一种基于荧光共振能量转移技术的多巴胺5受体抑制剂高通量筛选方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于药理学领域，利用巧光检测技术，构建了多己胺5受体抑制剂的高通量 筛选模型，用于待测样品对多己胺5受体抑制活性的高通量检测。 技术背景
[0002] 多己胺受体属于G蛋白禪联受体(GPCR)，根据其药理学特征和信号转导通路的不 同分为D1类和D2类多己胺受体。D1类受体包括D1、D5两种亚型，D2类受体包括D2、D3、D4S种 亚型。D1类受体与Gs蛋白禪联，激活AC，使cAMP含量增加，cAMP进而激活蛋白激酶A(PKA)并 引发多种生理功能。目前发现，D5多己胺受体括抗剂可改善精神分裂症W及具有抗精神病 症状的作用，所W筛选多己胺受体括抗剂具有重要应用价值。
[0003] 时间分辨巧光技术（time-resolvedfluorescence，TRF)是基于铜系元素如館 化U)、衫(Sm)、铺化y)等具有较长巧光寿命的特点发展而来的。当館馨合物供体与受体之间 距离小于lOnm，且供体发射光谱与受体激发光谱有重叠时，则发生巧光共振能量转移，均相 时间分辨巧光化omogeneoustime-resolvedfluorescence，HTRF)技术是法国Cisbio公司 利用运一原理进行深入开发的产品。大多数巧光物质的巧光寿命非常短(一般为几毫秒）， 为了避免短暂的巧光干扰，Cisbio公司利用较长巧光寿命的铜系馨合物作为巧光能量供 体，受体经过别藻蓝蛋白（allophycocyanin)或巧光素修饰，供体在能量转移时就可W使受 体也具有较长的巧光寿命。因此，能量转移时受体发射光消失时间与供体发射光消失时间 成正比，而与供受体间的距离成反比，运种方法延长了巧光检测时间，降低了短暂巧光引起 的背景干扰。
[0004] 实验中利用多己胺5受体和Gs蛋白禪联，激活AC，使CAMP含量增加，会产生带有巧 光的产物，通过巧光强弱来判断多己胺5受体的作用，从而得出化合物是否有抑制多己胺5 受体作用，可W实现对多己胺5受体抑制剂的高通量筛选模型的建立。
[0005] 目前，少有对于多己胺5受体抑制剂的筛选方法，因此，建立方便快捷准确的检测 方法，特别是体外的功能性检测在药物筛选中越来越受到重视。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于建立一种基于巧光的多己胺5受体抑制剂高通量筛选模型，具 有信噪比高，使用安全，样品消耗量小的特点。
[0007] 本发明的技术方案:采用巧光方法建立体外多己胺5受体抑制剂高通量筛选模型， 初筛，复筛发现一类具有抑制多己胺5受体活性的候选化合物。具体步骤如下：
[000引本发明利用巧光的方法建立了一种多己胺5受体抑制剂高通量筛选模型。
[0009]步骤一:多己胺5受体抑制剂筛选模型的建立与优化。
[0010] 步骤二：阳性药验证模型可靠性。
[0011] 步骤Ξ:高通量筛选模型验证。
【附图说明】：
[0012]图1:多己胺5受体细胞浓度梯度优化实验结果。（n=AxAS;
[OOU]图2:多己胺浓度梯度优化实验结果。（n=/，
[0014] 图3:阳性药SC册9166对多己胺5受体的抑制曲线图。（η=Λ;曲；
【具体实施方式】
[0015] W下结合【附图说明】本发明的【具体实施方式】：
[0016] 一、多己胺5受体抑制剂筛选方法建立
[0017] 1、实验材料
[0018] d2-cAMP检测试剂盒（Cisbio,法国）、多己胺（Sigma-aldrich，美国）、SCH39166 (51邑111曰-曰1化;[油，美国）、0]\征]\^85(6化(3〇，美国）384孔聚丙締微孔板化1#3573(〔〇111；[]1邑，美 国）、一次性枪头(Axygen，美国）
[0019] 2、实验步骤
[0020] 1)多己胺5受体细胞最适浓度确定
[0021] 1)配制不同浓度的多己胺5受体细胞，每孔加入化1。
[0022] 2)每孔加入化1含多己胺的1X反应buffer。
[0023] 4)室溫反应45分钟。
[0024] 5)加入ΙΟμLΧ终止buffer,室溫解育1小时。检测巧光强度，确定最适多己胺5受体 细胞浓度(见图2)。
[0025] (2)多己胺最适浓度确定
[00%] 1)配制不同浓度的多己胺，每孔加入化1。
[0027] 2)每孔加入化1重悬多己胺5受体细胞的1X反应buffer。
[002引 4)室溫解育45分钟。
[0029] 5)加入ΙΟμLΧ终止buffer,室溫解育1小时。检测巧光强度，确定最适乙酷胆碱浓 度(见图1)。
[0030] (3)阳性药（SC册 9166) 1C已 0
[0031] 1)配制不同浓度的SC册9166，每孔加入2.化1。
[0032] 2)配制最适浓度的多己胺，每孔加入2.化1(空白对照加化1IX反应buffer)
[0033] 3)配制给定浓度的多己胺受体细胞，每孔加入化1。
[0034] 4)室溫反应45分钟。
[0035] 5)加入ΙΟμLΧ终止buffer,室溫解育1小时。检测巧光强度，计算得出SCH39166的 IC5〇(见图3)。
[0036] 2.数据处理
[0037] 1)根据公式计算各孔665nm和610nm处巧光强度的比值(Ratio665/610);
[0038] 2)根据公式计算各孔的相对抑制率
[0039]
[0040] 3)活性样品进行浓度稀释后检测的相对抑制率值，使用作Graphpad软件作图求算 半数抑制率ICso。
[0041 ]实验结果
[0042]多己胺5受体筛选模型优化结果:最佳反应所需的确定多己胺的最适浓度是22μΜ(见图1)，多己胺受体细胞的最适浓度是1200cellsAil(见图2)，阳性药抑制率ICso为2.5Χ 1〇-3μΜ(见图3)，表明采用本方法建立的多己胺5受体抑制剂体外筛选模型达到了高通量筛 选的要求，实验结果稳定可靠，可W用于进行多己胺5受体抑制剂的高通量筛选。
【主权项】
1. 一种多巴胺5受体抑制剂高通量筛选模型，其特征在于，包括步骤： (1) 多巴胺5受体抑制剂筛选模型的建立与优化； (2) 阳性药验证模型可靠性； (3) 高通量筛选模型验证。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中进行确定多巴胺和多巴胺5受体细 胞最适浓度的实验。3. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（1)中，配制不同浓度的多巴胺，每孔加 入5μ1，再每孔加入5μ1含多巴胺5受体细胞的1X反应buffer，室温孵育45分钟，检测荧光强 度，确定最适多巴胺浓度为22μΜ;配制不同浓度的多巴胺5受体细胞，每孔加入5μ1，再每孔 加入5μ1含多巴胺的1X反应buffer，室温孵育45分钟，检测荧光强度，确定最适多巴胺5受 体细胞浓度为1200cellsAU。4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)配制不同浓度的阳性药SCH39166,每 孔加入2.5μ1，配制最适浓度的多巴胺，每孔加入5μ1 (空白对照加5μ1 1X反应buffer)，室 温孵育45分钟，检测荧光强度，计算得出阳性药的IC5Q为2.5Χ1(Γ3μΜ。5. 权利要求1-5中所述任一所述的方法在筛选多巴胺5受体抑制剂的应用。
【专利摘要】本发明发现了一种筛选多巴胺5受体抑制剂高通量筛选方法，本发明中利用实验中利用多巴胺5受体和Gs蛋白耦联，激活AC，使cAMP含量增加，会产生带有荧光的产物，通过荧光强弱来判断多巴胺5受体的作用，从而得出化合物是否有多巴胺5受体抑制作用。包括以下步骤：(1)多巴胺5受体抑制剂筛选模型的建立与优化：确定多巴胺和多巴胺5受体细胞反应的最适浓度；(2)阳性药验证模型可靠性：阳性药IC50与参考文献一致。方法简便快捷；荧光检测值灵敏度高，提高检测精确度；结果稳定可靠，重现性好。
【IPC分类】G01N21/64
【公开号】CN105445245
【申请号】CN201510828236
【发明人】何玲, 沈灵, 孙丹丹, 严明, 张陆勇
【申请人】中国药科大学
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2015年11月20日