过氧亚硝酸根离子检测探针、其制备方法及应用
【专利摘要】本发明公开了一种过氧亚硝酸根离子检测探针、其制备方法及应用。该检测探针包括：荧光纳米材料，以及与之结合的具有氧化还原性的酶；所述的酶能够被过氧亚硝酸根离子选择性氧化形成氧化态的酶，且当所述荧光纳米材料在被激发光辐射后，处于激发态的电子会被转移至所述氧化态的酶而不能回到基态，导致所述荧光纳米材料的荧光淬灭。本发明提供的过氧亚硝酸根离子检测探针采用无机发光材料作为荧光团，其发光强，稳定性好，不易光漂白，且在其表面修饰具有氧化还原性的酶后，能够被ONOO?选择性氧化，同时不会受到其他活性氧(ROS)或活性氮(RNS)的干扰，具有优良的特异性。
【专利说明】
过氧亚硝酸根离子检测探针、其制备方法及应用
技术领域
[0001]本发明具体涉及一种过氧亚硝酸根离子(0N00—)检测探针、其制备方法及应用，例如在检测生物体系中过氧亚硝酸根离子选择性测定中的用途。
【背景技术】
[0002]过氧亚硝酸根离子(0N00—)在体内是由一氧化氮和超氧阴离子反应生成的一种强氧化性物质。它可能是一氧化氮产生病理损伤作用的重要环节。目前，已发现在休克、缺血一再灌注损伤、动脉粥样硬化、早老性痴呆症等疾病中都有0N00—的存在。因此，开发出针对0N00—的高灵敏，高选择性荧光探针用于0N00—的检测分析与成像对生理学研究将具有重要意义。
[0003]目前，绝大多数检测0N00—的荧光探针都是基于有机染料而设计，通过在有机荧光团上共价偶联上0N00—的识别官能团，实现选择性检测0N00—的目的，然而，有机荧光探针具有一定局限性，例如合成困难，易光漂白。随着材料学的发展，各种无机荧光纳米晶被陆续合成出来，如半导体量子点、上转换发光材料、贵金属团簇、硅量子点、荧光碳点等，该类发光材料具有发光性能优异，合成简单，物化性质稳定等优点，可以用于设计各种荧光探针。但是，构建基于无机荧光纳米晶的0N00—探针的报道还很少见。
【发明内容】
[0004]本发明的主要目的在于提供一种过氧亚硝酸根离子检测探针、其制备方法及应用，以克服现有技术中的不足。
[0005]为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括:
[0006]本发明实施例中提供了一种过氧亚硝酸根离子检测探针，其包括:荧光纳米材料，以及与所述荧光纳米材料结合的、具有氧化还原性的酶;所述的酶能够被过氧亚硝酸根离子选择性氧化形成氧化态的酶，且当所述荧光纳米材料在被激发光辐射后，处于激发态的电子会被转移至所述氧化态的酶而不能回到基态，导致所述荧光纳米材料的荧光淬灭。
[0007]本发明实施例中还提供了一种过氧亚硝酸根离子检测探针的制备方法，包括:
[0008]以偶联试剂与所述荧光纳米材料反应，使所述荧光纳米材料表面形成第一活性基团，
[0009]使所述的酶中的第二活性基团与分布于所述荧光纳米材料表面的第一活性基团反应，从而使所述的酶与所述无机荧光材料表面通过化学键结合，形成所述过氧亚硝酸根离子检测探针。
[0010]进一步的，所述第一活性基团包括羧基，所述第二活性基团包括氨基，但均不限于此。
[0011 ]本发明实施例中还提供了一种试剂盒，包括:
[0012]所述的过氧亚硝酸根离子检测探针，
[0013]以及，辅助试剂，至少用于形成适于使过氧亚硝酸根离子选择性氧化所述具有氧化还原性的酶而形成氧化态的酶的液相环境。
[0014]本发明实施例中还提供了一种过氧亚硝酸根离子的检测方法，包括:
[0015]将可能含有过氧亚硝酸根离子的样品与上述的过氧亚硝酸根离子检测探针在选定液相体系中充分混合，通过观测其中荧光纳米材料的荧光猝灭程度，实现对所述样品中所含过氧亚硝酸根离子的检测；
[0016]其中，所述选定液相体系为适于使过氧亚硝酸根离子选择性氧化所述具有氧化还原性的酶而形成氧化态的酶的液相体系。
[0017]进一步的，当所述选定液相环境中过氧亚硝酸根离子的初始浓度为3*10—6?5*10—4mol/L时，所述荧光纳米材料的荧光猝灭程度与过氧亚硝酸根离子的浓度成线性关系。
[0018]与现有技术相比，本发明的优点包括:
[0019]I)提供的过氧亚硝酸根离子检测探针采用无机发光材料作为荧光团，其发光强，稳定性好，不易光漂白，在其表面修饰上辅酶后，能够被0N00—选择性氧化，且不会被其他活性氧(ROS)或活性氮(RNS)干扰，具有优异的特异性，可以用于0N00—的均相、高灵敏与高选择性的检测。
[0020]2)提供的过氧亚硝酸根离子检测探针制备方法简单，原料来源广泛，利于规模化生产。
[0021]3)提供的过氧亚硝酸根离子检测方法操作简便，无需复杂设备，检测范围宽，检测限可达亚微摩尔级，灵敏度高，准确性好。
【附图说明】
[0022]为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0023]图1是本发明一典型实施例中以辅酶(NADH)修饰荧光碳点(CDs)而构建形成0N00—荧光纳米检测探针(如下简称纳米探针)的原理图；
[0024]图2是本发明一典型实施例中荧光碳点与辅酶(NADH)偶联前后的红外吸收光谱图；
[0025]图3是本发明一典型实施例中纳米探针对不同浓度0N00—的荧光淬灭光谱图；
[0026]图4是本发明一典型实施例中纳米探针对0N00—的特异性选择测试图。
【具体实施方式】
[0027]为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。这些优选实施方式的示例在附图中进行了例示。附图中所示和根据附图描述的本发明的实施方式仅仅是示例性的，并且本发明并不限于这些实施方式。
[0028]在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明，在附图中仅仅示出了与根据本发明的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了与本发明关系不大的其他细节。
[0029]本发明实施例的一个方面提供的一种过氧亚硝酸根离子检测探针(亦称0N00一荧光纳米检测探针，如下简称“探针”)包括:荧光纳米材料，以及与所述荧光纳米材料结合的、具有氧化还原性的酶;所述的酶能够被过氧亚硝酸根离子选择性氧化形成氧化态的酶，且当所述荧光纳米材料在被激发光辐射后，处于激发态的电子会被转移至所述氧化态的酶而不能回到基态，导致所述荧光纳米材料的荧光淬灭。
[0030]进一步的，所述荧光纳米材料可优选自荧光碳量子点、石墨烯量子点、半导体量子点、上转换发光材料、贵金属团簇、焚光娃纳米粒子和聚合物焚光纳米颗粒等无机和/或有机发光材料中的任意一种，但不限于此。
[0031]进一步的，所述的酶可优选自还原型辅酶I(NADH)、细胞色素C、烟酰胺、硫胺素、核黄素、血红素、歧化酶、吡哆醛及其衍生物、辅酶Q等具有氧化还原性的酶中的任意一种或两种以上的组合，但不限于此。尤其优选的，所述的酶选自辅酶。
[0032]进一步的，所述辅酶通过化学键与所述荧光纳米材料表面结合。
[0033]更进一步的，所述荧光纳米材料表面分布有羧基，其抗氧化性能更优异。
[0034]本发明通过将辅酶等具有氧化还原性的酶结合(特别是共价修饰)到荧光纳米材料表面而构建形成了一种电子转移型纳米探针，在0N00—存在下，所述探针中的酶被选择性氧化至其氧化态，氧化态的酶是优异的电子受体，当荧光纳米材料在被激发光辐射后，处于激发态的电子转移至氧化态的酶，从而不能回到基态，导致荧光淬灭，其荧光淬灭与0N00—的浓度在一定范围(例如3*10—6?5*10—4mol/L)内成线性关系，如此可以达到定量检测0N00—的目的，且灵敏度可达到亚微摩尔水平。特别是，当在0N00—与常见活性氧、活性氮物质共存的情况下，藉由本发明的探针仍能特异性的检测0N00—，而基本不会受到常见活性氧、活性氮物质等的明显干扰。
[0035]本发明实施例中还提供了一种过氧亚硝酸根离子检测探针的制备方法，包括:
[0036]以偶联试剂与所述荧光纳米材料反应，使所述荧光纳米材料表面形成第一活性基团，
[0037]使所述辅酶中的第二活性基团与分布于所述荧光纳米材料表面的第一活性基团反应，从而使所述辅酶与所述无机荧光材料表面通过化学键结合，形成所述过氧亚硝酸根离子检测探针。
[0038]进一步的，所述第一活性基团包括羧基，所述第二活性基团包括氨基。
[0039]其中，所述荧光纳米材料的用量可以为O?20重量份(优选为大于5而小于或等于20重量份)，所述酶的用量可以为5?100重量份(优选为大于O而小于或等于100重量份)，所述偶联试剂的用量可以为O?100重量份(优选为大于5而小于或等于100重量份)。
[0040]本发明实施例中还提供了一种试剂盒，包括:
[0041 ]上述的过氧亚硝酸根离子检测探针，
[0042]以及，辅助试剂，至少用于形成适于使过氧亚硝酸根离子选择性氧化所述辅酶而形成氧化态辅酶的液相环境。
[0043]本发明实施例中还提供了一种过氧亚硝酸根离子的检测方法，包括:
[0044]将可能含有过氧亚硝酸根离子的样品与上述的过氧亚硝酸根离子检测探针在选定液相体系中充分混合，通过观测其中荧光纳米材料的荧光猝灭程度，实现对所述样品中所含过氧亚硝酸根离子的检测；
[0045]其中，所述选定液相体系为适于使过氧亚硝酸根离子选择性氧化所述辅酶而形成氧化态辅酶的液相体系。
[0046]进一步的，当所述选定液相环境中过氧亚硝酸根离子的初始浓度为3*10—6?5*10—4mol/L时，所述荧光纳米材料的荧光猝灭程度与过氧亚硝酸根离子的浓度成线性关系。
[0047]以下结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步的解释说明。
[0048]在如下的实施例中，以荧光碳量子点(简称荧光碳点或碳点，CDs)修饰NADH为例，构建了高选择性检测0N00—的荧光纳米探针。
[0049]参阅图1所示，所述荧光纳米探针的合成工艺包括:采用业界已知的方式合成出表面具有羧基的荧光碳点，然后经过活化与3-氨基苯硼酸偶联反应，随后经过硼酸-酚识别原理将NADH组装到碳点表面。
[0050]更为具体的，所述荧光纳米探针的合成工艺可以包括如下步骤:
[0051]1、荧光碳点与NADH的偶联:采用常见的标记技术，将NADH修饰到荧光碳点表面。参阅图1，首先将荧光碳点表面的羧基进行活化，具体步骤如下:取5-20重量份份荧光碳点与5-100重量份偶联试剂，加入MES缓冲溶液(浓度约0.1M，pH值=6.1)中，在摇床中低速摇晃振荡孵育反应30分钟，然后将反应液用稀NaOH溶液调至中性，再加入与上述溶液等体积HEPES缓冲溶液(浓度约0.1M，pH值= 7.2)和NADH，在恒温摇床中低速孵育反应4小时，最后通过透析袋将未修饰上的辅酶，及小分子偶联剂等分离，透析2天后，将透析液浓缩，4°C冰箱保存备用，获得荧光纳米探针溶液。请参阅图2所示是本实施例中荧光碳点与辅酶(NADH)偶联前后的红外吸收光谱图。
[0052]2、0N00—制备:将浓度约50mM的H2O2溶液和浓度约50mM的NaNO2溶液分别冷冻30分钟，迅速混合后加入ImL预先已经冷冻的盐酸，随后迅速加入浓度约1.5mM的NaOH溶液冷却液以淬灭反应，搅拌反应3 O分钟，然后加入Mn O 2以除去过量的双氧水。随后，将反应液用滤膜将过量MnO2分离，滤液在-20°C冰箱保存，浓度则利用其在302nm处的吸光度与摩尔吸收系数(ε 302 = 16701^0^工)进行计算。
[0053]3、0Ν00—检测:将前述的荧光纳米探针分别滴加入不同浓度的0Ν00—标准溶液内，并加入PB缓冲溶液(浓度约0.1Μ、pH值=7.4)定容到相同体积，然后在荧光仪上测定不同样品的荧光强度，可以发现，随着0N00—的不断加入，所述荧光纳米探针产生的荧光会逐渐降低，在一定0N00—浓度范围(3*10—6?5*10—4mol/L)内，荧光淬灭程度与其浓度成线性关系(参阅图3所示)，由此可以建立荧光猝灭和0N00-浓度的标准关系曲线，其检测灵敏度可达到亚微摩尔水平。
[0054]请参阅图4所示，当有高浓度的干扰物质(常见活性氧、活性氮物质，浓度比0N00—高5倍)与0N00—共存时，本实施例的荧光纳米探针仍能特异性检测0N00—，而不会受到这些干扰物质的明显干扰。综上，本发明的荧光纳米探针充分利用无机纳米发光材料优异的光物理性质，氧化态的酶优异的电子捕获性能和所述的酶对0N00—的高特异性，能够实现对0N00—的宽浓度范围、高灵敏、高选择性的检测。
[0055]应当理解，上述实施例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种过氧亚硝酸根离子检测探针，其特征在于包括荧光纳米材料以及与所述荧光纳米材料结合的具有氧化还原性的酶;所述酶能够被过氧亚硝酸根离子选择性氧化形成氧化态的酶，且当所述荧光纳米材料在被激发光辐射后，处于激发态的电子会被转移至所述氧化态的酶而不能回到基态，导致所述荧光纳米材料的荧光淬灭。2.根据权利要求1所述的过氧亚硝酸根离子检测探针，其特征在于:所述荧光纳米材料包括荧光碳量子点、石墨烯量子点、半导体量子点、上转换发光材料、贵金属团簇、荧光硅纳米粒子和聚合物荧光纳米颗粒中的任意一种。3.根据权利要求1所述的过氧亚硝酸根离子检测探针，其特征在于:所述的酶包括还原型辅酶I(NADH)、细胞色素C、血红素、烟酰胺、硫胺素、核黄素、歧化酶、啦哆醛及其衍生物、辅酶Q中的任意一种或两种以上的组合。4.根据权利要求1所述的过氧亚硝酸根离子检测探针，其特征在于:所述的酶通过化学键与所述荧光纳米材料表面结合。5.根据权利要求4所述的过氧亚硝酸根离子检测探针，其特征在于:所述荧光纳米材料表面分布有羧基。6.权利要求1-5中任一项所述的过氧亚硝酸根离子检测探针的制备方法，其特征在于包括: 以偶联试剂与所述荧光纳米材料反应，使所述荧光纳米材料表面形成第一活性基团， 使所述的酶中的第二活性基团与分布于所述荧光纳米材料表面的第一活性基团反应，从而使所述的酶与所述无机荧光材料表面通过化学键结合，形成所述过氧亚硝酸根离子检测探针。7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于:所述第一活性基团包括羧基，所述第二活性基团包括氨基。8.一种试剂盒，其特征在于包括: 权利要求1-5中任一项所述的过氧亚硝酸根离子检测探针， 以及，辅助试剂，至少用于形成适于使过氧亚硝酸根离子选择性氧化所述的酶而形成氧化态的酶的液相环境。9.一种过氧亚硝酸根离子的检测方法，其特征在于包括: 将可能含有过氧亚硝酸根离子的样品与权利要求1-5中任一项所述的过氧亚硝酸根离子检测探针在选定液相体系中充分混合，通过观测其中荧光纳米材料的荧光猝灭程度，实现对所述样品中所含过氧亚硝酸根离子的检测； 其中，所述选定液相体系为适于使过氧亚硝酸根离子选择性氧化所述的酶而形成氧化态的酶的液相体系。10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于:当所述选定液相环境中过氧亚硝酸根离子的初始浓度为3*10—6?5*10—4mol/L时，所述荧光纳米材料的荧光猝灭程度与过氧亚硝酸根离子的浓度成线性关系。
【文档编号】G01N21/64GK105866083SQ201610217114
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月8日
【发明人】王宇辉, 林恒伟, 朱佳丽
【申请人】中国科学院宁波材料技术与工程研究所