一种细胞原位电泳的电泳缓冲液的制作方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种细胞原位电泳的电泳缓冲液。
【背景技术】
[0002]细胞电泳(cell electrophoresis),将细胞制备成悬浮溶液,使其单个游离的细胞分散于等渗的介质中，在电场作用下，细胞在电泳室内发生运动，这种现象称为细胞电泳。细胞原位电泳是指在保持细胞应力平衡的条件下，对细胞膜和细胞核处理后，通过电泳将细胞中的物质从细胞中分离出来的一种电泳方式。电泳时保持细胞应力平衡是进行细胞原位电泳相关检测的前提条件，但是当前没有保持细胞的应力平衡电泳缓冲液。
【发明内容】
[0003]本发明的目的就是为了解决上述问题，提供一种细胞原位电泳的电泳缓冲液。
[0004]为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
[0005]一种细胞原位电泳的电泳缓冲液，pH为8.3，溶剂是水，溶质由Tris，Glycine,Glucose 组成，其中浓度 Tris: 25mM ；Glycine: 192mM ；Glucose:43.2mM。
[0006]本发明所用到的磷酸缓冲液pH值为7.4。
[0007]所述缓冲液的制备方法为将相应重量的Tris，Glycine, Glucose，加水混合即可。
[0008]细胞原位电泳(cell in situ electrophoresis, CISE),是将待检细胞制备成单细胞悬液，使其单个游离的细胞分散于等渗即应力平衡的介质中，在电场作用下，将细胞中的物质从细胞中分离出来的一种电泳方式。
[0009]本发明的有益效果:
[0010](I)本发明的电泳缓冲液在保持细胞等渗的条件下，能够保持细胞的应力平衡。
[0011](2)本发明的电泳缓冲液选择葡萄糖，其无极性，且分子结构不影响后续的离心，便于细胞的回收。
【附图说明】
[0012]图1为细胞原位电泳装置主视图，其中1.电泳缓冲液池，2.滤膜，3.侧连接通道，
4.细胞电泳槽；
[0013]图2为正常人胚肺成纤维细胞的结合状态影响的检测图，其中2a、2b和2c分别为RPA32、RPA70 和 POTl 检测结果。
【具体实施方式】
[0014]下面结合附图与实施例对本发明作进一步说明。
[0015]实施例1
[0016]一种细胞原位电泳的电泳缓冲液，pH为8.3，溶剂是水，溶质由Tris，Glycine,Glucose 组成，其中浓度 Tris: 25mM ；Glycine: 192mM ；Glucose:43.2mM。
[0017]缓冲液的应用:
[0018]所用的装置:包括细胞电泳槽4:该槽为一内径0.8cm、外径0.95cm、长度18cm的聚苯乙烯圆管。管壁中部，沿其纵轴方向开有一 9X0.6cm的矩形槽口 ；电极缓冲液槽1:阳极、阴极各有一个；尺寸相同，10X3.5X5cm;材质:聚苯乙烯；侧连接通道3:阳极与阴极侧各有一个；尺寸相同，内径0.8cm,外径0.95cm,长1cm的娃胶管；滤膜2:阳极与阴极侧各有一个；尺寸相同，0.2 μ m 或 0.45 μ m 亲水聚苯謎讽(Hydrophilic polyethersulfone)滤膜；电极:阳极与阴极各有一根；6cm长，直径0.5mm电泳仪用钼丝。
[0019]胰蛋白酶消化对培养的正常人胚肺成纤维细胞(HFLF) SSBs (检测3种，分别为:RPA32、RPA70和P0T1)结合状态影响的检测:
[0020](I)用0.25%的胰蛋白酶消化法获取指数生长期的细胞浓度为2 X 17的HFLF。
[0021](2)细胞经磷酸盐缓冲液(PBS)离心漂洗一次，将弃上清的细胞团加入200 μ IPBS后分成两等分，分别滴加于两个3.5cm培养皿底部，用移液器吸头分别将两个培养皿底部的细胞悬液均匀地摊布于整个培养皿底部。
[0022](3)将培养皿置于冰上，用254nm UV灯以1.84W/cm2强度照射，总剂量165.6J/cm2。
[0023](4)分别用20ml PBS将两个培养皿中被照射的细胞冲洗收集于一个50ml的离心管中。
[0024](5)收集的细胞经260g离心5分钟，弃上清后，加入4%的多聚甲醛200 μ I预固定3秒钟，加入46ml PBS终止固定。
[0025](6)经260g离心5分钟弃上清后，加入0.2% Triton Χ-100200 μ I进行细胞打孔，时间10分钟，之后加入46ml PBS，470g离心5分钟，弃上清。
[0026](7)细胞团加入936μ I CISE缓冲液(三羟甲基氨基甲烷Tris:25mM ;甘氨酸Glycine: 192mM ;葡萄糖Glucose:43.2mM ；pH8.3),并通过吹吸轻柔地将细胞分散悬浮。
[0027](8)取500 μ I细胞悬液加入另一支50ml离心管作为CISE的对照，待后续的固定处理。其余细胞悬液被用作CISE样本。
[0028](9)装配CISE装置，如见图1，并连接电泳电源。
[0029](10)按图1所示加入CISE缓冲液。
[0030](11)开启电源，设置为恒压模式，调整电压设置到500V并开始电泳运行。
[0031](12)戴橡胶或塑料手套，穿绝缘底鞋具，保证人体与地面绝缘。用塑料把手移液器吸取126 μ I CISE样品，轻柔小心地贴近液面，在距阴极侧电泳槽开口 1.5cm处滴入CISE缓冲液。
[0032](13)样品滴入后立即开始计时，电泳时间3分钟。计时结束，中止电源。
[0033](14)用移液器尽量吸净电泳槽中的液体，并将吸出液汇集于一 50ml离心管中。
[0034](15)用CISE缓冲液彻底冲洗电泳槽，吸净残留液，按步骤10标准重新将电泳槽注入CISE电泳缓冲液。
[0035](16)重复步骤12)-15)，直至全部CISE样品被CISE处理完毕。若最后一轮CISE样品不足126μ 1，仍按前步骤操作。
[0036](17)分别用CISE缓冲液补加CISE样品汇集管和CISE对照管的液量至50ml。
[0037](18)将CISE样品和CISE对照以1275g转速离心5分钟，弃上清。
[0038](19)分别将CISE样品和CISE对照加入0.3ml PBS,并轻柔地将细胞分散悬浮。
[0039](20)分别将CISE样品和CISE对照用70%的乙醇15ml固定。
[0040](21)固定24小时后，将CISE样品和CISE对照按常规方式行流式细胞术分析检测。
[0041]流式细胞术分析CISE结果:
[0042](I)将固定的CISE样品和CISE对照以1275g离心5分钟，弃上清。
[0043](2)CISE样品管加入300μ I PBS，混悬细胞，分成三等分，分别移入三个1.5mlEppendorf管，分别在每个Eppendorf管中加入Iml PBS, 560g离心5分钟，弃上清。CISE对照管中加入400μ1 PBS,混悬细胞,分成四等分,分别移入四个1.5ml Eppendorf管,分别在每个Eppendorf管中加入Iml PBS, 560g离心5分钟,弃上清。
[0044](3)将所有Eppendorf管分别加入20 μ I PBS配制的3%牛血清白蛋白。
[0045](4)将三个装有Cl SE样品的Eppendorf管分别标记并加入兔抗RPA32 (SANTACRUZ,终浓度按说明书推荐量实验确定)、兔抗RPA70 (BETHYL,终浓度按说明书推荐量实验确定)和兔抗POT (abeam,终浓度按说明书推荐量实验确定)抗体。同样，将三个装有CISE对照的Eppendorf管分别标记并加入兔抗RPA32 (SANTA CRUZ,浓度剂量与CISE样品管相同)、兔抗RPA70(BETHYL，浓度剂量与CISE样品管相同)和兔抗POT (abeam，浓度剂量与CISE样品管相同)抗体。另外，将第4个装有CISE对照的Eppendorf管加入3 μ PBS替代一抗用作抗体同型对照(注:经实验证实，用CISE处理的细胞和CISE对照的细胞用作抗体同型对照，结果无统计学差异，故采用CISE对照的细胞作抗体同型对照)。
[0046](5)上述Eppendorf管室温孵育2小时。
[0047](6)上述Eppendorf管分别加入Iml PBS, 500g离心漂洗2次,弃上清。
[0048](7)将所有Eppendorf管分别加入20 μ I PBS配制的3%牛血清白蛋白。
[0049](8)将所有Eppendorf管分别加入2 μ I FITC标记的羊抗兔IgG 二抗。室温、避光孵育30分钟。
[0050](9)上述Eppendorf管分别加入Iml PBS, 500g离心漂洗2次,弃上清。
[0051 ] (10)将所有Eppendorf管分别加入PI (碘化丙啶)染液(按常规DNA染液方法配制)0.5ml，置4°C避光I小时。
[0052](11)行常规双参数FCM检测(本实施例所用流式细胞仪为FACSCalibur)。DDM模式用于排除细胞碎片和细胞聚集。每个检测样品获取80000个细胞。
[0053](12)结果采用Flowjo软件分析，如图2所示，虚线为抗体同型对照，深色实线为CISE对照，浅色实线为CISE样品。图2a从左向右分别为RPA32、RPA70和POTl检测结果。如图2所示，CISE样品峰后沿较CISE对照峰后沿前移，说明由于细胞核的缩小，SSBs的结合状态发生改变，即SSBs出现解离。图2b为正常生长的HFLF细胞核荧光染色图，图2c为经过胰蛋白酶消化后的HFLF细胞核荧光染色图，2b、2c可以看出HFLF离体经过胰蛋白酶消化后，HFLF细胞核发生收缩。
[0054]上述虽然结合附图对本发明的【具体实施方式】进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
【主权项】
1.一种细胞原位电泳的电泳缓冲液，其特征在于，pH为8.3，溶剂是水，溶质由Tris，Glycine, Glucose 组成，其中浓度 Tris:25mM ；Glycine: 192mM ；Glucose:43.2mM。2.如权利要求1所述的细胞原位电泳的电泳缓冲液的制备方法，其特征在于，将相应重量的Tris，Glycine, Glucose，加水混合即可。
【专利摘要】本发明公开了一种细胞原位电泳的电泳缓冲液，pH为8.3，溶剂是水，溶质由Tris，Glycine，Glucose组成，其中浓度Tris:25mM；Glycine:192mM；Glucose:43.2mM。将相应重量的Tris，Glycine，Glucose，加水混合即可。本发明的电泳缓冲液在保持细胞等渗的条件下，能够保持细胞的应力平衡，选择无极性的葡萄糖，在后续离心、细胞的回收等都易于分离。
【IPC分类】G01N33/561
【公开号】CN105445455
【申请号】CN201410432330
【发明人】国前, 于金明, 廖湘鲁, 王兴武, 宋现让
【申请人】山东省肿瘤医院
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2014年8月28日