二乙基对硝基苯磷酸酯酶活力测定方法及其试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医学、兽医学、生物学的研究，以及人、动物或微生物等领域内二乙基 对硝基苯磷酸酯酶活性浓度的检测，尤其涉及利用Trinder反应测定二乙基对硝基苯磷酸 酯酶活力的方法，以及由此制得的二乙基对硝基苯磷酸酯酶诊断试剂盒，属于体外诊断试 剂技术领域。
【背景技术】
[0002] 血清中的二乙基对硝基苯磷酸酯酶，主要在肝脏产生，其作用是水解组织中磷酸 酯。血清中的二乙基对硝基苯磷酸酯酶与人体中的高、低密度脂蛋白代谢有关。二乙基对硝 基苯磷酸酯酶可以保护低密度脂蛋白，避免氧化修饰，所以，可以认为，二乙基对硝基苯磷 酸酯酶是一种具有抗动脉粥样硬化以及抗炎作用的酶。
[0003] 目前，市场上二乙基对硝基苯磷酸酯酶测定方法相对较少。申请号为CN 200610161226.5的专利，提供了一种二乙基对硝基苯磷酸酯酶测定方法和诊断试剂盒，该 试剂盒利用二乙基对硝基苯磷酸酯酶和底物苯乙酸酯反应能生成乙酸，在醛脱氢酶的作用 下，使还原型辅酶氧化生成氧化型辅酶，在340nm处检测吸光度下降的速率，计算二乙基对 硝基苯磷酸酯酶活力。此方法灵敏度高，但试剂的稳定性不太好，醛脱氢酶价格贵，试剂的 pH不利于二乙基对硝基苯磷酸酯酶的反应。
【发明内容】
[0004] 本发明针对现有技术存在的不足，旨在提供一种测定二乙基对硝基苯磷酸酯酶活 力的方法，以及应用该方法配制的成本低、性质稳定的二乙基对硝基苯磷酸酯酶诊断试剂 盒。
[0005] 本发明是将测定的样品与含有苯乙酸酯、过氧化物酶、显色剂和过氧化氢的试剂 混匀，使之发生以下反应：
将反应物置于紫外/可见光分析仪或半/全自动生化分析仪下，设定主波长为500nm，检 测反应物的吸光度上升速度，计算出二乙基对硝基苯磷酸酯酶的活力大小； 试剂盒的试剂由以下成分组成： 缓冲液 20~200mmol/L 稳定剂 0.1~3g/L 过氧化氢（H2O2) 0.01 ~0.50mmol/L 过氧化物酶 0.5~5 KU/L 苯乙酸酯 1~100mmol/L 4-氛基安替比林 0 · 05~0 · 50mmol/L; 所述的缓冲液可以是3-吗啉丙磺酸(Mops)、哌嗪-1，4-二乙磺酸、3-(N-吗啉)-2羟基丙 磺酸(Mpso)中的一种。
[0006] 所述稳定剂为小牛血清白蛋白（BSA 1~5g/L)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2 0.1 ~3mmol/L)、乙二醇（5~30%v/v)中的一种或多种。
[0007] 所述试剂能配成双试剂和三试剂，其中双试剂试剂盒成分组成如表1所示；
双试剂的配方不仅仅限于上述表中所列，其中试剂I中部分成分可与试剂Π 的成分互 换，如此可以形成多种配方，不再一一列举，配成液体试剂，直接使用。
[0008] 三试剂试剂盒成分组成如表2所示。
[0009]使用前将试剂m加入试剂π中。
[0010] 与双试剂类似，三试剂的配方也不仅仅限于上述配方，试剂I与试剂Π 中部分可以 互换，如此可以形成多种配方，配成液体试剂，直接使用。
[0011] 所述试剂盒为液体试剂。
[0012] 研究表明，无论是双还是三试剂，试剂最终反应时各成分的量应达到如下浓度较 为理想，是本发明的最佳方案： 缓冲液 120mmol/L 稳定剂 2g/L 过氧化氢（H2O2) 0.05mmol/L 过氧化物酶 2KU/L 苯乙酸酯 20mmol/L 氨基安替比林 0.25mmol/L。
[0013] 本发明技术最突出的特点主要表现在： (1) 本发明利用Trinder反应来测定二乙基对硝基苯磷酸酯酶的活力，该方法灵敏度 高，试剂稳定性好，测试结果准确； (2) 科学合理地搭配各原料组份，各组分和反应生成物之间不会产生干扰，检测结果精 确度高； (3) 该方法简便、易操作，试剂成本很低，检测快速准确，反应物和生成物都不会对环境 有害； (4) 该方法在普通、紫外分光光度或者半自动/全自动生化分析仪上便可快速检测，便 于行业内推广应用； (5) 本发明提供的液体试剂，用于测定各种样品中二乙基对硝基苯磷酸酯酶活力的大 小，无需再配制，直接上机使用； (6) 本发明提供的液态二乙基对硝基苯磷酸酯酶检测试剂盒，稳定性好，很好地保证了 应用测试效果。检测结果可靠，稳定性好，可以长期贮存。
[0014] 下面将结合【具体实施方式】进一步说明本发明，但本发明要求保护的范围并不局限 于下列实施方式。
[0015]【具体实施方式】： 实施例1: 该试剂盒测定方法是将样品与含有苯乙酸酯、过氧化物酶、显色剂和过氧化氢的试剂 混匀，使之发生以下反应：
将反应物置于紫外/可见光分析仪或半全自动生化分析仪下，检测主波长500nm吸光度 上升的速度，测算出二乙基对硝基苯磷酸酯酶的活力浓度大小。
[0016]采用双试剂法，其成分组成如下： 试剂1:3_吗琳丙横酸(Mops) 80 mmol /T, 小牛血清白蛋白 1 g/L EDTA_Na2 2 mmol/L 过氧化物酶 2 KU/L 4-AAP 0.25 mmol/L 试剂Π :3_吗琳丙横酸(Mops) 80 mmol/L 苯乙酸酯 20 mmol/L 过氧化氢 0.04 mmol/L 在全自动生化分析仪上设定:温度37°C，主波长:500nm，副波长:600nm，反应方向：正， 检测方法:速率法，反应步骤如表3所示。
[00Π ] 计算 (1) 米用_象g 7住物席彳井4千隹'水7^
(2) K因数法 实施例i
该试剂盒反应方式同实施例1。采用三试剂法，各成分和用量配制如下： 试剂I:哌嗪_1，4_二乙磺酸 100mmol/L BSA lg/L EDTA_Na2 2mmol/L 过氧化物酶 3 KU/L 4-AAP 0.30mmol/L 试剂Π :哌嗪-1，4_二乙磺酸 100mmol/L 乙二醇 100ml/L 苯乙酸酯 50mmol/L 试剂ΙΠ :过氧化氢 0.16mmol/L 使用时将试剂Π 和m按1:4混合。
[0018] 在全自动生化分析仪上设定:温度37°C，主波长:500nm，副波长:600nm，反应方向： 正，检测方法:速率法，反应步骤如表4所示。
[0019] 计算 (1) 采用国家标准物质进行定标
(2) K因数法
【主权项】
1. 二乙基对硝基苯憐酸醋酶活力测定方法及其试剂盒，其测定方法如下： 将测定的样品与含有苯乙酸醋、过氧化物酶、显色剂和过氧化氨的试剂混匀，使之发生 W下反应：将反应物置于紫外/可见光分析仪或半全自动生化分析仪下，检测主波长50化m吸光度 上升的速度，测算出二乙基对硝基苯憐酸醋酶的活力浓度大小； 试剂盒的试剂由W下成分组成： 缓冲液 20~200mmol/L 稳定剂 0.1~3g/L 过氧化氨化2〇2) 0.01~0.50mmol/L 过氧化物酶 0.5~5 KU/L 苯乙酸醋 1~lOOmmol/L 4-氨基安替比林 0.05~0.50mmol/L。2. 如权利要求1所述的二乙基对硝基苯憐酸醋酶活力测定方法及其试剂盒，其特征在 于:所述的缓冲液可W是3-吗嘟丙横酸(Mops)、赃嗦-1，4-二乙横酸、3-(N-吗嘟)-2-径基丙 横酸(Mpso)中的一种。3. 如权利要求1所述的二乙基对硝基苯憐酸醋酶活力测定方法及其试剂盒，其特征在 于：所述稳定剂为小牛血清白蛋白（BSA 1~5g/L)、乙二胺四乙酸二钢（EDTA-Nas 0.1~ 3mmol/L)、乙二醇（5~30%v/v)中的一种或多种。4. 如权利要求1所述的二乙基对硝基苯憐酸醋酶活力测定方法及其试剂盒，其特征在 于:所述试剂能配成双试剂和=试剂两种形式。5. 如权利要求1所述的二乙基对硝基苯憐酸醋酶活力测定方法及其试剂盒，其特征在 于:所述试剂盒为液体试剂。
【专利摘要】本发明涉及二乙基对硝基苯磷酸酯酶活力测定方法及其试剂盒，利用Trinder反应原理，以苯乙酸酯为底物，与二乙基对硝基苯磷酸酯酶反应生成苯酚和乙酸，苯酚在过氧化氢和过氧化物酶的作用下，和4-氨基安替比林偶联，反应生成红色的醌类化合物。通过测定500nm处吸光度上升的速度，测算二乙基对硝基苯磷酸酯酶的活力浓度大小。该方法测试结果精确、准确性好。试剂盒成分包括：缓冲液、显色剂、苯乙酸酯、过氧化物酶、过氧化氢及稳定剂；将诊断试剂盒制成双试剂或三试剂可减少各成分的交叉影响，本发明可以用紫外/可见光分析仪器得出所需的测定结果。
【IPC分类】G01N33/50, G01N21/31, G01N21/75
【公开号】CN105510308
【申请号】CN201510988206
【发明人】李丰盛, 吉爽爽, 孟广宇
【申请人】江苏迈源生物科技有限公司
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年12月25日