一种快速检测t-2毒素的方法
【技术领域】
[0001 ]本发明属纳米生物传感以及生物检测技术领域，具体地说，是提供一种快速检测T-2毒素的方法。
【背景技术】
[0002]T-2毒素主要由三线镰刀菌等真菌产生的单端孢霉烯族化合物之一，它广泛分布于自然界，是常见的污染田间作物和库存谷物的主要毒素，对人、畜危害大。联合国粮农组织(FAQ)和世界卫生组织(WHO)把这类毒素作为自然存在的最危险的食品污染源。T-2毒素在室温条件下非常稳定，放置6?7年或加热至100?120°C1小时不能破坏其毒性。迄今为止，尚无T-2毒素中毒的特异性防治办法，唯一有效的预防办法是避免接触或减少接触。因此，对T-2毒素的检测非常必要。
[0003]目前，检测T-2毒素的方法主要有:色谱法、免疫层析法、色谱-质谱联用法等方法。最近，中国专利CN 105021593 A公开了一种基于足点域和杂交链式反应测定T-2毒素的方法。
[0004]但是，这些方法的各有其缺点:如色谱-质谱联用法，不仅仪器价格昂贵，且需药专门技术人员才能胜任，难于普及;免疫法试剂贵且易于失活;基于足点域和杂交链式反应测定T-2毒素的方法，需要使用价格昂贵的通过标记的DNA等不足。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是针对现有技术中存在的问题，提供一种快速检测T-2毒素的方法。
[0006]本发明采用的技术方案:一种快速检测T-2毒素的方法，包括如下步骤:
(A)T-2毒素核酸适体Apt与单链信号探针ssDNA杂交，形成杂交链；
(B)将待测样品溶液加入到该杂交链溶液，当待测样品中有T-2毒素时，杂交链选择性地与T-2毒素反应释放出单链信号探针ssDNA;
(C)消除杂交链的干扰，利用DNA扩增，使杂交链成双链DNA，然后用核酸外切酶，将双链DNA水解成单核苷酸，留下单链信号探针ssDNA;
(D)利用T-2毒素核酸适体-T-2毒素结合体不能诱导铜离子还原成近红外荧光的铜纳米粒子，只有单链信号探针ssDNA能诱导铜离子还原成近红外荧光铜纳米粒子，在铜离子还原检测体系中检测体系荧光强度，从而测定待测样品中的T-2毒素的含量。
[0007]所述铜离子还原检测体系包括先后添加的铜离子和使铜离子还原成近红外荧光铜纳米粒子的还原剂维生素C。步骤(D)的检测，例如包括依次先后向体系中加入铜离子溶液和维生素C溶液，反应后生成近红外荧光铜纳米粒子。
[0008]所述T-2毒素核酸适体为
5’-CAGCTCAGAAGCTTGATCCTGTATATCAAGCATCGCGTGTTTACACATGCGAGAGGTGAAGACTCGCA-3，。
[0009]所述可与T-2毒素核酸适体杂交的信号探针ssDNA为5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCGAGTCTTCACC_3，。
[0010]本发明的检测原理如下:先让Apt与ssDNA杂交(下划线部分)；当有T-2毒素存在时，杂交链与T-2毒素反应释放出ssDNA;体系中存在Apt- ssDNA (剩余的)，Apt_T_2毒素和ssDNAjpt-T-2毒素不能诱导铜离子还原成近红外荧光铜纳米粒子，Apt-T-2毒素存在对测定无干扰;杂交链可能有干扰;为了消除杂交链的干扰:a.利用DNA扩增，使杂交链成双链DNA，b.用核酸外切酶，将双链DNA水解成单核苷酸，除去了双链DNA。此时体系中只留下可诱导生成近红外荧光铜纳米粒子的ssDNA，通过检测体系的荧光强度，可以测定T-2毒素的含量。由于消除体系中背景荧光的干扰，提高了检测的灵敏度和精度。
[0011]本发明另外提供了一种检测T-2毒素的试剂盒，其至少包括:T-2毒素核酸适体、可与Τ-2毒素核酸适体杂交的单链信号探针ssDNA、DNA扩增体系、外切酶、铜离子还原检测体系O
[0012]所述T-2 毒素核酸适体为 5 ’ -CAGCTCAGAAGCTTGATCCTGTATATCAAGCATCGCGTGTTTACACATGCGAGAGGTGAAGACTCGCA-3，。
[0013]所述的单链信号探针ssDNA 为 5 ’ _xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxTTTTGCGAGTCTTCACC-3’。
[0014]所述DNA扩增体系包括缓冲溶液、三磷酸脱氧单核苷酸混合溶液(dNTP)和Phi29DNA聚合酶。所述缓冲溶液由Tris-HCl、MgCl2和(NH4)2SO4组成。
[0015]所述外切酶为Exo III核酸外切酶。
[0016]所述的铜离子还原检测体系中还原剂为维生素C。
[0017]本发明还提供了一种可用于检测T-2毒素的T-2毒素核酸适体，其碱基序列为5’-CAGCTCAGAAGCTTGATCCTGTATATCAAGCATCGCGTGTTTACACATGCGAGAGGTGAAGACTCGCA-3’。
[0018]本发明的优点
根据本发明的检测方法和试剂盒，消除了背景荧光的干扰，提高了 T-2毒素的检测灵敏度和精度。
【附图说明】
[0019]图1为ssDNA-铜纳米粒子荧光强度与T_2毒素的浓度关系。
【具体实施方式】
[0020]实施例1
本发明的检测Τ-2毒素的试剂盒至少包括:Τ-2毒素核酸适体、单链信号探针ssDNA、DNA扩增体系、核酸外切酶、铜离子还原检测体系。所述的T-2毒素核酸适体为5’-CAGCTCAGAAGCTTGATCCTGTATATCAAGCATCGCGTGTTTACACATGCGAGAGGTGAAGACTCGCA-3 ’。所述的单链信号探针 ssDNA为 5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCGAGTCTTCACC-3’。所述的DNA扩增体系包括缓冲溶液(Tris-HCl、MgCl2、(NH4)2SO4)、dNTP和Phi29DNA聚合酶。所述核酸外切酶为Exo III核酸外切酶。
[0021 ] 实施例2
一种快速检测T-2毒素的方法，具体操作过程如下:
将各DNA储备液在95°C下经加热处理5分钟，使用前，并在室温下放置30分钟。然后，分别取含3.0 μ??ο? τ-2毒素核酸适体Apt的杂交缓冲溶液40 μ!^Ρ3.0 μπιο?信号探针ssDNA的杂交缓冲溶液40 yL置于2ml离心管中，在37°C下杂交I小时，生成T-2毒素核酸适体-信号探针杂交物(Apt - ssDNA) ο
[0022]在37°C下，分别依次将浓度为O?50 ng/mL的T-2毒素添加到Apt- ssDNA溶液中，Τ-2毒素与T_2毒素核酸适体反应， 生成核酸适体_T_2毒素， 释放出 ssDNA。 这时 ，体系中有ssDNA、剩余(未反应的)Apt- ssDNA和核酸适体-T-2毒素等物质。
[0023]加入10 yL缓冲溶液(缓冲溶液组成为50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2,10 mM(NH4)2SO4lPH 7.8 )，然后加入dNTP (10 mM) 18 yL。再向体系中加入2yL Phi29 DNA 聚合酶(10 u/μ?),在37°C下反应15分钟，使得以T-2毒素核酸适体-信号探针杂交序列(Apt-ssDNA)为摸板扩增成双链DNA。在65°C下保持10分钟使Phi29 DNA去活。
[0024]再向该反应体系中加入2yL Exo III核酸外切酶(20 u/yL)，在37°C下反应30分钟，使选择性地将双链DNA水解成单核苷酸，单链探针ssDNA不被切割而保留下来。
[0025]向反应液中加入25 yL I mmol硝酸铜和180 yL PBS缓冲液(10 mM，pH7.8)。然后，混合物在室温下避光或暗室中放置10分钟后，在快速搅拌下，加入10yL浓度为ImM的新制备的维生素C溶液。然后在45°C下反应5?10 min。将溶液转移至微量比色皿，测定体系的荧光强度，进行T-2毒素的定量测定，结果如图1所示。
[0026]线性范围0.08 - 25 ng/mL，检测限0.05 ng/mL，回收率在94.5?112.2%。其它真菌毒素等生物小分子T-2毒素的检测无干扰。
【主权项】
1.一种快速检测T-2毒素的方法，其特征是，该方法包括如下步骤: (Α)Τ-2毒素核酸适体Apt与单链信号探针ssDNA杂交，形成杂交链； (B)使该杂交链与待测样品作用，当待测样品中有T-2毒素存在时，杂交链选择性地与T-2毒素反应释放出单链信号探针ssDNA; (C)为了消除杂交链的干扰，利用DNA扩增，使杂交链成双链DNA，然后用外切酶，选择性地将双链DNA水解成单核苷酸，留下单链信号探针ssDNA ； (D)利用T-2毒素核酸适体-T-2毒素结合体不能诱导铜离子还原生成近红外荧光的铜纳米粒子，只有单链信号探针ssDNA能够诱导铜离子还原成近红外荧光铜纳米粒子，检测体系的荧光强度，从而测定待测样品中的T-2毒素的含量。2.根据权利要求1所述的快速检测T-2毒素的方法，其特征是，所述T-2毒素核酸适体为5’-CAGCTCAGAAGCTTGATCCTGTATATCAAGCATCGCGTGTTTACACATGCGAGAGGTGAAGACTCGC-3’。3.根据权利要求1或2所述的快速检测T-2毒素的方法，其特征是，所述的信号探针ssDNA为5 ’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCGAGTCTTCACC-3 ’。4.权利要求1所述的快速检测T-2毒素的方法，包括检测T-2毒素的试剂盒，其至少包括:T-2毒素核酸适体、信号探针ssDNA、DNA扩增体系、核酸外切酶、铜离子还原检测体系。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征是，所述T-2毒素核酸适体为5’-CAGCTCAGAAGCTTGATCCTGTATATCAAGCATCGCGTGTTTACACATGCGAGAGGTGAAGACTCGC-3’。6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征是，所述的信号探针DNA为5’ -TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCGAGTCTTCACC_3’。7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征是，所述DNA扩增体系包括缓冲溶液、dNTP和Phi29 DNA聚合酶；所述缓冲溶液由Tris-HCl、MgCl2、(NH4)2SO4组成。8.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征是，所述核酸外切酶为ExoIII核酸外切酶。9.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征是，所述的铜离子还原检测体系中还原剂为维生素C。10.—种可用于检测T-2毒素的T-2毒素核酸适体，其特征是，其碱基序列为5’-CAGCTCAGAAGCTTGATCCTGTATATCAAGCATCGCGTGTTTACACATGCGAGAGGTGAAGACTCGC-3’。
【专利摘要】本发明涉及一种快速检测T-2毒素的方法，该方法包括如下步骤：（A）使T-2毒素核酸适体与单链信号探针DNA杂交，形成杂交链；（B）使该杂交链与待测样品接触，当待测样品中有T-2毒素存在时，杂交链与T-2毒素反应释放出单链信号探针DNA；（C）利用DNA扩增，使杂交链成双链DNA，然后用外切酶，将双链DNA水解成单核苷酸，此时体系中留下单链信号探针DNA；（D）在单链DNA诱导下，铜离子还原生成近红外荧光铜纳米粒子；检测体系荧光强度，从而测定待测样品中的T-2毒素的含量。该方法具有高灵敏度，操作简单、快速，成本低等特点。
【IPC分类】G01N21/64
【公开号】CN105548119
【申请号】CN201610043520
【发明人】易守军, 曾秀颜, 邓克勤, 黄昊文, 唐春然, 夏晓东
【申请人】湖南科技大学
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2016年1月24日