全身恶性肿瘤的〇. 1 %~〇. 5%，占口腔恶性肿瘤的7. 1 %~15. 0%，欧美国家唇 癌患者较多，占口腔癌的20 %~30 %。一般下唇比上唇易受累，约90 %~95 %发生在下 唇红缘部，而且W下唇的外1 / 3处为多见。男性患者居多，男女之比为7:1。高发年龄为 50~70岁。唇癌绝大多数为高分化之鱗状细胞癌，多在良性费生物的病变基础上发生，其 生长速度较慢，预后较好，一般5年生存率为70 % W上，本病的病因可能与局部长期受异 物刺激，强烈的紫外线照射有关。口唇上皮角化、白斑、巧费、肉芽肿及裂口等长期不愈，亦 可导致癌变。
[0003] 现有技术已知，唾液富含半脫氨酸分泌蛋白1浓度为10_40ng即可诊断为唇癌。因 此，检测半脫氨酸分泌蛋白1的浓度变得极为重要。
[0004] 核酸适体（Aptamer,又称适配体，适配子)是能高亲和性、高特异性的结合某种生 物革E1标的单链寡核酸分子（ssDNA或ssRNA)。核酸适体是通过指数富集配体系统进化技 术（Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment, SELEX)从人工合 成的DNA/RNA文库中筛选得到的能够高度特异性结合靶标分子的单链DNA/RNA。已报道核 酸适体的靶标包括金属离子、有机小分子、多肽、蛋白质、细胞甚至组织等。核酸适体的分子 识别功能与抗体类似，具有与抗体分子相当甚至更强的靶标识别能力，但与抗体相比具有 很多优良的特性，如分子量小，能批量生产，不易失活，无免疫原性、容易合成与标记、快速 的穿透组织、良好的代谢动力学、不同批次之间产品不会存在差异和具有很好化学稳定性， 在生物检测、疾病诊断治疗等领域具有重要的应用前景。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种特异结合CRISP1的核酸适体及其试剂盒。
[0006] 本发明提供的核酸适体，是序列表的序列1-15所示的单链DNA。
[0007] 所述核酸适体与CRISP1蛋白具有较好的亲和能力。
[0008] 还可将所述核酸适体进行修饰或改造，得到所述核酸适体的衍生物。
[0009] 所述核酸适体的衍生物可为如下任意一种： a) 将所述核酸适体删除部分或增加部分互补的核苷酸，得到的与所述核酸适体具有相 同功能的核酸适体的衍生物； b) 将所述核酸适体进行核苷酸取代或部分修饰，得到的与所述核酸适体具有相同功能 的核酸适体的衍生物； c) 将所述核酸适体的骨架改造为硫代磷酸酯骨架，得到的与所述核酸适体具有相同功 能的核酸适体的衍生物； d) 将核酸适体改造为肽核酸，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生 物； e) 将所述核酸适体连接上荧光、放射性和治疗性物质后，得到的与所述核酸适体具有 相同功能的核酸适体的衍生物。
[0010] 所述核酸适体可用于制备检测CRISP1的试剂盒。
[0011] 利用本发明的核酸适体，可以捕获中唾液中的中的CRISP1，从而用于相关口腔癌 筛查。利用本发明的核酸适体，具有高灵敏、成本低、易制备、易保存的优点。本发明具有很 高的应用价值。
【具体实施方式】
[0012] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0013] 实施例1、CRISP1蛋白的获得 将Genbank :EAX04350所示的CRISP1基因通过本领域常规的真核表达方式进行表达， 获得了相应的目的多肽蛋白。
[0014] 实施例2核酸适体的筛选和制备 设计两端包含大约20个核苷酸、中间包括41个核苷酸的随机核酸文库如下： 5 '-TGGCACCTACGATCTAAGGCA(N41)GGACTACCAATGCAACGTCAC -3'；N41 代表 41 个随机 核苷酸。
[0015] 将单链DNA文库扩增为双链DNA，产物经2%琼脂糖凝胶电泳并切胶回收纯化；以 回收的双链DNA为模板，体外转录出单链RNA随机文库，转录产物经PAGE纯化。75 μ g RNA 文库经硝酸纤维素膜反筛去除与膜结合的RNA分子，然后与2ug CRISP1蛋白，37° C孵育 30min，反应液经硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜；然后将滤膜剪碎，置于洗脱缓冲液（6mol/L 尿素，0. 55mol/L醋酸铵，1.5mmol/L EDTA，0. 15% SDS)中煮沸5min，离心，取上清，无水乙 醇沉淀RNA，并重新溶解于20 μL DEPC水中；以RNA为模板RT-PCR扩增双链DNA，体外转 录出RNA文库用于下一轮筛选；每轮筛选过程中RT-PCR得到双链DNA文库，以该双链DNA为 模板体外转录出RNA适配子库，筛选共进行12轮。得到了 15个适配子，其序列分别为SEQ ID Ν0:1-15所示。具体序列如下所示： CRISP1-1 ： TGGCACCTACGATCTAAGGCAATCCCATATATGTTCCACACACTCGCAACTTATCCGCTACA GGACTACCAATGCAACGTCAC CRISP1-2 ：TGGCACCTACGATCTAAGGCATTCCGCCATAAATAAGATTCACATCACGACATCGATCACAC GGACTACCAATGCAACGTCAC CRISP1-3 ：TGGCACCTACGATCTAAGGCACTTAATCAACATATCTCTTCTGTATTCTCTCCACGCATACA GGACTACCAATGCAACGTCAC CRISP1-4 ：TGGCACCTACGATCTAAGGCAACGTCTCCAATCCGCACTTATAATTATGTTCTTACCTAAGA GGACTACCAATGCAACGTCAC CRISP1-5 ：TGGCACCTACGATCTAAGGCACGCTCATCACCATCTCCTACCTATATACATCACCTTCGCCT GGACTACCAATGCAACGTCAC CRISP1-6 ：TGGCACCTACGATCTAAGGCACATATCATCCTCCATACACGACCAACCACTCCGTCTTCACT GGACTACCAATGCAACGTCAC CRISP1-7 ：TGGCACCTACGATCTAAGGCAAACAAACACTCTCGCACATTACCTTATTTATCAAGAATATA GGACTACCAATGCAACGTCAC CRISP1-8 ：TGGCACCTACGATCTAAGGCACCGCTTATCTACACTAAATACAATTTCCTCCTCACCCTCCA GGACTACCAATGCAACGTCAC CRISP1-9 ：TGGCACCTACGATCTAAGGCACACGCCTCCAATATCAACTTAATAATACACCACTAATTTCT GGACTACCAATGCAACGTCAC CRISP1-10 ： TGGCACCTACGATCTAAGGCACACACGCCACTTATACAACAATCCAACCGCCTACCACTACT GGACTACCAATGCAACGTCAC CRISP 1-11：TGGCACCTACGATCTAAGGCATAGCATCACTACTCGCTATTTCCTATAATCCTAGCCTTATA GGACTACCAATGCAACGTCAC CRISP1-12 ： TGGCACCTACGATCTAAGGCACTAGAAACTCCAACACATACACACACAGACCCGCTCCATAA GGACTACCAATGCAACGTCAC CRI SP 1-13 ：TGGCACCTACGATCTAAGGCATCGCATAACGCTCCACAATATTAACATACTTCTCTTCTTAT GGACTACCAATGCAACGTCAC CRISP1-14 ： TGGCACCTACGATCTAAGGCATCATAATATTCGCTCACTCTAATCATACATTATCTTCTTGT GGACTACCAATGCAACGTCAC CRISP1-15 ：TGGCACCTACGATCTAAGGCAATAATATTCGCTCACTATAATCAACATTATCTTCTTGTTCT GGACTACCAATGCAACGTCAC 实施例3蛋白结合适配子的性能测定 将适配子分别取2.0 μ g，用牛小肠碱性磷酸酶（CIP) 37° C消化lh，纯化回收去磷 酸化的RNA ;通过T4多核苷酸激酶标记[γ -32P]ATP于去磷酸化的RNA分子末端。lOnmol 放射性标记的适配子分别与不同浓度（1_200ηΜ)的CRISP1 37° C孵育30min，各组反应液 经硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜，干燥滤膜，液闪计数仪测定滤膜上残留的放射量，同一样 品平行做两次测定。计算各个适配子与目的蛋白的解离常数。结果如下：
实施例4所述适配子特异性分析以及稳定性分析 分别采用人血白蛋白，免疫血清球蛋白，霍乱弧菌VgrG3C蛋白，大肠杆菌外膜蛋白A， COCH蛋白，CRISP1蛋白，与15条适配子进行特异性检测，经过结合试验发现，这些适配子都 不与这些蛋白相结合，而只与CRISP1蛋白结合保持较高的特异性。
[0016] 将所述的适配子，取0. 2ug，分别置于常温的血清、水溶液中，放置二周。通过 RT-PCR检测，发现三周的放置其结构稳定，没有被降解。
[0017] 实施例5所述适配子疾病的诊断 取9个唇癌患者和3个正常人的唾液分泌物，使用生理盐水稀释，获得目标样本。
[0018] 将15个偶联有标记的适配子分别与9个患者以及3个正常人的分泌物混合 30min，通过生物素分离，定量分析其中的CRISP1蛋白的含量，通过分析发现，9个口腔癌患 者中CRISP1蛋白的含量显著增加，超过了规定的阈值。达到了唇癌的诊断标准。由此可见， 其诊断效果较好。
[0019] 以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人 员来说，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本 发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种用于唇癌检测的试剂盒，其含有能特异性与CRISP1蛋白特异性结合的核酸适 体。2. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述核酸适体的序列如SEQIDNo:1-15 任一所述。3. -种检测唇癌的方法，其特征在于利用权利要求1-2任一项所述的试剂盒。
【专利摘要】本发明公开了一种特异性检测唇癌的试剂盒。本发明提供的核酸适体，与人富含半脫氨酸分泌蛋白1具有较好的亲和能力。利用本发明的核酸适体，可以捕获唾液中的富含半脫氨酸分泌蛋白1蛋白，通过其含量的变化来检测唇癌，将其制备成为相应的试剂盒，将用于唇癌的筛查。利用本发明的试剂盒，具有高灵敏、成本低的好处。
【IPC分类】G01N33/574
【公开号】CN105353126
【申请号】CN201510775706
【发明人】陈博
【申请人】陈博
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年11月15日