一种蜂蜜基质中氯霉素的快速筛查方法
【专利摘要】本发明公开了一种蜂蜜基质中氯霉素的快速筛查方法，包括：称取待测蜂蜜样品，加入去离子水，经加热水浴后涡旋至蜂蜜完全溶解；添加乙酸乙酯后震荡提取并离心操作，移取上层清液至离心管；重复用水反萃一次，得到样品上清液；将所述样品上清液水浴后，氮气吹干，用乙腈复溶，得到待测样品溶液；使用移液器定量滴加所述待测样品溶液在Dip?it管上；采用实时直接分析质谱离子源DART?MS/MS对所述待测样品溶液进行检测。本发明实施例的方案，能够实现快速准确的对蜂蜜基质中氯霉素的筛查检测。
【专利说明】
一种蜂蜜基质中氯霉素的快速筛查方法
技术领域
[0001] 本发明涉及食品中抗生素筛查技术领域，特别涉及一种蜂蜜基质中氯霉素的快速 筛查方法。
【背景技术】
[0002] 蜂业养殖过程中，蜜蜂经常患腐臭病、螺原体病等细菌性疾病，这些疾病会对养蜂 生产和蜂产品安全构成严重威胁。为了防治蜜蜂疾病，各种抗生素类药物被蜂农频繁使用， 甚至会在效果不佳时加大剂量，因此导致了蜂蜜中抗生素残留。2002年欧盟等国家禁运我 国蜂蜜事件后，欧盟理事会通过《关于对产自中国的进口动物产品实行某些保护性措施的 决议》（2002/69/EC)，将氯霉素残留限量改为0.1yg/kg。在2005年欧盟解禁中国蜂蜜后，但 从中国进口的动物源食品的保护措施2005/573/EC决议中指出，中国出口的蜂蜜必须附加 氯霉素和硝基呋喃及其代谢物等残留检验报告（2005/573/EC)。2009年12月欧盟委员会条 例(EU)No.37/2010中指出蜂蜜中氯霉素、硝基呋喃等为禁用药理活性物质，其他抗生素为 非法使用药物。
[0003] 蜂蜜中抗生素检测技术目前主要包括以下几种：
[0004] 微生物法，是用于测定抗生素效价的生物学定量方法之一。我国也建立了杯碟法 检测蜂蜜中红霉素和青霉素的国家标准。原理简单、操作便捷是微生物学测定法的最大优 势，但检测灵敏度过低是其最大缺陷。
[0005] 酶联免疫分析法(ELISA)，是一种让抗体与酶结合物结合，然后通过显色来检测的 方法。这种方法简单易行，具有特异性强、灵敏度高等优点，已经越来越多的应用于蜂蜜中 抗生素残留的检测，我国也有酶联免疫法检测蜂蜜中氯霉素和四环素的国家标准。但是，免 疫测定法提供的待测物组成或结构方面的信息太少，一般不具备多残留分析能力；分析过 程影响因素众多且不易控制，结果易出现假阳性，方法难以标准化;方法建立过程复杂，研 究周期长，某些待测物的半抗原难以合成。
[0006] 液相色谱法，可以将复杂组分分离后，逐一进行检测。液相色谱法具有高效、快速、 灵敏的特点，几乎可以测定包括高极性/离子型和大分子物质在内的所有化合物，但在处理 复杂样品时可能因预处理手段无法去除所有干扰，导致杂质无法与待测物分离，从而引起 假阳性检出。
[0007]色质联用一般是指液相色谱或气相色谱-质谱联用技术，在蜂蜜中抗生素残留检 测领域得到了广泛的应用。气相色谱-质谱检测法(GC-MS)以主要用于热稳定、易挥发的化 合物的检测，也有报道将其应用于检测蜂蜜中氯霉素。然而抗生素绝大部分是热不稳定、难 气化化合物，在使用GC-MS检测时一般需要将其进行衍生化处理，不同抗生素的官能团不 同，衍生化过程十分繁琐且易引入分析误差。液相色谱-质谱检测法(LC-MS)是目前对于蜂 蜜中抗生素残留检测最常用方法，但是对样品预处理的要求较高，样品预处理繁琐，分析时 间较长。
[0008]现有技术中，对于蜂蜜基质中抗生素的检测方法存在着各种问题，复杂不易操作， 以及检测结果不稳定等。亟需要一种快速简便有效的蜂蜜基质中抗生素残留的快速筛查方 法，以满足业界对于抗生素残留检测的需要。
【发明内容】
[0009] 本发明提供一种蜂蜜基质中氯霉素的快速筛查方法，用以解决现有技术中蜂蜜基 质中抗生素残留无法快速有效检测筛查的问题。
[0010] 本发明提供一种蜂蜜基质中氯霉素的快速筛查方法，包括：
[0011] 称取5g蜂蜜样品于50mL-次性离心管，加入5mL去离子水，经60°C水浴后涡旋至蜂 蜜完全溶解；
[0012] 添加15mL乙酸乙酯后振荡提取lOmin，以3000rpm的速率离心5min，移取上层清液 至15mL离心管；
[00?3] 在上清液中加入5mL去离子水，振荡lOmin，3000rpm离心5min，取上清液；
[0014]重复用水反萃一次，取上清液10mL;
[0015] 45 °C水浴，氮气吹干上清液后用2mL乙腈复溶。
[0016] 使用移液器定量滴加5μΙ^?述待测样品溶液在Dip-it管上(DIP-5yL)。
[0017]设置实时直接分析质谱离子源DART-MS/MS参数:负离子采集，多反应监测(MRM)模 式，载气为氦气，载气温度550°C，样品传输速度0.6mm/s。
[0018] 本发明实施例的方案与目前文献和国标方法比，其特点在于：
[0019] 本方法采取乙酸乙酯有机溶剂简单提取后，用水反萃有效去除蜂蜜基体中大量的 单糖类干扰物，显著降低了质谱检测的基质效应，提高了方法的灵敏度;使用移液器定量滴 加所述待测样品溶液在Dip-it管上，改善了 Dip-it进样方式的精密度，使得检测方法可以 作为定量方法使用；与传统的LC/MS/MS测试方法相比，样品的测试效率从每24个样品48h提 尚到每24个样品不足4h。
[0020] 本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变 得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在所写的说明 书、权利要求书、以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。
[0021] 下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
【附图说明】
[0022]附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实 施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
[0023]图1为Dip-it与Mesh两种进样模块下氯霉素提取离子流图；
[0024]图2为简单提取与用水反萃三种蜂蜜中氯霉素 (0.2yg/kg)提取离子图。
【具体实施方式】
[0025] 以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实 施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
[0026] 实时直接分析(Direct Analysis in Real Time)简称DART，是一种热解析和离子 化技术。DART操作简单，样品置放于DART源和质谱仪的离子采样口直接，便可进行分析。
[0027] 本实施例所采用的仪器：
[0028] DART实时直接分析离子源，Qtrap 5500质谱；LC-30AD XR液相色谱、ME614S天平； CF16RX| |离心机;Vortex-Genie 2型涡旋混合器、MCX固相萃取柱
[0029]样品预处理方法：
[0030] 称取5g蜂蜜样品于50mL-次性离心管，加入5mL去离子水，经60°C水浴后涡旋至蜂 蜜完全溶解。添加15mL乙酸乙酯后振荡提取lOmin，以3000rpm的速率离心5min，移取上层清 液至15mL离心管。在上清液中加入5mL去离子水，振荡lOmin，3000rpm离心5min，取上清液。 重复用水反萃一次，取上清液1〇111匕45°(：水浴，氮气吹干上清液后用2mL乙腈复溶，供DART-MS/MS检测。
[0031] DART-MS/MS 检测方法：
[0032]离子源参数:负离子采集，多反应监测(MRM)模式，载气氦气，载气温度550°C，样品 传输速度〇. 6mm/s。质谱采集参数见表1。
[0033]表 1
[0035] DART-MS-MS进样方式优化：
[0036] 为了考虑进样方式对实验结果的影响，对样品的进样方式进行的验证和重新设 计。DART进样方式种类较多，较为常见的有Dip-it和Mesh筛网两种模块。Mesh模块因重现性 较好而被用于定量分析，且Mesh模块进样量比Dip-it模块大，理论上检测灵敏度应该比 Dip-it模块高。但实际上，Mesh模块其样品分布面积大，单次上样时其灵敏度是低的，通过 多次点样以增加进样量，理论上是可以弥补不足，但是在实际样品的检测中，多次点样后引 入的内源性基质干扰更多，有时会导致灵敏度降低。实验将Dip-it模块蘸取的进样方式改 为使用移液器定量滴加5yL样品溶液在Dip-it管上(DIP-5yL)，与Mesh模块作比较，在两种 模块下分别对〇. 5、2.5、5、10yg/kg 4个浓度水平的氯霉素进行检测，结果见图1，为Dip-it 与Mesh两种进样模块下氯霉素提取离子流图。可以看出相同浓度水平时，氯霉素响应的信 噪比在Dip-it模块下明显高于Mesh模块，将样品溶液定量滴加到Dip-it管上的操作可以确 实有效的提取DART检测的灵敏度。
[0037]为对比Dip-it与Mesh模块的重现性差异，考察经改进点样方式后的Dip-it模块是 否可以用于定量检测，实验选用2.5yg/kg的氯霉素标准溶液分别在三种模块下重复进样10 次，结果见表2。可以看出，常规Dip-it蘸取进样方式下峰面积相对标准偏差为77.13%，远 大于另外两种进样方式;经定量滴加样品溶液到Dip-it管后的Dip-it进样模块重复进样10 针，峰面积的相对标准偏差为24.63% ;Mesh模块重复进样10针，峰面积的相对标准偏差为 21.06%，二者相差3.6%。可见经改进后的Dip-it模块与Mesh模块的检测重现性差异不大。 原因可能是Dip-it常规蘸取模式下实际附着在Dip-it管表面的样品溶液体积差异很大，经 移液器简单控制后，进样体积差异有较大改善，与Mesh模块相当。
[0038]表2
[0041] 样品预处理方法优化：
[0042] 蜂蜜主要成分是糖类，基质极为复杂，一般来说成熟蜂蜜含糖总量高达75%，主要 为果糖和葡萄糖。提取溶液中大量的糖，质谱检测时会引起严重的基质效应。本方法利用葡 萄糖与果糖易溶于水，而不溶于提取溶剂乙酸乙酯的特性，对乙酸乙酯提取液用水反萃两 次，有效去除了提取溶液中大量单糖干扰，提高了方法灵敏度。结果见附图2,由图可知三种 不同种类的蜂蜜在用水反萃处理后的响应明显比简单提取处理后的高。可见用水反萃能够 有效提高检测信噪比，提升蜂蜜中氯霉素检测的灵敏度。且与标准溶液(m，a 2)相比，蜂蜜样 品中的氯霉素响应虽然稍低，但差异不大，说明该处理方法能够有效减小基质效应。
[0043] DART-MS/MS 与LC-MS/MS 分析方法比较：
[0044]实验从定量结果、样品预处理时间、分析时间、检出限等方面综合比较了DART-MS/ MS与LC-MS/MS两种分析方法在分析蜂蜜中氯霉素的优劣，结果见表3。考虑到DART的定量能 力和筛查方便易操作的原则，实验使用外标法定量对比了 DART-MS/MS与LC-MS/MS定量结果 的差异。在野桂花与槐花蜂蜜中分别添加〇. 5ng/g浓度水平的氯霉素，扣除本底值后分别使 用DART-MS/MS与LC-MS/MS对其定量，结果见表3。总体来说，两种检测方法在使用外标法定 量时存在一定差异，但综合考虑DART检测重现性，认为DART-MS/MS与LC-MS/MS定量结果准 确性在可接受范围内。样品预处理和分析时间则是DART-MS/MS明显优于LC-MS/MS。而检出 限则是LC-MS/MS 优于 DART-MS/MS。
[0045]表 3
[0047]本实施例中，称取待测蜂蜜样品，加入去离子水，经加热水浴后涡旋至蜂蜜完全溶 解;添加乙酸乙酯后震荡提取并离心操作，移取上层清液至离心管;重复用水反萃一次，得 到样品上清液;将所述样品上清液水浴后，氮气吹干，用乙腈复溶，得到待测样品溶液;使用 移液器定量滴加所述待测样品溶液在Dip-it管上;采用实时直接分析质谱离子源DART-MS/ MS对所述待测样品溶液进行检测。并将待测样品的检测结果采用液相色谱-质谱联用仪LC-MS/MS进行验证。图2为简单提取与用水反萃三种蜂蜜中氯霉素 (0.2yg/kg)提取离子图，其 中，a. 0.2yg/kg标准溶液，b.枣花蜂蜜，c.槐花蜂蜜，d.野桂花蜂蜜。
[0048]本发明实施例的方案，改进了DART-MS分析中采用Dip-it管直接蘸取的传统进样 方式，改为移液器定量滴加的取样方式，有效提高Dip-it进样方式的精密度，保障了DART-MS/MS分析方法的灵敏度;优化了提取方式和净化方法，使筛查的灵敏度提高100倍。与传统 LC-MS-MS定量方法相比，本方法的测试效率从每20个样品大于24h提高到每20个样品不足 4h〇
[0049]显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精 神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围 之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
【主权项】
1. 一种蜂蜜基质中氯霉素的快速筛查方法，其特征在于，包括： 称取待测蜂蜜样品，加入去离子水，经加热水浴后涡旋至蜂蜜完全溶解； 添加乙酸乙酯后震荡提取并离心操作，移取上层清液至离心管； 重复用水反萃一次，得到样品上清液； 水浴氮气吹干样品，残渣用乙腈复溶，得到待测样品溶液； 定量滴加所述待测样品溶液在D i p- i t管上； 采用实时直接分析质谱离子源DART-MS/MS对所述待测样品溶液进行检测。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括： 所述加热水浴为60 °C水浴。3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括： 所述用水反萃为:在上清液中加入5mL去离子水，振荡lOmin，3000rpm离心5min，取上清 液。4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中前处理过程具体包括： 称取5g蜂蜜样品于50mL-次性离心管，加入5mL去离子水，经60°C水浴后涡旋至蜂蜜完 全溶解;添加15mL乙酸乙酯后振荡提取lOmin，以3000rpm的速率离心5min，移取上层清液至 15mL离心管;在上清液中加入5mL去离子水，振荡lOmin，3000rpm离心5min，取上清液;重复 用水反萃一次，取上清液1 OmL; 45 °C水浴，氮气吹干上清液后用2mL乙腈复溶。5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法还包括： 移液器定量滴加5yL所述待测样品溶液在Dip-it管上。6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括： 设置实时直接分析质谱离子源DART-MS/MS参数：负离子采集，多反应监测(MRM)模式， 载气为氦气，载气温度550°C，样品传输速度0.6mm/s。
【文档编号】G01N27/62GK105865885SQ201610210048
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月6日
【发明人】李秀琴, 张庆合, 许森, 李红梅
【申请人】中国计量科学研究院