一种测定植物油脱臭馏出物中不同形式植物甾醇含量的方法
【专利摘要】本发明公开了一种测定植物油脱臭馏出物中不同形式植物甾醇含量的方法，该方法包括：对脱臭馏出物作皂化处理，得皂化液；向皂化液中加入内标，用有机溶剂萃取，收集有机萃取层，得待测液；绘制标准曲线；对待测液作气相色谱分析，获得待测液中各待测植物甾醇与内标的峰面积比，依据对应标准曲线，计算各植物甾醇的含量；色谱条件：热稳定性高于280℃的中等极性柱；进样口温度280～290℃；柱温200～300℃；进样量1μl；分流比20:1～40:1；柱流量1.0～1.5ml/min；FID检测器温度290～300℃；H2 40ml/min；空气400ml/min。本发明方法步骤简单，对甾醇分离效果好，结果准确可靠。
【专利说明】
一种测定植物油脱臭馏出物中不同形式植物甾醇含量的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种植物留醇的检测方法，具体涉及一种测定植物油脱臭馏出物中不 同形式植物留醇含量的方法。
【背景技术】
[0002] 脱臭馏出物是植物油脂精炼工艺的副产物，成分较为复杂，主要包括游离脂肪酸、 生物酚(VE)、留醇、留醇酯、中性油一甘三酯、甘一酯，甘二酯和角鲨烯等，目前脱臭馏出物 已成为提取天然VE和植物留醇、留醇酯的重要原料。
[0003]植物留醇是自然界中的一类留族化合物，属于饱和(或不饱和）的仲醇。植物甾醇 因具有降胆固醇功效，近年来受到广泛的关注。此外，植物留醇还具有抑制肿瘤、防治心脏 病、抗癌、调节免疫功能的作用，被科学界誉为"生命的钥匙"。
[0004]植物留醇在植物油脱臭馏出物中主要以游离态留醇和结合态留醇酯两种形式存 在，其中游离态甾醇主要为菜籽甾醇、菜油甾醇，豆甾醇和谷甾醇这四种。目前，对甾醇的 主要分析方法有称重法、分光光度法、高效液相色谱法、气相色谱法、毛细管电泳法等。
[0005] 但传统气相色谱法检测留醇往往需要对其进行衍生化，费时费力；高效液相色谱 法检测留醇含量时，正相条件下往往只能获得单一的留醇峰，不能对不同种类的留醇进行 分别定量，反相色谱条件虽能将不同种类留醇进行较好的分离，但是往往运行时间较久，且 甾醇的检测波长较低(205~210nm)，流动相和样品基质中的其它杂质都易对其检测产生干 扰，影响结果的准确性。
[0006] 虽然目前脱臭馏出物获得了越来越广泛的应用，但几乎所有分析留醇的方法都是 针对动植物油脂的，对于植物油脱臭馏出物中各植物留醇及其含量的分析检测方法还鲜有 报道。第三方检测机构在测定植物油脱臭馏出物中留醇含量时一般按照国标GB/T 25223-2010《动植物油脂留醇组成和留醇总量的测定:气相色谱法》进行检测，该国标法的分析过 程是：样品用氢氧化钾-乙醇溶液回流皂化后，不皂化物以氧化铝层析柱进行固相萃取分 离;脂肪酸阴离子被氧化铝层析柱吸附，留醇则流出层析柱;通过薄层色谱法将留醇与其他 不皂化物分离;对收集到的留醇作硅烷衍生化处理，以桦木醇为内标，通过气相色谱法对甾 醇及其含量进行定性和定量。
[0007] 国标法的不足之处在于：
[0008] ①提取不皂化物时必须采用氧化铝层析柱，不可用硅胶柱或其他柱代替，也不可 采用溶剂萃取法，这是因为该国标分析法容易受脂肪酸干扰，而氧化铝层析柱的电中性表 面偏向于保留负电子化合物，从而能够将脂肪酸阴离子与留醇分离开来;硅胶柱或溶剂萃 取则难以消除脂肪酸的干扰；
[0009]②由于需要采用氧化铝层析柱对样品进行纯化，这会造成部分样品的损失，使得 检测结果偏小；
[0010]③利用薄层色谱法分离留醇与其他不皂化物时，留醇含量损失较大，难以准确对 样品中的留醇含量作出较为准确的定量；
[0011] ④由于留醇熔点高、较难气化，而目前气相色谱仪中所使用的色谱柱的耐高温性 能较差255°C)，因此一般在气相分析前均需要对待测样品作硅烷衍生化处理，衍生化处 理后的留醇气化温度降低，从而在较低温度（< 255°C)的气相条件下样品亦可以被气化检 测，增加了分析步骤的繁琐程度。
[0012] 因此，开发一种简单高效，灵敏度高，样品前处理及定量方法准确可靠的测定脱臭 馏出物中植物留醇的分析检测方法，对植物留醇提取加工企业具有十分重要的意义。
【发明内容】
[0013] 本发明提供了一种测定植物油脱臭馏出物中不同形式植物留醇含量的方法，该检 测分析方法简单高效、灵敏度高。
[0014] -种测定植物油脱臭馏出物中不同形式植物留醇含量的方法，包括以下步骤：
[0015] (1)对所述植物油脱臭馏出物进行皂化处理，得皂化液；
[0016] (2)向所述皂化液中加入内标，并用有机溶剂进行萃取，收集有机萃取层，得待测 液；
[0017] (3)配制同时含有内标和多种待测植物甾醇的系列标准溶液，针对标准溶液中的 每种待测植物留醇，以该待测植物留醇与内标的峰面积比为横坐标，以该待测植物留醇与 内标的浓度比为纵坐标，绘制标准曲线；
[0018] (4)将所述待测液注入气相色谱仪进行分析，获得待测液中各待测植物甾醇与内 标的峰面积比，并依据对应的标准曲线，计算得到植物油脱臭馏出物中各待测植物留醇的 含量；
[0019] 色谱条件为：
[0020]色谱柱:热稳定性高于280 °C的中等极性柱；
[0021] 进样 口温度：280 ~290 Γ;
[0022] 柱温：200 ~300 Γ;
[0023] 进样量：1μ1;
[0024] 分流比：20:1 ~40:1;
[0025] 柱流量：1 · 0~1 · 5ml/min;
[0026] FID 检测器温度：290 ~30(TC;
[0027] H2：40ml/min；
[0028] 空气：400ml/min。
[0029] 本发明所使用的色谱条件能使脂肪酸与胆固醇、留醇获得良好的色谱分离，不会 对分析造成干扰，所以样品前处理过程中无须采用氧化铝柱将其中的脂肪酸进行严格去 除，直接采用有机溶剂萃取即可，不仅大大减少了样品在前处理过程中的损失量，简便了前 处理步骤，而且由于在皂化液中先加入内标再进行萃取，内标与目标化合物同步损失，最大 程度地保证了检测结果的准确性。
[0030] 本发明使用热稳定性高于280°C的中等极性柱进行气相色谱分析，这是因为在中 等极性柱中植物留醇具有较好的分离效果；同时这类色谱柱能耐至少280°C高温，在280°C 下各植物留醇即使未作硅烷衍生化处理也能直接气化、直接进样分析，不仅大大简化了前 处理步骤，而且样品中的留醇能够被灵敏检测，保证了留醇的分离效果。
[0031] 如未作特殊说明，本发明中所指"不同形式植物留醇"是指菜籽留醇、菜油留醇、豆 甾醇和β-谷留醇，这四种留醇是植物油脱臭馏出物的常规检测项目。
[0032] 具体地，本发明一种测定植物油脱臭馏出物中不同形式植物留醇含量的方法包括 以下步骤：
[0033] (1)对所述脱臭馏出物进行皂化处理，得皂化液；
[0034] 所述皂化处理为:将所述植物油脱臭馏出物溶于碱溶液中，在煮沸回流条件下反 应1.5~2.5h，得到皂化液。
[0035] 作为优选，所述碱溶液为溶解有碱性物质的乙醇水溶液，碱性物质的质量分数为 30~40%，所述乙醇水溶液中乙醇与水的体积比为4:1。
[0036] 所述碱性物质为氢氧化钾或氢氧化钠，更优选为氢氧化钾。碱性物质的质量分数 太少的话，会使得皂化反应不易进行;太多的话后处理时需要更多的酸去进行中和，造成不 必要的浪费。
[0037]作为优选，所述植物油脱臭馏出物与碱溶液的质量体积比为1:20~l:10g/mL。碱 溶液中以乙醇水作为溶剂，若碱溶液使用量过多，乙醇会溶解部分留醇并与水共溶，不利于 后续采用有机溶剂对皂化液进行萃取。并且，同上所述，考虑到碱性物质的用量与反应后处 理的操作简便，此条件下较合适。
[0038] (2)向所述皂化液中加入内标，并用有机溶剂进行萃取，收集有机萃取层，得待测 液；
[0039] 作为优选，加入内标后，先将皂化液pH调至5~7,再用有机溶剂进行萃取，收集有 机萃取层;进一步地，将获得的有机萃取液水洗至中性，充分静置分层，取有机层即为待测 液。
[0040] 先将皂化液pH调至弱酸性再萃取，是因为皂化液中含有大量脂肪酸，在碱性条件 下脂肪酸会生成脂肪酸盐，而脂肪酸盐的存在会使萃取时出现皂化现象，不利于有机层的 分层。
[0041] 而将获得的有机萃取液水洗至中性是为了避免待测液对色谱柱造成损害。
[0042] 作为优选，所述内标为胆固醇。内标应当满足以下条件:①是样品中不存在的纯物 质;②其色谱峰位于被测组分的色谱峰附近，或几个被测组分色谱峰的中间，并与这些组分 的色谱峰完全分离;③与被测组分的物理及物理化学性质（如挥发度，化学结构，极性以及 溶解度等)相近。对于本发明的各待测植物留醇，胆固醇均满足以上要求。
[0043]此外，为了保证检测结果的准确性，内标的加入量应当接近试样中待测组分的含 量。
[0044] 萃取所用的有机溶剂应当满足以下条件:①能较好的溶解样品；②与水不互溶;③ 相对安全、低毒。本发明中，作为优选，所述有机溶剂为正己烷或乙醚；由于乙醚的刺激性较 强，因此更优选为正己烷。
[0045] (3)配制同时含有内标和多种待测植物留醇的系列标准溶液，针对标准溶液中的 每种待测植物留醇，以该待测植物留醇与内标的峰面积比为横坐标，以该待测植物留醇与 内标的浓度比为纵坐标，绘制标准曲线；
[0046] (4)将所述待测液注入气相色谱仪进行分析，获得待测液中各待测植物留醇与内 标的峰面积比，并依据对应的标准曲线，计算得到植物油脱臭馏出物中各植物留醇的含量；
[0047] 作为优选，所述色谱柱为50 %二苯基-50 %二甲基聚硅氧烷柱、14 %氰丙基-86 % 二甲基聚硅氧烷柱或6 %氰丙基-94 %二甲基聚硅氧烷柱。这三种色谱柱均符合本发明对色 谱柱的极性和热稳定性要求，但考虑到14%氰丙基-86%二甲基聚硅氧烷柱和6%氰丙基-94 %二甲基聚硅氧烷柱的极性为中等偏低，且其通用性比50 %二苯基-50 %二甲基聚硅氧 烷柱稍差的情况，本发明优选的色谱柱为50%二苯基-50%二甲基聚硅氧烷柱。
[0048]由于生产产家不同，市面上的50%二苯基-50%二甲基聚硅氧烷柱具有不同的规 格型号，如 08-17、册-50+、社1-50、册-17、5?8-50、8?乂-50、0?-3丨12408、28-50等等，具体使 用时可以任意选择。
[0049]作为优选，色谱条件为：
[0050] 色谱柱:50 %二苯基-50 %二甲基聚硅氧烷柱；
[0051 ]色谱柱规格:30m*0 · 25mm*0 · 25μπι;
[0052] 进样 口温度：290 Γ ;
[0053] 柱温程序:200°C维持3min，再以80°C/min升温至290°C，保持20min;
[0054] 进样量：1μ1;
[0055] 分流比：30:1;
[0056] 柱流量：1 · 2ml/min;
[0057] FID 检测器温度：30(TC;
[0058] H2：40ml/min；
[0059] 空气：400ml/min;
[0060] 尾吹 N2:30ml/min。
[0061] 虽然在280°C下各植物留醇即可气化，但为了防止出现冷凝、气化不完全等情况， 相应提高气相色谱分析时的气化温度（即进样口温度)和色谱分离温度（即柱温)能够保证 各植物留醇的分离效果，实现更为精确、灵敏的检测。
[0062] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0063] (1)本发明所使用的色谱条件能使脂肪酸与胆固醇、留醇获得良好的色谱分离，不 会对分析造成干扰，所以样品前处理过程中无须采用氧化铝柱将其中的脂肪酸进行严格去 除，直接采用有机溶剂萃取即可，不仅大大减少了样品在前处理过程中的损失量，简便了前 处理步骤，而且由于在皂化液中先加入内标再进行萃取，内标与目标化合物同步损失，最大 程度地保证了检测结果的准确性；
[0064] (2)本发明使用热稳定性高于280°C的中等极性柱进行气相色谱分析，这是因为在 中等极性柱中植物留醇具有较好的分离效果；同时这类色谱柱能耐至少280°C，在280°C下 各植物留醇即使未作硅烷衍生化处理也能直接气化、直接进样分析，不仅大大简化了前处 理步骤，而且样品中的留醇能够被灵敏检测，保证了留醇的分离效果。
【附图说明】
[0065] 图1为采用本发明的方法检测大豆油脱臭馏出物中不同形式植物留醇的气相色谱 图。
【具体实施方式】
[0066] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明的技术方案作进一步的详细说明。
[0067] 下述实施例中所涉及的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法:所使用的试剂和 材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0068] 下述实施例中所用的气相色谱仪为日本岛津公司生产，配置FID检测器，型号为 GC-2014,色谱柱为Agilent DB-17(30m*0.25mm*0.25ym)〇
[0069] 实施例1
[0070] 本实施例一种测定大豆油脱臭馏出物中不同形式植物留醇含量的方法，包括以下 步骤：
[0071] 1、样品制备
[0072] (1)皂化
[0073] 称取约Ig~1.5g大豆油脱臭馏出物，置于50ml圆底烧瓶中，加入约20ml质量分数 为30%的氢氧化钾碱溶液(Vzif:V水=4:1)，煮沸回流2h，得皂化液。
[0074] (2)配制胆固醇内标液
[0075]准确称取一定量的胆固醇标准品，正丁醇溶解并稀释定容，配制成浓度为2mg/ml 的胆固醇内标液，备用。
[0076] (3)不皂化物的提取
[0077] 待皂化液冷却后，将其转移到250ml分液漏斗中，加入约50ml水，用移液管准确量 取IOml胆固醇内标液，加入到分液漏斗中与皂化液混匀，加入适量稀硫酸调节溶液pH至5~ 7，再用100mL正己烷分3次萃取，萃取方法为:先将适量正己烷倒入皂化瓶中洗涤烧瓶，再倒 入分液漏斗进行萃取，收集3次萃取的正己烷层。
[0078] (4)正己烷萃取液的洗涤
[0079]用适量清水洗涤正己烷提取液至少3次，每次水洗后至少静置3min使其充分分层， 用PH试纸检测至水层不显酸性为止，取正己烷层即为待测液。
[0080] 2、气相色谱分析
[0081] (1)气相色谱条件
[0082] 色谱柱:DB-17;
[0083] 色谱柱规格:30m*0 · 25mm*0 · 25μπι;
[0084] 进样 口温度:290 °C;
[0085] 柱温程序:200°C维持3min，再以80°C/min升温至290°C，保持20min;
[0086] 进样量：1μ1;
[0087] 分流比：30:1;
[0088] 柱流量：1.2ml/min;
[0089] FID 检测器温度：30(TC;
[0090] H2：40ml/min；
[0091] 空气：400ml/min;
[0092] 尾吹N2:30ml/min。（ 2)标准曲线的绘制
[0093] 取含有四种留醇(菜籽留醇、菜油留醇、豆留醇和β-谷留醇）的混合留醇标样，该混 合甾醇标样是
【申请人】精制得到的，再通过标定其准确含量后拿来作为标准品使用。该混合 甾醇标样中总甾醇含量为96.2%，其中菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇的含量分别 为3.7%、23.8%、23.4%和45.3%。
[0094]具体应用时，也可以在国家标准物质网分别购买单一的甾醇标样:菜油甾醇，CAS: 474-60-2;菜籽留醇，CAS: 474-67-9; β-谷留醇，CAS: 83-46-5;豆留醇，CAS: 83-48-7。
[0095] 本实施例中，分别准确称取8mg、30mg、IOOmg上述混合甾醇标样至3个25ml容量瓶 中，分别准确加入IOml浓度为2mg/ml的胆固醇内标液，加入正己烷定容至刻度，获得具有三 个浓度梯度的系列标准溶液。
[0096]在上述色谱条件下，将系列标准溶液分别进样，以留醇与内标峰面积比为横坐标， 甾醇与内标浓度比为纵坐标作图，Microsoft的Excel软件进行回归拟和，得到菜籽留醇、菜 油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇的线性回归方程，结果见表1。
[0097]表1各植物甾醇的线性回归方程
[0099] (3)试样分析
[0100]按照上述气相色谱条件对步骤"1、样品制备"获得的待测液进行气相色谱分析，气 相色谱图如图1，记录各组分峰面积，并根据已绘制的标准曲线计算待测液中各组分的浓度 和含量，结果如表2所不。
[0101 ]表2各组分峰面积及含量
[0103] 3、精密度实验
[0104] 准确称取30mg混合甾醇标样，用移液管精密量取加入IOml胆固醇内标液（2mg/ ml)，再用正己烷定容至25ml，混匀，制得标准品对照液。
[0105] 取上述标准品对照液作为供试液，按照步骤2-(1)的色谱条件对供试液进行气相 色谱分析，记录色谱图及各物质峰面积，共测定6次，考察本实施例检测方法的精密度，结果 见表3。
[0106] 表3精密度实验结果
[0108] 由表3可见，各甾醇和胆固醇内标的检测结果的RSD值均小于10%，表明该方法具 有良好的精密度。
[0109] 4、稳定性实验
[0110] 取步骤3配制的供试液，按照步骤2-(1)的色谱条件每隔5h对供试液作一次气相色 谱分析，考察供试液中各留醇在20h内的稳定性，考察结果见表4。 「01111 弃4趋宙桦St胳结里
[0113] 由表4可见，各甾醇和胆固醇内标的检测结果的RSD值均小于10%，表明供试液中 各甾醇和胆固醇内标在20h内均具有良好的稳定性。
[0114] 5、重复性实验
[0115] 精密称取3份大豆油脱臭馏出物样品，每份1.2g，分别按步骤"1样品制备"制成待 测液，按步骤"2气相色谱分析"方法进样，测定峰面积并计算出各待测组分含量，检测结果 见表5。
[0116]表5重复性实验结果
[0118] 由表5可见，各组分3次重复实验的RSD值分别为1.20 %、1.08%、3.88%、0.51 %， 均小于10%，表明方法重复性良好。
[0119] 6、回收率实验
[0120]精密称取已知组分含量的脱臭馏出物样品6份，每份I.Og~1.5g，再分别精密添加 30mg、60mg、90mg混合甾醇标样，按步骤"1样品制备"制成待测液，按步骤"2气相色谱分析" 方法进样检测，计算出各待测组分含量，计算回收率，考察结果见表6。
[0121]表6回收率实验结果
[0123]由表6可见，每个样品中各组分的回收率都在90~110%之间，回收率良好。
[0124] 7、准确率试验
[0125] 采用国标GB/T 25223-2010《动植物油脂甾醇组成和甾醇总量的测定：气相色谱 法》对与步骤1中相同的大豆油脱臭馏出物样品进行检测，检测结果见表7。
[0126] 表7国标GB/T 25223-2010法检测大豆油脱臭馏出物样品中各组分的含量
[0128] 同时，精密称取约IOOmg混合留醇标样共4份，分别置于50ml烧瓶中，其中两份平行 样按照步骤1进行前处理、按照步骤2的方法(下称本发明方法)进行检测，另两份按照GB/T 25223-2010国标方法进行前处理并检测，考察两种检测方法的检测结果的准确性，考察结 果见表8。
[0129] 表8两种检测方法的检测准确性考察结果
[0131]由表8可见，本发明方法的检测数值更接近真实值，而国标GB/T25223-2010的检测 数值则偏低;参照表2和表7的检测数值，表7的检测数值同样比表2的检测数值偏低;这表明 本发明的检测方法比国标GB/T25223-2010的准确性更高。
【主权项】
1. 一种测定植物油脱臭馏出物中不同形式植物留醇含量的方法，其特征在于，包括以 下步骤： (1) 对所述植物油脱臭馏出物进行皂化处理，得皂化液； (2) 向所述皂化液中加入内标，并用有机溶剂进行萃取，收集有机萃取层，得待测液； (3) 配制同时含有内标和多种待测植物留醇的系列标准溶液，针对标准溶液中的每种 待测植物留醇，以该待测植物留醇与内标的峰面积比为横坐标，以该待测植物留醇与内标 的浓度比为纵坐标，绘制标准曲线； (4) 将所述待测液注入气相色谱仪进行分析，获得待测液中各待测植物留醇与内标的 峰面积比，并依据对应的标准曲线，计算得到植物油脱臭馏出物中各待测植物留醇的含量； 色谱条件为： 色谱柱:热稳定性高于280 °C的中等极性柱； 进样口温度:280~290 °C; 柱温：200 ~300 °C; 进样量：1μ1; 分流比：20:1~40:1; 柱流量：1 ·〇~1.5ml/min; FID检测器温度：290~300 °C ; H2：40ml/min； 空气:400ml/min。2. 如权利要求1所述测定植物油脱臭馏出物中不同形式植物留醇含量的方法，其特征 在于，步骤(1)中，所述皂化处理为:将所述植物油脱臭馏出物溶于碱溶液中，在煮沸回流条 件下反应1.5~2.5h，得到皂化液。3. 如权利要求2所述测定植物油脱臭馏出物中不同形式植物留醇含量的方法，其特征 在于，所述碱溶液为溶解有碱性物质的乙醇水溶液，碱性物质的质量分数为30~40%，所述 乙醇水溶液中乙醇与水的体积比为4:1。4. 如权利要求2或3所述测定植物油脱臭馏出物中不同形式植物留醇含量的方法，其特 征在于，所述植物油脱臭馏出物与碱溶液的质量体积比为1:20~1:10g/mL。5. 如权利要求1所述测定植物油脱臭馏出物中不同形式植物留醇含量的方法，其特征 在于，步骤(2)中，所述内标为胆固醇。6. 如权利要求1所述测定植物油脱臭馏出物中不同形式植物留醇含量的方法，其特征 在于，步骤(2)中，加入内标后，先将皂化液pH调至5~7,再用有机溶剂进行萃取，收集有机 萃取层。7. 如权利要求1或6所述测定植物油脱臭馏出物中不同形式植物留醇含量的方法，其特 征在于，步骤(2)中，所述有机溶剂为正己烷或乙醚。8. 如权利要求1或6所述测定植物油脱臭馏出物中不同形式植物留醇含量的方法，其特 征在于，将获得的有机萃取液水洗至中性，充分静置分层，取有机层即为待测液。9. 如权利要求1所述测定植物油脱臭馏出物中不同形式植物留醇含量的方法，其特征 在于，步骤(4)中，所述色谱柱为50%二苯基-50%二甲基聚硅氧烷柱、14%氰丙基-86%二 甲基聚硅氧烷柱或6 %氰丙基-94 %二甲基聚硅氧烷柱。10.如权利要求1或9所述测定植物油脱臭馏出物中不同形式植物留醇含量的方法，其 特征在于，步骤(4)中，色谱条件为： 色谱柱:50 %二苯基-50 %二甲基聚硅氧烷柱； 色谱柱规格:30m*0.25mm*0.25μπι; 进样口温度:290 °C; 柱温程序:200°C维持3min，再以80°C/min升温至290°C，保持20min; 进样量：1μ1; 分流比：30:1; 柱流量:1.2ml/min; FID检测器温度:300 °C; H2：40ml/min； 空气:400ml/min; 尾吹 N2:30ml/min。
【文档编号】G01N30/08GK105842372SQ201610402673
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年6月8日
【发明人】陈国旦, 杜小忍, 刘亚丽, 刘俊
【申请人】江西恒时生物科技有限公司