一种测定蛋白稳定性的方法
【专利摘要】本发明公开了一种测定蛋白稳定性的方法。本发明的方法的具体步骤如下：(1)将待测蛋白与带化学反应活泼基团的荧光试剂进行反应形成化学键，再去除未反应的荧光试剂，制备携带荧光探针的蛋白样品；(2)对携带荧光探针的蛋白样品进行变性处理，至设定的变性强度值，然后降低或者增高变性强度，记录不同变性强度下测得的荧光值，绘制荧光值随变性强度变化的曲线，形成荧光值随变性强度增加和降低的轨迹；(3)通过分析荧光值随变性强度增加和降低的轨迹是否重叠，分析待测蛋白样品是否发生不可逆失活；其重叠时的最大变性强度值为蛋白发生不可逆失活的变性强度值。本发明的测定方法简单，结果准确。
【专利说明】
-种测定蛋白稳定性的方法
技术领域
[0001] 本发明设及的是一种生物技术领域的测定方法，特别是设及一种测定蛋白稳定性 的方法。
【背景技术】
[0002] 酶及其它蛋白产品作为分析工具及工业催化剂使用的瓶颈常常在于它们需要一 个极其"溫和"的环境;另外，蛋白产品保存限期短也是一项严重的缺陷。因此，蛋白的稳定 性是整个生物技术工业领域需要重点考虑的问题之一。蛋白的稳定状态取决于各种影响因 素，如溫度，剪切力，pH，盐离子，有机试剂，去污剂及压力等。其中溫度是影响蛋白稳定最重 要的因素，溫度升高会导致大多数蛋白变性失活。
[0003] 蛋白稳定性常通过将各种光谱及量热技术联用测定。测定蛋白热稳定性常使用的 光谱技术包括紫外(UV)吸收，近紫外和远紫外圆二色谱(CD)，傅立叶变换红外(FT-IR)光 谱，核磁共振(NMR)光谱，拉曼光谱，内源外源巧光，W及各种形式的光散射测量。常使用的 量热技术包括差示扫描量热技术(DSC)。运些技术能从不同角度测定在变性条件后蛋白的 各种高级(二级，Ξ级，四级)结构的变化。
[0004] W各种常规方法，如DSC，CD，内源巧光，光散射，差示扫描巧光技术等能测得蛋白 整体构象变化。但是蛋白在其活性部位常常具有更强的柔性，在变性过程中蛋白失活速度 远大于蛋白整体构象解折叠速度(Chen-Lu Tsou,science,262:380-381,1993)。如在相同 盐酸脈浓度下，测得肌酸激酶失活速率约为其构象解折叠速率的1000倍。因此用上述常规 方法往往不能准确测定环境变化引起的蛋白活性的变化。
[0005] 通过定点标记的方法能准确测定蛋白的活性变化。如Tsou，C丄.等(Zhou，Η. Μ et al，Biochem.J. 291:103-107，1993)在肌酸激酶活性位点附近的切s残基上引入巧光探针， 测得盐酸脈诱导的巧光强度下降与蛋白酶活性下降变化趋势一致。Carl Frieden等(Qin am et al，J.Mol.Biol ,345:599-610,2005)将鼠腺巧脱氨酶(mADA)上第161位色氨酸标记 成[6-19鬥，测得尿素诱导的核磁共振谱的变化与酶活变化趋势一致。
[0006] 但是寻找到合适的标记位点W及进行定点标记操作均十分困难，因此就有必要开 发一种既能准确测定蛋白不可逆失活，操作又很简便的方法。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种准确、简便，能利用极少量样品测定蛋白稳定性的新型 方法。
[000引本发明的技术原理是W巧光探针可灵敏地指示蛋白结构扰动为基础，通过分析变 性强度巧光值轨迹是否重叠指示蛋白是否发生不可逆失活。
[0009] 本发明是通过W下技术方案实现的。
[0010] 本发明提供一种测定蛋白稳定性的方法，具体步骤如下：
[0011] (1)将待测蛋白与带化学反应活泼基团的巧光试剂进行反应形成化学键，制备携 带巧光探针的蛋白样品；
[0012] (2)对携带巧光探针的蛋白样品进行变性处理，先升高至设定的变性强度值，然后 降低变性强度，记录不同变性强度下测得的巧光值，绘制巧光值随变性强度变化的曲线，形 成巧光值随变性强度增加和降低的轨迹；
[0013] (3)通过分析巧光值随变性强度增加和降低的轨迹是否重叠，分析待测蛋白是否 发生不可逆失活;其重叠时的最大变性强度值为待测蛋白发生不可逆失活的变性强度值。
[0014] 本发明中，步骤（1)中，所述巧光试剂的巧光基团选自巧光素，香豆素，罗丹明，鲁 米诺，派洛宁，尼罗红，酪红，巧黄绿素，耐尔蓝，台吩蓝，甲酪紫或漠化乙晚，及其衍生物中 任一种。
[0015] 本发明中，步骤（1)中，巧光试剂的化学反应活泼基团选自异硫氯酸，横酷氯，班巧 酷亚胺醋，横基班巧酷亚胺醋，乙酷甲醋，醒基，簇基，胺基或琉基中任一种或几种。
[0016] 本发明中，步骤(3)中，采用巧光值不可逆重叠程度Di分析巧光值随变性强度增加 和降低的轨迹是否重叠，当Di值大于等于基线标准差的3倍表示变性强度增加和降低的巧 光值轨迹开始不重叠;其计算公式如下所示：
[0017]
[0020] Fh，Fl，y分别表示变性强度升高过程中某变性强度时的巧光值，变性强度降低过 程中对应于变性强度升高过程中相同变性强度的巧光值，一次升降变性强度处理中升高及 降低在对应变性强度下巧光强度比值所构成的数组。
[0021] 本发明中，步骤（1)中，所述变性处理选自加热，加压，加盐，加剪切力，改变pH，加 去污剂处理中任一种。
[0022] 本发明中，所述变性强度为溫度、压强盐度，剪切力，pH，去污剂中任一种。
[0023] 本发明中，步骤（1)中，待测蛋白选自但不限于医药药用蛋白和/或多肤，如抗体、 凝血因子、细胞因子、酶。待测蛋白选自但不限于工业用蛋白和/或多肤，如蛋白酶、淀粉酶、 漆酶。
[0024] 本发明的有益效果在于:其方法简单，测试用料少，灵敏度高，结果准确。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合实施例对本发明作进一步阐述，W下实施方式只W举例的方式描述本发 明。很明显，本领域普通技术人员可在本发明的范围和实质内，对本发明进行各种变通和修 改。需要了解的是，本发明意欲涵盖在所附权利要求书中包括的变通和修改。
[00%] 实施例1
[0027]牛膜蛋白酶(2.5mg/mL，溶于0.1M碳酸盐缓冲液，pH 9.0，含20mM节脉）中逐滴加入 异硫氯酸巧光素 （fluorescein isothiocyanate ,F]；TC) (5mg/mL，溶于DMSO)，边加边混匀， 再加入DMSO。遮光，室溫，旋转反应化。遮光，4°C，将标记产物对ImM肥L(抑3.0)透析除去 游离FITC及节脉抑制剂，每8h更换透析液，直至透析液A495和A280降为背景值。4°C， 1000化pm，离屯、5分钟，取上清即为FITC标记的膜蛋白酶。对蛋白及FITC含量进行定量。FITC 标记的膜蛋白酶用50mM Tris-肥L缓冲液(含lOmM化Cl2，p朋.0)稀释。取50化稀释后的样 品置于PCR管中，通过实时定量PCR仪对样品进行不同溫度的升溫及降溫处理，记录升溫及 降溫巧光值轨迹(激发波长470nm，发射波长510nm)，并根据公式1和公式2计算Di值，通过化 值对巧光值轨迹的重叠程度进行定量。设置升溫起始溫度为30°C，分别升溫至35Γ，4(TC， 45°C，50°C，56°C，6rC，66°C，90°C后，再依次降至30°C，升降溫速度为rC/30s，每次升降溫 处理后换新样品进行新一轮升降溫，每个溫度点重复Ξ次。膜蛋白酶的生物活性通过测定 其对化-ΒΑΡΑ的水解速度。在激发波长290nm下，记录膜蛋白酶的色氨酸內源巧光发射峰的 峰谱，步长为5nm。內源巧光发射峰红移程度用中间光谱质量<V>定量，其计算公式为:公式3
[002引
[0029] 其中：Vi为波数(wave number)，Fi为Vi下的巧光强度。
[0030] Di，V，酶活下降与最大加热溫度的关系用dose-response model进行拟合：
[0031]
公式 4
[0032] 其中y为因变量(剩余酶活，Di或者V)，x为最大加热溫度，yO和ymax为起始值和最 大值，b是斜率因子，C是达到最大值1/2所需的最大加热溫度。V值达到基线值标准偏差的3 倍认为蛋白质的內源巧光开始发生不可逆变化。该值所对应的溫度为蛋白质內源巧光发射 峰开始发生不可红移的溫度。图1显示在最大加热溫度在45度W下，升溫降溫巧光值轨迹几 乎可W重叠。但是在45度W上，升溫降溫巧光值轨迹不能重叠，且随着最大加热溫度的增大 升降溫巧光值轨迹不重叠程度增大。图1中实线为升溫巧光值轨迹，虚线为降溫巧光值轨 迹。图2显示牛膜蛋白酶酶活丧失值（0),01值（)与最大加热溫度的关系，二者变化趋势 一致。图3显示牛膜蛋白酶酶活下降值（Π )，ν值(Δ)与最大加热溫度的关系。根据拟合曲线 和定义，计算出蛋白质开始发生不可逆失活，內源巧光开始发生不可逆红移，升溫降溫巧光 值轨迹开始不能重叠的溫度，分别为44.4 ± 0.7 °C，46.7 ± 0.2°C，49.4 ± 0.9 °C。升降溫巧光 值轨迹开始不能重叠的溫度更加接近于牛膜蛋白酶开始发生不可逆失活的溫度。即与內源 巧光相比，我们的方法比能更加准确地指示蛋白质不可逆失活。
[0033] 实施例2
[0034] 牛膜蛋白酶(2.5mg/mL，溶于0.1M碳酸盐缓冲液，pH 9.0，含20mM节脉）中逐滴加入 FITC( 5mg/mL，溶于DMS0)，边加边混匀，加入DMS0。遮光，室溫，旋转反应化。遮光，4 °C，将标 记产物对ImM肥L透析除游离FITC及节脉抑制剂，每化更换透析液，直至透析液A495和A280 降为背景值。4 °C，lOOOOrpm，离屯、5分钟，取上清即为FITC标记的膜蛋白酶。对蛋白及FITC含 量进行定量。FITC标记的膜蛋白酶用ImM HCL(抑3.0)稀释。取50化稀释后的样品置于PCR 管中，通过实时定量PCR仪对样品进行不同溫度的升溫及降溫处理，记录升溫及降溫巧光值 轨迹(激发波长470nm，发射波长510nm)，并根据公式1和公式2计算Di值，通过化值对巧光值 轨迹的重叠程度进行定量。设置升溫起始溫度为30°C，分别升溫至35°C，40°C，45°C，50°C， 56°C，6rC，66°C，90°C后，再依次降至30°C，升降溫速度为rC/30s，每次升降溫处理后换新 样品进行新一轮升降溫，每个溫度点重复Ξ次。膜蛋白酶的生物活性通过测定其对化-ΒΑΡΑ 的水解速度。图4显示当最大加热溫度达到90度时，处于50mM Tris-HCL(pH 9.0， containing 20mM化C12)中的膜蛋白酶，蛋白质活性几乎全部丧失，而Di值也上升至27.3 ±1.0%。但是对处于储存溶液ImM Η化(pH 3.0)中的膜蛋白酶，当最大加热溫度达到90度 时，蛋白质活性下降19.1 ± 3.1 %，而Di仅轻微下降上升至4.32 ± 0.28 % (基线值2.66 ± 0.12%)。该结果表明我们的方法可W辨别保持牛膜蛋白酶热稳定的溶液。
[0035] 实施例3
[0036] 鸡蛋白溶菌酶化en egg white lysozyme)(2.5mg/mL，溶于0.1M碳酸盐缓冲液，pH 9.0)中逐滴加入FITC(5mg/mL，溶于DMS0)，边加边混匀。室溫，遮光，旋转反应比。4°C，遮光， 将标记产物对50mm乙酸钢缓冲液(pH4.6)透析除游离FITC，每化更换透析液，直至透析液 A495降为背景值。4°C，10000巧m，离屯、5分钟，取上清即为FITC标记公式5酶。对蛋白及FITC 含量进行定量。門TC标记的溶菌酶用50mM憐酸钟缓冲液(pH7.0)稀释。取50化稀释后的样品 置于PCR管中，通过RT-PCR仪对样品进行不同溫度的升溫及降溫处理，记录升降溫过程的巧 光值轨迹(激发波长470nm，发射波长510nm)，并根据公式1和公式2计算化值，通过化值对巧 光值轨迹的重叠程度进行定量。设置升溫起始溫度为25°C，分别升溫至45°C，55°C，65°C，75 °C，85°C，95°C后，再依次降至25°C，升降溫速度为rC/30s，每次升降溫处理后换新样品进 行新一轮升降溫，每轮升降溫重复Ξ次。W溶壁微球菌为底物，测定未经处理及经不同溫度 处理的溶菌酶的剩余活力做验证。在激发波长290nm下，记录膜蛋白酶的色氨酸內源巧光发 射峰的峰谱，步长为5nm。內源巧光发射峰红移程度用中间光谱质量<V>定量(见公式4) D〇i， V，酶活下降与最大加热溫度的关系用dose-response model进行拟合(见公式5)。根据拟合 曲线和定义，计算出蛋白质开始发生不可逆失活，內源巧光开始发生不可逆红移，升溫降溫 巧光值轨迹开始不能重叠的溫度，分别为73.4 ± 0.8 °C，79.3 ± 1.2 °C，75.5 ± 0.7 °C。升降溫 巧光值轨迹开始不能重叠的溫度更加接近于溶菌酶开始发生不可逆失活的溫度。即与內源 巧光相比，我们的方法比能更加准确地指示蛋白质不可逆失活。
[0037] 实施例4
[0038] 核糖核酸酶A(化ase A)(2.5mg/mL，溶于0.1M碳酸盐缓冲液，pH 9.0)中逐滴加入 FITC( 5mg/mL，溶于DMS0)，边加边混匀。遮光，室溫，旋转反应化。遮光，4°C，将标记产物对 50mM乙酸钢缓冲液(PH4.6)透析除游离FITC，每化更换透析液，直至透析液A495降为背景 值。4°C，10000巧m，离屯、5分钟，取上清即为FITC标记的核糖核酸酶A。对蛋白及FITC含量进 行定量。FITC标记的核糖核酸酶A用50mM憐酸钟缓冲液(PH7.0)稀释。取50化稀释后的样品 置于PCR管中，通过RT-PCR仪对样品进行不同溫度的升溫及降溫处理，记录升降溫过程的巧 光值轨迹(激发波长470皿，发射波长510皿），并根据公式1和公式2对巧光值轨迹重叠情况 进行定量。设置升溫起始溫度为25 °C，分别升溫至45 °C，55 °C，65 °C，75°C，85°C，95°C后，再 依次降至25°C，升降溫速度为rC/30s，每次升降溫处理后换新样品进行新一轮升降溫，每 轮升降溫重复Ξ次。最大加热溫度35°C，45°C，55°C，65°C，75°C，85°C，95°C后所对应的Di值 分别为 1.7±0.2，1.8±0.1，1.8±0.3，1.6±0.2,2.3±0.1，1.8±0.2，1.9±0.2。该结果表 明在50mM憐酸钟缓冲液(pH7.0)中，核糖核酸酶A达到95 °C仍对热稳定。
[0039] 实施例5
[0040] 牛血清白蛋白（bovine serum a化umin,BSA)(lmg/mL，溶于0.1 M PBS缓冲液，pH 7.0)中逐滴加入FITC( 2M，溶于DMSO)，边加边混匀。遮光，4 °C旋转反应过夜。遮光，4 °C，将标 记产物对0.1M PBS缓冲液(pH 7.0)透析除游离FITC，每化更换透析液，直至透析液A280降 为背景值。取50化的样品置于PCR管中，通过实时定量PCR仪对样品进行不同溫度的升溫及 降溫处理，记录升溫及降溫巧光值轨迹(激发波长47化m，发射波长51化m)，并根据公式1和 公式2对巧光值轨迹重叠情况进行定量。设置升溫起始溫度为25°C，分别升溫至35°C，45°C， 55°C，65°C，75°C，90°C后，再依次降至25°C，升降溫速度为rC/min，每次升降溫处理后换新 样品进行新一轮升降溫，每个溫度点重复Ξ次。最大加热溫度35°C，45°C，55°C，65°C，75°C， 90°C所对应的Di值分别为0.017,0.042,0.032,0128,0.463，1.050。该结果提示在O.IM PBS 缓冲液(pH 7.0)中，BSA在55°C~65°C之间开始发生不可逆热失活。
[0041 ] 实施例6
[0042] 金黄色葡萄球菌A蛋白（Sta地ylococal Protein A，SPA)(lmg/mL，溶于0.1M PBS 缓冲液，pH 7.0)中逐滴加入FITC(2M，溶于DMSO)，边加边混匀。遮光，4°C旋转反应过夜。遮 光，4°C，将标记产物对0.1M PBS缓冲液(pH 7.0)透析除游离FITC，每化更换透析液，直至透 析液A280降为背景值。取50化的样品置于PCR管中，通过实时定量PCR仪对样品进行不同溫 度的升溫及降溫处理，记录升溫及降溫巧光值轨迹(激发波长470皿，发射波长510皿），并根 据公式1和公式2对巧光值轨迹重叠情况进行定量。设置升溫起始溫度为25Γ，分别升溫至 35°C，45°C，55°C，65°C，75°C，90°C后，再依次降至25°C，升降溫速度为rC/min，每次升降溫 处理后换新样品进行新一轮升降溫，每个溫度点重复Ξ次。最大加热溫度35°C，45°C，55°C， 65 °C，75°C，90°C所对应的Di值分别为0.044，0.022，0.044，0.047，0.045，0.040。该结果表 明在0.1M PBS缓冲液(pH7.0)中，SPA达到90°C仍对热稳定。
[0043] 实施例7
[0044] β-乳球蛋白化-lactglobulin，0-Lg)(lmg/mL，溶于0.1M PBS缓冲液，pH 7.0)中逐 滴加入FITC(2M，溶于DMS0)，边加边混匀。遮光，4 °C旋转反应过夜。遮光，4度，将标记产物对 0.1M PBS缓冲液(pH 7.0)透析除游离FITC，每化更换透析液，直至透析液A280降为背景值。 取50化的样品置于PCR管中，通过实时定量PCR仪对样品进行不同溫度的升溫及降溫处理， 记录升溫及降溫巧光值轨迹(激发波长470nm，发射波长51化m)，并根据公式1和公式2对巧 光值轨迹重叠情况进行定量。设置升溫起始溫度为25°C，分别升溫至35°C，45°C，55°C，65 °C，75°C，90°C后，再依次降至25°C，升降溫速度为rC/lmin，每次升降溫处理后换新样品进 行新一轮升降溫，每个溫度点重复Ξ次。最大加热溫度35°C，45°C，55°C，65°C，75°C，90°C所 对应的Di值分别为0.037，0.463，0.452，0.226，0.155，0244。该结果表明在0.1 M PBS缓冲液 (pH 7.0)中，β-Lg在35~45°C之间即开始发生不可逆热失活。
[0045] W上，本发明在对样品用巧光探针随机标记后，升溫及降溫巧光值轨迹开始发生 不可逆重叠的溫度与样品开始发生不可逆失活的溫度接近，并且该溫度低于蛋白质样品色 氨酸內源巧光发射峰开始发生红移的溫度。因而该方法能够更准确，简便地指示蛋白质样 品开始发生不可逆失活的溫度。此外，该方法能够鉴定出牛膜蛋白酶的保存溶液。当与Q- PCR设备联用，该方法可W用于高通量筛选蛋白类药物和工业用酶的保存溶液及稳定剂W 及生物医药制剂配方的筛选与评价。
【主权项】
1. 一种测定蛋白稳定性的方法，其特征在于，具体步骤如下： (1) 将待测蛋白与带化学反应活泼基团的荧光试剂进行反应形成化学键，制备携带荧 光探针的蛋白样品； (2) 对携带荧光探针的蛋白样品进行变性处理，先增高至设定的变性强度值，然后降低 变性强度，记录不同变性强度下测得的荧光值，绘制荧光值随变性强度变化的曲线，形成荧 光值随变性强度增加和降低的轨迹； (3) 通过分析荧光值随变性强度增加和降低的轨迹是否重叠，分析待测蛋白是否发生 不可逆失活;其重叠时的最大变性强度值为待测蛋白发生不可逆失活的变性强度值。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤（1)中，所述荧光试剂的荧光基团选自 荧光素，香豆素，罗丹明，鲁米诺，派洛宁，尼罗红，酚红，钙黄绿素，耐尔蓝，台盼蓝，甲酚紫 或溴化乙啶，及其衍生物中任一种。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤（1)中，荧光试剂的化学反应活泼基团 选自异硫氰酸，磺酰氯，琥珀酰亚胺酯，磺基琥珀酰亚胺酯，乙酰甲酯，醛基，羧基，胺基或巯 基中任一种或几种。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，采用参数Di分析荧光值随变性 强度增加和降低的轨迹是否重叠，当Di值大于等于基线标准差的3倍表示变性强度增加和 降低的荧光值轨迹开始不重叠;其计算公式如下所示：其中： Fh，Fl，y分别表示变性^^, , 性强度降低过程中 对应于变性强度升高过程中相同变性强度的荧光值，一次升降变性强度处理中升高及降低 在对应变性强度下荧光强度比值所构成的数组。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1)中，所述变性处理选自加热，加压， 加盐，加剪切力，改变pH，加去污剂处理中任一种。6. 根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述变性强度为温度、压强盐度，剪切 力，pH，去污剂中任一种。
【文档编号】G01N21/64GK105842212SQ201610171129
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年3月24日
【发明人】李荣秀, 仲从浩, 王, 王一
【申请人】上海交通大学