一种负载荧光微球的光学材料及其制备方法
【专利摘要】本发明公开的一种负载荧光微球的光学材料的制备方法。它包括如下步骤：(1)依次用磷酸盐缓冲液、氢氧化钠水溶液和磷酸盐缓冲液冲洗生物芯片；(2)将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺的2-(N-吗啉)乙烷磺酸溶液与羧基化的荧光微球混合得到混合液；(3)将所述混合液冲洗经步骤(1)处理后的所述生物芯片，经键合即得所述光学材料。本发明具有以下优点：羧基化的荧光微球键合在生物芯片表面的间距适合、平整均匀，可以用以检验自动对焦系统、激光和滤片；发出荧光时间长达半个小时，足够操作人员进行调试光学系统，有助于校正光学成像系统的成像质量；其大小、形状及键合方式与实际测序时所用的物质十分相似，对于调试的参考意义显著。
【专利说明】
一种负载荧光微球的光学材料及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于测序仪的光学测试材料领域，具体涉及一种负载荧光微球的光学材料 及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 在调试光学系统过程中，通常会用到测试芯片来调整焦平面，测试激光。在现有 技术中，硅基芯片上涂荧光的方法，检索到LED芯片上以点胶的方法将荧光粉和胶混合， 点在娃基芯片表面（一种基于C0B技术的LED点焚光胶方法，【公开日】2011. 08. 10,公开号 CN102148299A)。如果采取相同的方法，将荧光微球和胶混合点在的硅片表面，无法保证荧 光在同一平面以及其均匀性。
[0003] 焚光微球（FluoSpheres? Fluorescent Microspheres)因其可选体积丰富、表面 非特异性修饰和特异性基团修饰、荧光持续时间长、无毒害性等特点，被应用于细胞表面抗 原杂交、神经细胞示踪、血液流速检测等领域。FluoSpheres多被应用于生物医学领域，将其 应用到生物芯片的荧光测试上尚未有相关文献提及。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种负载荧光微球的光学材料及其制备方法，本发明提供的 光学材料中，羧基化的荧光微球键合在生物芯片表面的间距适合、平整均匀，且荧光持续时 间长，能有助于校正光学成像系统的成像质量。
[0005] 本发明提供的负载荧光微球的光学材料的制备方法，包括如下步骤：
[0006] (1)依次用磷酸盐缓冲液、氢氧化钠水溶液和磷酸盐缓冲液冲洗生物芯片；
[0007] (2)将1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺的2-(N-吗啉）乙烷磺酸溶液与羧 基化的荧光微球混合得到混合液；
[0008] (3)用所述混合液冲洗经步骤（1)处理后的所述生物芯片，经键合即得所述光学 材料。
[0009] 上述的制备方法，所述生物芯片为硅基芯片或玻璃芯片；
[0010] 本发明中，所述硅基芯片指的是本领域常用的硅片，所述玻璃芯片指的是本领域 常用的玻璃片。
[0011] 上述的制备方法，所述磷酸盐缓冲液的摩尔浓度可为30~60禮，具体可为50mM ;
[0012] 所述氢氧化钠水溶液的摩尔浓度可为40~50mM，具体可为50mM。
[0013] 本发明中，用所述磷酸盐缓冲液冲洗所述生物芯片，使所述生物芯片水解露出六 甲基二硅氮烷，用氢氧化钠水溶液冲洗所述生物芯片并孵育20min，使六甲基二硅氮烷中单 分子层消失，露出硅表面，硅表面被氧化带正电，使所述生物芯片带正电荷，从而能与所述 荧光微球键合。
[0014] 上述的制备方法，所述1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺的2-(N-吗啉）乙 烷磺酸溶液的质量体积浓度可为2~5mg/mL，具体可为3mg/mL ;
[0015] 本发明方法中，将1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺的2-(N-吗啉）乙烷磺 酸溶液与羧基化的荧光微球可依次采用震荡5s和离心5s的方式使其混合均匀。
[0016] 上述的制备方法，所述1-(3-二甲氨基丙基）-3_乙基碳二亚胺的2-(N-吗啉）乙 烷磺酸溶液与所述羧基化的荧光微球的体积比可为8~13 :1，具体可为10 :1。
[0017] 上述的制备方法，所述键合的温度可为17~30°C，具体可为21 °C，时间可为30~ 120min，具体可为 30min ;
[0018] 所述键合指的是所述生物芯片中的带正电荷的氨基与所述羧基化的荧光微球中 的羧基反应，形成稳定的酰胺键。
[0019] 上述的制备方法，所述羧基化的荧光微球的直径可为0.2~Ιμπι，具体可为 0· 2 μ m〇
[0020] 本发明负载焚光微球的光学材料应用于光学系统调试中。
[0021] 本大明负载焚光微球的光学材料应用，所述光学系统调试具体可为光学显微镜调 试或滤片均匀度检测。
[0022] 本发明方法制备的负载荧光微球的光学材料，羧基化的荧光微球良好地附着在硅 片表面，间距适宜，平整均勾，因此可以用于检验自动对焦系统、激光和滤片；并且荧光微球 在硅片表面的修饰图案上形成网格图案，有助于校正光学成像系统的成像质量。另外，选择 具有不同波长的荧光微球可以用来检测不同波段的滤片。
[0023] 本发明具有以下优点：
[0024] (1)羧基化的荧光微球键合在生物芯片表面的间距适合、平整均匀，可用以检验自 动对焦系统、激光和滤片。
[0025] (2)羧基化的荧光微球在生物芯片表面的修饰图案上形成网格图案，发出荧光时 间长达半个小时，足够操作人员进行调试光学系统，有助于校正光学成像系统的成像质量。
[0026] (3)本发明负载荧光微球的光学材料大小、形状及键合方式与实际测序时所用的 物质十分相似，对于调试的参考意义显著。
【附图说明】
[0027] 图1为本发明实施例中羧基化的荧光微球键合在硅片的氨基上的反应机理示意 图。
[0028] 图2为本发明实施例1中负载荧光微球的光学材料的光学显微镜图。
[0029] 图3为对比例中负载荧光微球的光学材料在光学系统调试时的光学显微镜图。
[0030] 图4为本发明实施例1中负载焚光微球的光学材料在光学系统调试时的光学显微 镜图。
【具体实施方式】
[0031 ] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0032] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0033] 下述实施例中，使用的羧基化的荧光微球：购于Life公司的商品目录号为 F-8809 ;购于spherotech公司的商品目录号CFP-0570-2。
[0034] 实施例1、负载焚光微球的光学材料的制备
[0035] (1)依次用50mM磷酸盐缓冲液50 μ L和50mM氢氧化钠水溶液50 μ L冲洗硅基芯 片，用氢氧化钠水溶液冲洗的同时孵育20min，然后用50mM磷酸盐缓冲液50 μ L冲洗硅基芯 片，使硅基芯片的表面有带正电的氨基；
[0036] ⑵将体积比为10:1的3mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基）_3_乙基碳二亚胺的 2-(N-吗啉）乙烷磺酸溶液与羧基化的荧光微球（F-8809,波长为530nm、直径为0. 2μπι)依 次采用震荡5s和离心5s的方式混合均匀，得到混合液；
[0037] (3)将混合液冲洗经步骤⑴处理后的硅基芯片，在21°C条件下，经30min键合， 用50mM磷酸盐缓冲液冲洗3次，即得负载荧光微球的光学材料。
[0038] 上述过程的反应流程如图1所示，图1中标记如下：1羧酸，20-酰基异脲，3酰胺， 4脲，5酸酐，6N-酰基脲。上述过程的反应机理如下：羧酸1与中碳二亚胺反应，生成中间 体0-酰基异脲2。然后0-酰基异脲2与胺反应生成酰胺3和脲4。0-酰基异脲2可以与 另一分子羧酸1反应生成酸酐5,酸酐5与另一分子胺反应也生成酰胺3。反应副产物主要 是0-酰基异脲2重排生成的N-酰基脲6。
[0039] 本发明反应机理具体如下：羧基化的荧光微球中羧基与1-(3-二甲氨基丙 基）-3-乙基碳二亚胺的2- (N-吗啉）乙烷磺酸溶液中碳二亚胺基反应，生成中间体含0-酰 基异脲的化合物。含〇-酰基异脲的化合物与硅基芯片表面的氨基反应生成酰胺化合物（即 将羧基化的荧光微球负载到硅基芯片上）和脲化合物。〇-酰基异脲的化合物与羧基化的荧 光微球中羧基反应生成酸酐化合物，酸酐化合物与另一硅基芯片表面的氨基反应也生成酰 胺化合物（即将羧基化的荧光微球负载到硅基芯片上）。含〇-酰基异脲的化合物重排生成 副产物N-酰基脲，磷酸盐缓冲液冲键合的洗硅基芯片，能将副产物N-酰基脲冲离，得到负 载荧光微球的光学材料。
[0040] 如图2所示，为本发明负载荧光微球的光学材料的光学显微镜图，在40倍镜下，经 绿色激发光50ms曝光，得到负载荧光微球的光学材料的光学显微镜图。
[0041] 由图2可知，负载焚光微球的光学材料在光学显微镜下可见明亮的点，即为在娃 基芯片表面上键合的荧光微球在对应波长530nm激发下发出的荧光，从而证明荧光微球键 合在硅片表面的间距适合、平整均匀。
[0042] 本发明负载荧光微球的光学材料在光学系统调试中应用的测试效果试验：
[0043] 将本发明负载荧光微球的光学材料安放在光学显微镜的平台上，通过光学显微镜 视野中的格子，确认负载荧光微球的硅基芯片在XY方向的没有旋转偏离；平移负载荧光微 球的光学材料所在的平台，负载荧光微球的光学材料一侧清晰、另一侧模糊，证明平台或负 载荧光微球的光学材料有倾斜，对焦的焦面不在同一焦面；拍摄照片出现黑色斑点，证明光 纤不均匀，光纤传导不佳。Z轴方向调平：如图3所示，从左上角到右下角这条带对准焦的 情况下，右上角和左下角均失焦，证明负载荧光微球的光学材料和平台是倾斜的。如图4所 示，同样为左上角到右下角对好焦的情况下，左下角和右上角均失焦，与图3不同的是可以 看到方格是因为图4荧光微球的体积较小，可以通过它的排布看到硅片表面的结构，而图3 微球体积大，所以看不到硅片表面结构。
[0044] 实施例2、负载荧光微球的光学材料的制备
[0045] 制备方法与实施例1中方法相同，不同的是将硅基芯片替换为玻璃芯片（普通的 玻璃片）。
[0046] 本实施例中负载焚光微球的光学材料在40倍光学显微镜下，经绿色激发光50ms 曝光，负载荧光微球的光学材料在光学显微镜下可见明亮的点，即为在玻璃芯片表面上键 合的焚光微球在对应波长530nm激发下发出的焚光，从而证明焚光微球键合在玻璃芯片表 面的间距适合、平整均匀。
[0047] 对比例1、
[0048] 制备方法与实施例1相同，不同的是将步骤（2)中的羧基化的荧光微球替换为羧 基化的荧光微球（CFP-0570-2,天蓝色、直径为0. 4~0. 6 μ m) ; 1- (3-二甲氨基丙基）-3-乙 基碳二亚胺的2-(N-吗啉）乙烷磺酸溶液与羧基化的荧光微球的体积比为8 :1。在光学系 统调试中的应用调试结果，如图3所示。
【主权项】
1. 一种负载焚光微球的光学材料的制备方法，包括如下步骤： (1) 依次用磷酸盐缓冲液、氢氧化钠水溶液和磷酸盐缓冲液冲洗生物芯片； (2) 将1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺的2-(N-吗啉）乙烷磺酸溶液与羧基化 的荧光微球混合得到混合液； (3) 用所述混合液冲洗经步骤（1)处理后的所述生物芯片，经键合即得所述光学材料。2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述生物芯片为硅基芯片或玻璃芯 片。3. 根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：所述磷酸盐缓冲液的摩尔浓度 为 30 ~60mM ; 所述氢氧化钠水溶液的摩尔浓度为40~50mM。4. 根据权利要求1-3中任一项所述的制备方法，其特征在于：所述1-(3-二甲氨基丙 基）-3-乙基碳二亚胺的2-(N-吗啉）乙烷磺酸溶液的质量体积浓度为2~5mg/mL。5. 根据权利要求1-4中任一项所述的制备方法，其特征在于：所述1-(3-二甲氨基丙 基）-3-乙基碳二亚胺的2-(N-吗啉）乙烷磺酸溶液与所述羧基化的荧光微球的体积比为 8 ~13 :1〇6. 根据权利要求1-5中任一项所述的制备方法，其特征在于：所述键合的温度为17~ 30°C，时间为 30 ~120min。7. 根据权利要求1-6中任一项所述的制备方法，其特征在于：所述羧基化的荧光微球 的直径为〇. 2~1 μ m。8. 权利要求1-7中任一项所述方法制备的负载荧光微球的光学材料。9. 权利要求8所述的负载荧光微球的光学材料在光学系统调试中的应用。10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述光学系统调试为光学显微镜调试或 滤片均匀度检测。
【文档编号】G01N21/64GK105866076SQ201510032449
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2015年1月22日
【发明人】冯赫天, 张永卫, 倪鸣, 代冲冲
【申请人】深圳华大基因研究院, 深圳华大基因科技有限公司