一种香菇中l-噻唑烷-4-羧酸的快速检测方法
【技术领域】
[0001]
本发明属于分析检测领域，具体涉及一种香菇中L-噻唑烷-4-羧酸的快速检测方法。
【背景技术】
[0002]
香菇(Lentinula edodes)在我国已有近千年的栽培历史，其产量逐年增加。其味道鲜美，香气沁人，营养丰富，素有“山珍之王”之称，是高蛋白、低脂肪的营养保健食品。但香菇子实体中普遍含有内源性甲醛，国内外相关学者一直致力于甲醛抑制剂的探索。其中有研究发现，外源添加L-半胱氨酸不仅能对香菇进行保鲜，还能降低香菇甲醛含量，有研究表明两者发生反应，生成L-噻卩坐烧-4-羧酸。L-噻卩坐烧-4-羧酸(L-Thiazolidine-4-carboxylicacid)，又称L-硫代脯氨酸，国内外许多研究已表明此物质具有抑制癌细胞扩散、使肿瘤细胞逆转为正常细胞、抗炎、降血糖的功能，并且该物质在一定剂量范围内，对人体不会产生副作用。目前对于L-噻唑烷-4-羧酸的检测可供参考的方法较少，还没有建立相应的检测标准。
【发明内容】
[0003]
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种香菇中L-噻唑烷-4-羧酸的快速检测方法。本发明以L-噻唑烷-4-羧酸标准品进行检测条件的优化，建立快速检测方法，并以L-半胱氨酸处理过的香菇为实验材料，以未经L-半胱氨酸处理的香菇为对照，实际应用该方法进行了检测和证明:采用固相萃取-亲水作用色谱法测定其L-噻唑烷-4-羧酸含量。该方法无需衍生化、前处理简单快速、重现性好，弥补了当前基于高效液相色谱不能直接准确快速的对香菇中L-噻唑烷-4-羧酸分离测定的空缺，并为研究香菇中甲醛的控制提供了新思路和检测方法。
[0004]为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案:
本发明的L-噻唑烷-4-羧酸的快速检测方法，包括香菇子实体前处理、固相萃取、亲水作用色谱测定，其操作步骤如下:
(1)配制标准溶液:称取50.0yg L-噻唑烷-4-羧酸标准品于50 mL的容量瓶中，以流动相(乙腈-0.lwt%磷酸水溶液，85:15，v/v)定容，配成1000 yg/L的标准储存液；以此为母液，准确移取20、50、100、500、1000 yL于10 mL容量瓶中，流动相定容至刻度，得到2、5、10、50、100 yg/mL系列质量浓度的标准溶液;测定标准品在2?100 yg/mL范围内的线性关系;所得线性回归方程为Y=5146.42Χ-1171.96，相关系数为0.9998 ；
(2)样品预处理:准确称取2.0g研磨后的香燕样品于50 mL离心管中，加入20 mL甲醇-水(70:30，v/v)摇匀，100 W功率下超声提取20 min，在10000 r/min转速下，离心10 min;离心后，取10 mL上清液到50 mL离心管，加入10 mL乙腈饱和的正己烷涡旋混匀I min，除去脂类物质，取5 mL下层提取液加入到试管中，再加5 11^2的%氨水摇匀作为上样液；(3)样品净化:采用WondaSep MAX固相萃取小柱(阴离子萃取小柱，60 mg/3 mL，购自于岛津公司)，先分别用3 mL甲醇和3 mL去离子水将小柱活化，再加入步骤(2)提取的上样液过柱后，分别用3 mL 5wt%氨水和5 mL甲醇淋洗小柱，小柱空干后，用4 1111^甲醇-1.0 wt%甲酸(90:10，v/v)混合液作为洗脱液，洗脱目标物，最后，氮吹仪设置温度40°C将洗脱液吹干，加入I mL乙腈-0.1被%磷酸(85:15，￥八)溶液定容，涡旋混匀后过0.22 μπι有机滤膜，供HPLC测定；
(4)液相色谱测定参数:操作系统为岛津LC-soIut1n工作站;色谱柱:岛津Inertsi IHILIC液相色谱柱(4.6X250 mm,5 μπι)；流动相:有机相为乙腈，无机相为0.lwt%磷酸水，体积比为85:15，等度洗脱;流速:0.8 mL/min;柱温:30°C;进样体积:5 yL;检测波长:193 nm。
[0005]本发明优点在于:
①根据L-噻唑烷-4-羧酸显弱酸性的特点，香菇样品前处理首次采用阴离子固相萃取的方式进行净化，有效保留了目标物的同时降低了基质效应；
②由于L-噻唑烷-4-羧酸属于极性小分子物质，普通C18反相色谱柱难以进行分离，因此本发明采用亲水作用色谱法对香菇中的L-噻唑烷-4-羧酸进行分离测定；
③本发明的检测方法无需衍生化、前处理简单快速、重现性好，弥补了当前基于高效液相色谱不能直接准确快速的对香菇中L-噻唑烷-4-羧酸分离测定的空缺，并为研究香菇中甲醛的控制提供了新思路和检测方法;该检测方法耗时5h;加标回收率为96.3%?101.7%，相对标准偏差在1.3%?4.8%之间，检出限为0.24 48/1^，定量限为0.73 yg/mL。
【具体实施方式】
[0006]
为了充分公开本发明的香菇L-噻唑烷-4-羧酸的快速检测方法，以下结合实施例加以说明。
[0007] 实施例1
一种香菇中L-噻唑烷-4-羧酸的快速检测方法，包括以下步骤:
1.配制标准溶液:称取50.0yg L-噻唑烷-4-羧酸标准品于50 mL的容量瓶中，以流动相(乙腈-0.lwt%磷酸水溶液，85:15，v/v)定容，配成1000 yg/L的标准储存液；以此为母液，准确移取20、50、100、500、1000 yL于10 mL容量瓶中，流动相定容至刻度，得到2、5、10、50、100 yg/mL系列质量浓度的标准溶液;测定标准品在2?100 yg/mL范围内的线性关系;所得线性回归方程为Y=5146.42Χ-1171.96，相关系数为0.9998 ；
2.香燕样品前处理:将香燕样品分成两份，其中一份喷洒40mM L-半胱氨酸，另外一份喷洒等量的水做对照，常温下放置16h，待其自然晾干;晾干后，分别进行研磨，准确称取2.0 g的香菇样品于50 mL离心管中，加入20 mL甲醇-水(70:30，v/v)摇匀，100 W功率下超声提取20 min，在10000 r/min转速下，离心10 min;离心后，取10 mL上清液到50 mL离心管，加入10 mL乙腈饱和的正己烷涡旋混匀I min，除去脂类物质，取5 mL下层提取液加入到试管中，再加5 mL 2?七%氨水摇匀作为上样液；
3.固相萃取:采用WondaSepMAX固相萃取小柱(阴离子)，先分别用3 mL甲醇和3 mL去离子水将小柱活化，再加入上述提取的上样液过柱后，分别用3 mL 5wt%氨水和5 mL甲醇淋洗小柱，小柱空干后，用4 mL甲醇-1.0被％甲酸水溶液(90:10,v/v)混合液作为洗脱液，洗脱目标物，最后，氮吹仪设置温度40°C将洗脱液吹干，加入I mL乙腈-0.1%磷酸(85:15，v/v)溶液定容，涡旋混匀后过0.22 μπι有机滤膜，供HPLC测定；
4.液相色谱测定:操作系统为采用岛津LC-solut1n工作站;色谱柱:岛津InertsilHILIC液相色谱柱(4.6X250 mm,5 μπι)；流动相:有机相为乙腈，水相为0.1%磷酸水，体积比为85:15，等度洗脱;流速:0.8 mL/min;柱温:30°C;进样体积:5 yL;检测波长:193 nm。以上参数选定后，分别对提取的样品进行分离测定；
5.样品分离测定后发现，经L-半胱氨酸处理后的香菇可检测到L-噻唑烷-4-羧酸，含量为13.95yg/g，对照未检测到L-噻唑烷-4-羧酸。
[0008]整体耗时为21h。
[0009]以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
【主权项】
1.一种香菇中L-噻唑烷-4-羧酸的快速检测方法，其特征在于:包括以下步骤: (1)配制标准溶液:配制2yg/mL、5 yg/mL、10 yg/mL、50 yg/mL、100 yg/mL系列质量浓度的L-噻唑烷-4-羧酸标准溶液，测定L-噻唑烷-4-羧酸标准品在2?100 yg/mL范围内的线性关系； (2)香菇样品的预处理:准确称取2.0g研磨后的香菇样品于50 mL离心管中，加入20mL甲醇水溶液摇匀，100 W功率下超声提取20 min;再在10000 r/min转速下，离心10 min；离心后，取10 mL上清液到50 mL离心管，加入10 mL乙腈饱和的正己烧，祸旋混勾I min，除去脂类物质，取5 mL下层提取液加入到试管中，再加5 mL 2被%氨水摇匀作为上样液； (3)固相萃取:采用WondaSepMAX固相萃取小柱，先分别用3 mL甲醇和3 mL去离子水将小柱活化，再加入步骤(2)提取的上样液过柱后，分别用3 mL 5wt%氨水和5 mL甲醇淋洗小柱，小柱空干后，用4 mL甲醇-1.0 wt%甲酸水溶液的混合液作为洗脱液，洗脱目标物，最后，氮吹仪设置温度40°C将洗脱液吹干，加入I mL乙腈-0.lwt%磷酸溶液定容，涡旋混匀后过0.22 μπι有机滤膜，供HPLC测定； (4)液相色谱测定:操作系统为岛津^:-8011^丨011工作站;色谱柱:岛津1116^8丨1HILIC液相色谱柱，其规格为4.6 X 250 mm,5 Mi;流动相:有机相为乙腈，无机相为0.lwt%磷酸水溶液，体积比为85:15,等度洗脱;流速:0.8 mL/min;柱温:30°C；进样体积:5 yL;检测波长:193 nmD2.根据权利要求1所述的香菇中L-噻唑烷-4-羧酸的快速检测方法，其特征在于:步骤(1)所述配制标准溶液具体为:称取50.0yg L-噻唑烷-4-羧酸标准品于50 mL的容量瓶中，以体积比为85:15的乙腈-0.lwt%磷酸水溶液的混合液定容，配成1000 mg/L的标准储存液；以此为母液，准确移取20、50、100、500、1000 yL于10 mL容量瓶中，流动相定容至刻度，得到2、5、10、50、100 yg/mL系列质量浓度的标准溶液。3.根据权利要求1所述的香菇中L-噻唑烷-4-羧酸的快速检测方法，其特征在于:步骤(2)中所述甲醇水溶液中甲醇和水的体积比为70:30。4.根据权利要求1所述的香菇中L-噻唑烷-4-羧酸的快速检测方法，其特征在于:步骤(3)所述WondaSepMAX固相萃取小柱为阴离子固相萃取小柱，其规格为60 mg/3 mL;步骤(3)所述甲醇-1.0 wt%甲酸水溶液的混合液中，甲醇、1.0 wt%甲酸水溶液的体积比为90:10。5.根据权利要求1所述的香菇中L-噻唑烷-4-羧酸的快速检测方法，其特征在于:步骤(3)所述乙腈-0.lwt%磷酸溶液中，乙腈、0.lwt%磷酸溶液的体积比为85:15。6.根据权利要求1所述的香菇中L-噻唑烷-4-羧酸的快速检测方法，其特征在于:步骤(I)所得线性关系为:线性回归方程为Y=5146.42Χ-1171.96，相关系数为0.9998。
【专利摘要】本发明属于分析检测领域，具体涉及一种香菇中L-噻唑烷-4-羧酸的快速检测方法，包括香菇前处理提取、样品净化、液相色谱检测。其主要步骤如下：样品用甲醇-水（70:30，v/v）进行前处理提取；经过WondaSep？MAX固相萃取小柱净化处理；样品分析采用Inertsil？HILIC亲水作用色谱柱（4.6×250mm，5μm）进行分离测定，流动相采用乙腈-0.1%磷酸水（85:15，v/v）等度洗脱，流速0.8mL/min，检测波长193nm，柱温30℃，进样量5μL。该方法无需衍生化、前处理简单快速、重现性好。弥补了当前基于高效液相色谱不能直接准确快速的对香菇中L-噻唑烷-4-羧酸分离测定的空缺。
【IPC分类】G01N30/06
【公开号】CN105467045
【申请号】CN201610002664
【发明人】谢宝贵, 何世行, 江玉姬, 陈炳智, 詹艺舒, 吴培淋, 李少斌, 郑明俊, 刘新锐, 邓优锦
【申请人】福建农林大学
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2016年1月6日