一种检测hiv抗体的免疫层析测试条及检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种检测HIV病毒的免疫层析测试条及其检测试剂盒，该免疫层析测试条及其检测试剂盒应用荧光免疫层析技术和双抗原夹心法检测人血清中的HIV?1和HIV?2抗体，特异性好，操作便捷，可以在加样后的15min内快速得到检测结果，适于临床和现场使用。
【专利说明】
一种检测HIV抗体的免疫层析测试条及检测试剂盒
[0001]技术领域本发明涉及疾病检测领域，具体涉及一种检测HIV抗体的免疫层析测试条及检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]
艾滋病，既获得性免疫缺陷综合症，是由人类免疫缺陷病毒感染所引起的一种具有严重传染性的免疫
缺陷性疾病。HIV在病毒分类中属逆转录病毒科慢病毒属的人类免疫缺陷病毒组。鉴于对HIV感染还没有安全有效的治疗方法，因而对HIV感染的诊断则是艾滋病预防控制工作显得尤其重要，诊断发现传染源才能更有效地控制艾滋病传播。
[0003]HIV抗体检测是AIDS检测中最常用的方法，目前根据血清学反应和病毒核酸序列测定，全球流行的HIV可分为2型:HIV-1型和HIV-2型，对应地HIV抗体产生的抗体主要有HIV-1和HIV-2两种抗体。传统HIV抗体检测方法有酶联免疫吸附实验(ELISA)以及免疫印记实验(WB)。临床常用ELISA法及免疫层析/渗滤法作为初筛实验，而免疫印记(WB)则是确认实验的唯一方法。酶联免疫吸附实验(ELISA)是国际上检测HIV抗体最早、使用最广泛的检测方法。但存在的缺点是操作复杂，检测时间较长，因而在临床或研究中尚未大规模使用。
[0004]WB是将HIV抗体蛋白用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，把分子量大小不等的蛋白带分离开来(这些蛋白分为HIV-1和HIV-2) AIV-1的抗原为核心蛋白pl7(或？18)、？24、？55，多聚酶?31(或？32)、？51、？66，外壳蛋白8?41、8?160、8?120等;!11￥-2的抗原蛋白为8口36、8口140、8口105、口53、口68、口56、口34、口26、口16等)，然后把这些分离开的蛋白带带电转移到硝酸纤维素膜上，与样本中的抗体反应，即会出现相应的膜带。WB是我国卫生部颁布的“艾滋病检测技术规范”中规定的唯一HIV抗体确认方法，其灵敏度和特异性都很高。不过这种方法技术要求高，影响因素多，操作复杂，价格昂贵，因此，WB仅用作权威部门作为确认实验而在临床上绝少使用。
[0005]为解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种检测HIV抗体的免疫层析测试条及其检测试剂盒，应用荧光免疫层析技术，采用双抗原夹心法检测人血清中的HIV-1和HI V-2抗体，同时，通过在试剂盒上设置高分子过滤膜，可以直接对全血样品进行分离检测，操作便捷，特异性好，可以在加样后的15min内快速得到检测结果。
【发明内容】
[0006]本发明的一个目的是提供一种检测HIV抗体的免疫层析测试条，包括底板和依次搭接并粘贴在底板上
的样品垫、结合垫、反应膜和吸水垫，所述反应膜上远离结合垫的一端设置有质控线，在质控线和结合垫之间还设置有检测线，所述的结合垫上包被有荧光胶乳标记的HIV1/2重组蛋白抗原和抗兔IgG多克隆抗体，所述的检测线上包被有HIV1/2重组蛋白抗原，所述质控线上包被有兔IgG。
[0007]所述的底板是PVC底板，厚0.2?0.4mm，长7.0cm，宽4mm。
[0008]所述的样品垫是玻璃纤维膜。所述样品垫上还涂布有样品垫处理液，所述的样品垫处理液包括0.5质量体积％卵清蛋白，0.01质量体积°/^￥6611-20，？!1值为7.0的0.0lM PBS和0.02质量体积%叠氮钠。
[0009]所述的结合垫是玻璃纤维膜。所述的结合垫上包被的荧光胶乳标记的HIV1/2重组蛋白抗原是gp41和
gp36，均从Meridian life science , Inc.米购，gp41 浓度为0.4?0.8mg/ml，gp36浓度为0.4?0.8mg/ml，所述的结合垫上包被的荧光胶乳标记的抗兔IgG多克隆抗体的浓度是0.2~0.4mg/ml。
[0010]所述的反应膜是硝酸纤维素膜。所述反应膜的检测线上包被的HIV1/2重组蛋白抗原的浓度为0.5-0.75mg/ml。所述反应膜的检测线上包被的HIV1/2重组蛋白抗原是GR-HIV109和p53 J^UMeridian life science，Inc.采购，其中GR-HIV109为P17、P24、gpl20和gp41的混合物。所述反应膜的质控线上包被的兔IgG浓度为0.5?1.0mg/ml。
[0011]所述的结合垫上包被的荧光胶乳标记的HIV1/2重组蛋白抗原和抗兔IgG多克隆抗体通过以下方法制备得到:
(1)标记洗涤液的制备:将20gBSA加入100mlpH值为7.0的0.0lMPBS溶液混合均匀；
(2)胶乳交联剂的制备:将50mg/mlEDC(碳二亚胺)溶解在pH为7.0的0.05MPBS溶液缓冲液；
(3)荧光胶乳的活化:按每10毫升荧光胶乳加入I毫升胶乳交联剂，室温反应I小时后，1000rpm?15000 rpm离心 15min，用0.05M PBS反复离心3次；
(4)gp41重组蛋白抗原荧光标记结合物配制:将活化的荧光胶乳恢复原始体积，加入gp41重组蛋白抗原，使得gp41重组蛋白抗原在荧光胶乳溶液中的浓度为0.4-0.8mg/ml，旋涡混合后，室温搅拌反应2?4h，离心30分钟，弃上清，沉淀用标记洗涤液洗涤两次，弃去上清。
[0012](5)gp36重组蛋白抗原荧光标记结合物配制:将活化的荧光胶乳恢复原始体积，加入gp36重组蛋白抗原，使得gp36重组蛋白抗原在焚光胶乳溶液中的浓度为0.4?0.8mg/ml，旋涡混合后，室温搅拌反应2?4h，离心30分钟，弃上清，沉淀用标记洗涤液洗涤两次，弃去上清。
[0013](6)抗兔IgG多克隆抗体荧光标记结合物配制:将活化的荧光胶乳恢复原始体积，加入抗兔IgG多克隆抗体，使得抗兔IgG多克隆抗体在荧光胶乳溶液中的浓度为0.2-0.4mg/ml，旋涡混合后，室温搅拌反应2?4h，离心30分钟，弃上清，沉淀用标记洗涤液洗涤两次，弃去上清O
[0014]所述反应膜上的检测线和质控线通过以下方法制备得到:
将0.49g Na2CO3.10H20、2.94g NaHC03、8.5g NaCl，加入纯化水至100ml制得缓冲液，分别加入一定量的GR-HIV109与p53，使缓冲液中GR-HIV109与p53的浓度均为0.5-0.75mg/ml，将所得溶液通过喷膜机喷到检测线上。
[0015]将0.49g Na2CO3 ,1H2O ^ 2.94g NaHCO3,8.5g NaCl，加入纯化水至 100ml 制得缓冲液，加入一定量的兔IgG，使得缓冲液中兔IgG浓度为0.5-1.0mg/ml，将所得溶液通过喷膜机喷到质控线上。
[0016]本发明的另一个目的是提供一种包含了上述检测HIV抗体的免疫层析测试条的检测试剂盒，其包括底座和上盖，所述底座上设置有定位槽，所述的免疫层析测试条置于定位槽内，所述上盖在对应于所述免疫层析测试条样品垫的位置设置有一个加样口，用于滴加全血样品，所述的加样口上设置有一个可滤除全血样品中的红细胞的高分子过滤膜，优选聚四氟乙烯多孔膜。所述上盖在对应于所述的检测线和质控线的位置设置有一个长方形的观测窗口，如果全血样品中含带有HIV抗体，在加样后15min左右，透过观测窗口可看到在检测线上显示一条红色条带，同时质控线上也显示一条红色条带，如果质控线上未显示红色条带，说明样品在硝酸纤维素反应膜上未能顺利层析，则抛弃检测结果。
[0017]全血样品在硝酸纤维素反应膜上层析的过程中，血液中的各组分扩散速度不一，当血清中的HIV抗体到达检测线，并使检测线显红色时，血浆中的血红蛋白还没有到达检测线，但加样后超过30分钟，本身带红色的血红蛋白也到达检测线，对非专业人士来说，将会对结果判定带来混淆，因而通过在加样口上设置一个高分子过滤膜，可以有效滤除红细胞，提高检测结果的准确性。所述的高分子过滤膜优选聚四氟乙烯多孔膜，所述的聚四氟乙烯多孔膜可以通过W095/02447或US8153041所记载的方法制备得到。
[0018]所述的加样口的一端，还包括一个可覆盖加样口的可插拔的盖子，检测前拔除盖子在加样口加入全血样品，加样完成后可以插上盖子，以免样品暴露，降低操作人员的感染风险。
【附图说明】
[0019]图1为本发明的检测HIV抗体的免疫层析测试条的结构示意图。
[0020]图2为本发明的检测HIV抗体的检测试剂盒的结构示意图。
[0021 ]附图标记说明:1.样品塾;2.结合塾;3.、检测线;4.反应I旲；5.质控线;6.吸水塾；
7.底板;8、底座;9、上盖;10、加样口； 11、过滤膜;12、观测窗口； 13、可插拔的盖子。
[0022]实施例1
一种检测HIV抗体的免疫层析测试条，由玻璃纤维样品垫I，玻璃纤维结合垫2，硝酸纤维素反应膜4和吸水纸6依次搭接并粘贴固定在PVC底板7上组成，所述PVC底板7裁切平整，厚0.2 1111]1，长7.0 cm，宽4mm，在所述硝酸纤维素反应膜4上临接结合垫2的一端的距离1.75cm处设置有检测线3，并在距离检测线3的0.65cm处设置有质控线5，所述结合垫2上涂覆有焚光胶乳标记的gp41和gp36重组蛋白抗原，浓度均为0.4mg/ml，所述结合垫还涂覆有荧光胶乳标记的抗兔IgG，浓度为0.2mg/ml，所述检测线3包被有GR-HIV109与p53，浓度均为
0.5 mg/ml，所述质控线5包被有抗兔IgG多克隆抗体，浓度0.5mg/ml。
[0023]实施例2
一种检测HIV抗体的免疫层析测试条，由玻璃纤维样品垫I，玻璃纤维结合垫2，硝酸纤维素反应膜4和吸水纸6依次搭接并粘贴固定在PVC底板7上组成，所述PVC底板7裁切平整，厚0.2 1111]1，长7.0 cm，宽4mm，在所述硝酸纤维素反应膜4上临接结合垫2的一端的距离1.75cm处设置有检测线3，并在距离检测线3的0.65cm处设置有质控线5，所述结合垫2上涂覆有焚光胶乳标记的gp41和gp36重组蛋白抗原，浓度均为0.8mg/ml，所述结合垫还涂覆有荧光胶乳标记的抗兔IgG，浓度为0.4mg/ml，所述检测线3包被有GR-HIV109与p53，浓度均为
0.75 mg/ml，所述质控线5包被有抗兔IgG多克隆抗体，浓度1.0mg/ml。
[0024] 实施例3
一种包含了实施例1或实施例2的检测HIV抗体的免疫层析测试条的检测试剂盒，其包括底座8和上盖9，所述底座(8)上设置有定位槽，所述的免疫层析测试条置于定位槽内，所述上盖9在对应于所述免疫层析测试条样品垫I的位置设置有一个加样口 10，所述的加样口10上设置有一个聚四氟乙烯多孔膜11，所述上盖9在对应于所述的检测线3和质控线5的位置设置有一个长方形的观测窗口 12，所述的加样口 10的一端，还包括一个可插拔的盖子13。
【主权项】
1.一种检测HIV抗体的免疫层析测试条，包括底板(7)和依次搭接并粘贴在底板(7)上的样品垫(1)、结合垫(2)、反应膜(4)和吸水垫(6)，所述反应膜(4)上远离结合垫(2)的一端设置有质控线(5)，在质控线(5)和结合垫(2)之间还设置有检测线(3)，所述的结合垫(2)上包被有荧光胶乳标记的HIV1/2重组蛋白抗原和抗兔IgG多克隆抗体，所述的检测线(3)上包被有HIV1/2重组蛋白抗原，所述质控线(5)上包被有兔IgG。2.如权利要求1所述的一种检测HIV病毒的免疫层析测试条，其特征在于，所述的结合垫(2)上包被的荧光胶乳标记的HIV1/2重组蛋白抗原是gp41和gp36。3.如权利要求2所述的一种检测HIV病毒的免疫层析测试条，其特征在于，所述的gp41浓度为0.4?0.8mg/ml，所述的gp36浓度为0.4?0.8mg/ml。4.如权利要求1所述的一种检测HIV病毒的免疫层析测试条，其特征在于，所述的结合垫(2)上包被的荧光胶乳标记的抗兔IgG多克隆抗体的浓度是0.2-0.4mg/ml。5.如权利要求1所述的一种检测HIV病毒的免疫层析测试条，其特征在于，所述的检测线(3)上包被的HIV1/2重组蛋白抗原的浓度为0.5-0.75mg/ml。6.如权利要求1所述的一种检测HIV病毒的免疫层析测试条，其特征在于，所述的检测线(3)上包被的HIV1/2重组蛋白抗原是P17、P24、gpl20、gp41的混合物和p53。7.如权利要求1所述的一种检测HIV病毒的免疫层析测试条，其特征在于，所述的质控线(5)上包被的兔IgG浓度为0.5?1.0mg/ml。8.—种包含了权利要求1所述的检测HIV抗体的免疫层析测试条的检测试剂盒，其包括底座(8)和上盖(9)，所述底座(8)上设置有定位槽，所述的免疫层析测试条置于定位槽内，所述上盖(9)在对应于所述免疫层析测试条样品垫(I)的位置设置有一个加样口(10)，所述的加样口(10)上设置有一个高分子过滤膜(11)，所述上盖(9)在对应于所述的检测线(3)和质控线(5)的位置设置有一个长方形的观测窗口( 12)。9.如权利要求8所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的高分子过滤膜(11)为聚四氟乙烯多孔膜。10.如权利要求8或权利要求9所述的检测试剂盒，其特征在于，在所述的加样口(10)的一端，还包括一个可插拔的盖子(13)。
【文档编号】G01N33/569GK105842462SQ201610311016
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年5月12日
【发明人】陈飞, 康可人, 王继华
【申请人】广州万孚生物技术股份有限公司