一种β-羟丁酸的测定方法及其测定试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医学检验测定技术领域，具体涉及一种β-羟丁酸的循环酶测定方法及 其测定试剂盒。
【背景技术】
[0002] 酮体是甘油三酯的代谢产物。当体内的葡萄糖绝对或相对不足时，就会大量分解 体内的甘油三酯生成甘油和脂肪酸，脂肪酸在肝脏氧化生成能量和和酮体，该酮体包括2% 的丙酮、23%的乙酰乙酸和75%的β-羟丁酸，若体内酮体含量过高就会引起酮症酸中毒。酮中 毒是一种危险生命的疾病。及时、准确地检测酮体水平是预知酮症酸中毒的很需要手段。酮 体也是检测和控制糖尿病的重要标志物。
[0003] 酮体和血糖一样，是检测代谢控制的一项重要的标记物。I型糖尿病病人的最重要 的特征之一就是易发展成为酮症酸中毒，这是由于胰岛素相对或绝对缺乏，葡萄糖的利用 障碍，机体就过度消耗脂肪，产生大量的酮体，造成酮症酸中毒，是一种威胁生命的疾病。Π 型糖尿病的后期，因胰岛素治疗无效，而过度消耗体内的甘油三酯，产生大量的酮体，形成 酮症酸中毒。另外，糖尿病的孕妇更易发生酮症酸中毒，是因为胎儿生长发育非常快，需要 大量的营养和能量，母体的高酮血症容易发生死胎，或影响胎儿神经系统的发育。因此及时 准确地检测酮体水平是十分关键的，是预知酮症酸中毒的重要手段。
[0004] 上个世纪，我国在临床上普遍使用的是以硝普钠盐为基础的定性或半定量检测方 法。此方法只能检测丙酮和乙酰乙酸，但是这两者含量都很低，约占总酮体的话30%以下，最 大的问题是两者都不稳定，容易挥发和分解，因此，就造成了灵敏度低，重复性和特异性差， 容易出现假阳性或假阴性，造成误诊误治。另外，在酮症酸中毒的不同时期两者的浓度与病 情的发展不呈一致性。而羟丁酸就不同了，它占酮体的75%左右，含量比较高，化学性质稳 定，最主要是检测的浓度和病情的发展、恢复密切相关。
[0005] 酶法测定β_羟丁酸具有灵敏度高、特异性好、快速简便等优点，成为临床检测常用 方法。酶法分为一步酶法和循环酶法。
[0006] 《全国临床检验操作规程》（第四版），发明专利号为CN 200610151020.4、CN 200610151021.9和CN 99112967.9的专利所采用的是一步酶法： H-iii i .....m變空乙織乙竣罗频麟 f 在340nm处检测吸光度上升值，求出β-羟丁酸的量，该方法原理和试剂结构都简单，因 为β-羟丁酸的含量很低，所以反应灵敏度差，重复性差，误差比较大。
[0007] 发明专利号为CN 200910155638.1和CN1 201110267888.1的专利采用的是循环酶 法： 在β-羟丁酸脱氢酶反应的基础上偶联黄递酶，使无色的氧化型硝基四氮唑蓝生成红色 的还原型硝基四氮唑蓝，在505nm处检测吸光度的变化，计算出β-羟丁酸的含量，反应过程 如下：
该反应循环进行，将产物进行放大，其灵敏度较一步法提高了 10倍，线性范围也大幅提 高，但是增加了黄递酶和氧化型INT，使试剂成本很高，而且氧化型INT溶解度差，也不稳定。 目前，常采用三试剂法，操作步骤繁琐，稳定性仍不及动力学法，致使其在临床上的推广受 到限制。
[0008] 发明专利号为CN 201110267888.1的专利，在原有循环酶法基础上添加保护剂，所 提供的试剂盒稳定性得到提高。由于乳酸、抗环血酸对反应产生干扰，还需添加抗干扰剂， 试剂成本相对较高。
【发明内容】
[0009] 本发明针对现有技术的上述不足，旨在提供一种线性范围大、准确度和精密度高、 抗干扰性强、成本低、操作简便的羟丁酸测定方法和测定用液体试剂盒。
[0010] 为解决上述技术问题，本发明所采用方法为:样本中的β_羟丁酸被β_羟丁酸脱氢 酶和硫代氧化型辅酶I(Thio_NAD+)特异性氧化，生成乙酰乙酸和硫代还原型辅酶I(Thi〇-NADH);乙酰乙酸在β-羟丁酸脱氢酶及还原型辅酶I (NADH)存在下，又生成β-羟丁酸和氧化 型辅酶I (NAD+)，反应循环进行，产生大量的硫代还原型辅酶I (Thio-NADH)，通过405nm波长 下测定生成的Thio-NADH的吸光度变化来定量样本中的β-羟丁酸含量，其反应方程式如下：
该方法对样本中微量的β-羟丁酸起放大作用，β-羟丁酸的计算公式如下：
[0011] 该试剂盒由以下组分构成： β-羟丁酸脱氢酶 1-100 KU/L 缓冲液 5-500 mmol/L 表面活性剂 0.005-5% 稳定剂 0.005-50% 硫代氧化型辅酶 I (Thi〇-NAD+) 0.01-10mmol/L 还原型辅酶 0.01-10mmol/L。
[0012] 所述的还原型辅酶是NADH或NADPH中的一种。
[0013] 所述的缓冲液可以是磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲 液、Tr i s缓冲液、CAPS或MES缓冲液中的一种。
[0014] 所述的表面活性剂可以是TritonX-100、Brij-35或吐温-20中的一种。
[0015] 所述的稳定剂是乙二醇、小牛血清白蛋白、甘露醇或山梨醇中的一种。
[0016] 本发明技术方案的实质特点和显著进步主要体现在： 1) 采用循环酶法，灵敏度高、线性范围大； 2) 采用硫代氧化型辅酶I代替常规循环酶法中的氧化型INT和黄递酶，解决了氧化型 INT溶解性差且不稳定给试剂检测带来的步骤繁琐、不稳定等缺陷。也有效避免了乳酸脱氢 酶、乳酸、抗环血酸等物质干扰。试剂盒成本大幅度降低，检测准确性提高； 3) 该试剂盒配方简单、稳定性强、操作简便，通过生化仪可快速得到测定结果，便于行 业内广泛推广应用。
【附图说明】
[0017]图1为本发明主检批线性曲线图； 图2为本发明反应曲线图。 下面将结合【具体实施方式】进一步说明本发明，但本发明要求保护的范围并不局限于下 列实施方式。 【具体实施方式】 [0018] 实施例1 β-羟丁酸的测定方法：样本中的β-羟丁酸被β-羟丁酸脱氢酶和硫代氧化型辅酶I (Thi〇-NAD+)特异性氧化，生成乙酰乙酸和硫代还原型辅酶I(Thio-NADH);乙酰乙酸在β-羟 丁酸脱氢酶及还原型辅酶I (NADH)存在下，又生成β-羟丁酸和氧化型辅酶I (NAD+)，反应循 环进行，产生大量的硫代还原型辅酶I(Thio-NADH)，通过405nm波长下测定生成的Thio-NADH的吸光度变化来定量样本中的β-羟丁酸含量，该方法对样本中微量的β-羟丁酸起放大 作用，其反应方程式如下：
羟丁酸的测定试剂盒为双试剂，分为试剂Α和试剂Β。
[0019]试剂 A: 磷酸盐缓冲液(PH4.0) 5mmol/L Thio-NAD 0.01mmol/L 表面活性剂Brij-35 〇.5g/L 防腐剂 NaN3 〇.9g/L 试剂B: Tris 缓冲液(ρΗ9·0) 200mmol/L β-羟丁酸脱氢酶 1 KU/L NADH 0.04mmol/L 甘露醇 50g/L 其检测方法是采用具有双试剂功能的自动生化分析仪，操作如下： 温度:37°C;波长:405nm/660nm;检测方法:速率法;反应方向：正
计算： :r，T__i
实施例2 β-羟丁酸的测定方法同实施例1; β-羟丁酸的测定试剂盒为双试剂，分为试剂Α和试剂Β。
[0020]试剂 A: MES 缓冲液(pH4.0) 8mmol/L Thi〇-NAD+ 0.05mmol/L TritonX-100 l.Oml/L 防腐剂 NaN3 〇.5g/L 试剂B: Caps 缓冲液(pH9.0) 200mmol/L β-羟丁酸脱氢酶 3 KU/L NADH 0.10mmol/L 稳定剂乙二醇 70ml/L 其检测方法及计算公式同实施例1。
[0021 ] 实施例3 β-羟丁酸的测定方法同实施例1; β-羟丁酸的测定试剂，分为试剂Α和试剂Β。
[0022]试剂 A: 甘氨酸缓冲液(pH 4.5) 10mmol/L Thi〇-NAD+ 0.15mmol/L 吐温-20 (Tween-20) 0.5g/L 防腐剂 NaN3 〇.9g/L 试剂B: Tris 缓冲液(ρΗ9·0) 300mmol/L β-羟丁酸脱氢酶 4 KU/L NADH 0.08mmol/L 小牛血清白蛋白（BSA) l.〇g/L 乙二醇 300ml/L 其检测方法及计算公式同实施例1。
[0023]实验数据： 1. 主检批线性：
2. 主检批精密度：
3.稳定批精密度：
【主权项】
1. 一种e-径下酸的测定方法，其特征在于:样本中的e-径下酸被e-径下酸脱氨酶和硫 代氧化型辅酶I (化io-NAD+)特异性氧化，生成乙酷乙酸和硫代还原型辅酶I (Thio-NADH); 乙酷乙酸在e-径下酸脱氨酶及还原型辅酶I (NADH)存在下，又生成(6-?下酸和氧化型辅酶I (NAD+)，反应循环进行，产生大量的硫代还原型辅酶I (Iliio-NADH)，通过405nm波长下测定 生成的化io-NA畑的吸光度变化来定量样本中的(6-?下酸含量，其反应方程式如下：该方法对样本中微量的e-径下酸起放大作用，e-径下酸的计算公式如下：2. -种(6-?下酸测定试剂盒，其特征在于:该试剂盒由W下组分构成： e-径下酸脱氨酶 1-100 KU/L 缓冲液 5-500 mmol/L 表面活性剂 0.005-5% 稳定剂 0.005-50% 硫代氧化型辅酶IUhio-NA护） O.Ol-lOmmol/L 还原型辅酶 0 .Ol-lOmmol/L。3. 根据权利要求2所述的一种(6-?下酸测定试剂盒，其特征在于:所述的还原型辅酶是 NADH或NADPH中的一种。4. 根据权利要求2所述的一种(6-?下酸测定试剂盒，其特征在于:所述的缓冲液可W是 憐酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、巧樣酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、Tris缓冲液、CAPS或MES缓 冲液中的一种。5. 根据权利要求2所述的一种(6-?下酸测定试剂盒，其特征在于:所述的表面活性剂可 W是Tr i tonX-100、化i j -35或吐溫-20中的一种。6. 根据权利要求2所述的一种(6-?下酸测定试剂盒，其特征在于:所述的稳定剂是乙二 醇、小牛血清白蛋白、甘露醇或山梨醇中的一种。
【专利摘要】本发明涉及β-羟丁酸的循环酶测定方法及其测定试剂盒，利用β-羟丁酸脱氢酶与硫代氧化型辅酶Ⅰ特异性氧化β-羟丁酸，生成乙酰乙酸和硫代还原型辅酶Ⅰ。乙酰乙酸在β-羟丁酸脱氢酶及还原型辅酶Ⅰ存在下，又生成β-羟丁酸和氧化型辅酶Ⅰ。反应循环进行，产生大量的硫代还原型辅酶Ⅰ，通过在波长405nm条件下测定生成的硫代还原型辅酶的吸光度上升量率，可计算出β-羟丁酸含量，该方法对微量的β-羟丁酸起放大作用，具有灵敏度高、稳定性好、成本低等优点。该试剂盒由还原型辅酶、β-羟丁酸脱氢酶、硫代氧化型辅酶Ⅰ、缓冲液、表面活性剂和稳定剂组成。本发明可通过生化分析仪测定β-羟丁酸含量。
【IPC分类】G01N21/31
【公开号】CN105510255
【申请号】CN201510981872
【发明人】孟广宇, 吉爽爽, 李丰盛
【申请人】江苏迈源生物科技有限公司
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年12月24日