检测转基因蛋白g10-epsps的胶体金速测试纸及其使用法
【专利摘要】本发明公开了一种检测转基因蛋白R1?EPSPS的胶体金速测试纸，包括设置在底板上的样品垫、金标垫、包被质控线和检测线的硝酸纤维素膜、吸样垫；所述金标垫上涂覆有胶体金标记的鼠抗g10?epsps单克隆抗体，所述检测线为包被有鼠抗g10?epsps单克隆抗体，所述质控线为包被有抗鼠IgG二抗。本发明还公开了上述胶体金速测试纸的使用方法：将速测试纸垂直插入待测样品中；8～10min后，进行观测；只出现C线，判断样品为阴性；同时出现T线和C线，判定样品为阳性。采用本发明的手持式胶体金速测试纸，能够快速、现场、灵敏地检测样品中的转基因蛋白g10?epsps。
【专利说明】
检测转基因蛋白g1〇-epsps的胶体金速测试纸及其使用法
技术领域
[0001]本发明涉及转基因蛋白检测技术领域，尤其涉及一种检测转基因蛋白glO-epsps 的手持式胶体金速测试纸。
【背景技术】
[0002] 发明人所在的研究组前期研究了从假单胞杆菌中克隆到抗除草剂的EPSPS基因 物体内芳香族氨基酸--色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸生物合成过程中的关键性酶;草甘磷是 通过抑制EPSP合成酶的活性而阻断芳香族氨基酸的合成最终导致受试植物死亡。但是某些 细菌的EPSP合成酶的活性不被草甘膦所抑制，所以细菌EPSPS基因的表达可以使植物免受 除草剂的伤害。将除草剂抗性基因EPSPS转入大豆，旨在培育具抗草甘膦优良特性的转基因 大豆，提高大豆生产中的田间除草效果，降低生产成本。
[0003] 该研究组利用从假单胞杆菌中克隆的抗除草剂的EPSPS基因，构建了植物组成型 表达载体PS0Y19,由35S启动子驱动，可以为转基因植物提供草甘膦抗性。PS0Y19质粒中只 含有1种能在植物细胞中表达的基因：细菌EPSPS，位于CaMV 35S启动子的控制下。抗除草剂 基因表达质粒为9557bp。插入序列EPSPS基因全长1321bp，编码一个含有440个氨基酸的多 肽。通过农杆菌介导法，已将EPSPS外源基因转化大豆华春3号和Jack品种并获得转EPSPS基 因的抗除草剂转基因大豆材料。
[0004] 目前转基因蛋白的常规检测方法是PCR，但是PCR方法对场地、仪器、技术人员的要 求比较高，样本处理复杂，不适合大量的筛选检测。有部分转基因蛋白已经可以通过速测试 纸和ELISA试剂盒的方法进行检测，但是glO-epsps为一个新引进的转基因蛋白，目前尚无 该方面的检测方法。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种检测转基因蛋白glO-epsps的手持式胶体金 速测试纸及其使用法，利用本发明能够快速、现场、灵敏地检测样品中的转基因蛋白gio-epsps〇
[0006] 为了解决上述技术问题，本发明提供以下一种检测转基因蛋白R1-EPSPS的胶体金 速测试纸（为手持式胶体金速测试纸），包括设置在底板上的样品垫、金标垫（即，标记垫）、 包被质控线和检测线的硝酸纤维素膜、吸样垫；所述金标垫上涂覆有胶体金标记的鼠抗 gl〇-epsps单克隆抗体，所述检测线为包被有鼠抗gl〇-epsps单克隆抗体，所述质控线为包 被有抗鼠IgG二抗(羊抗鼠IgG的二抗）。
[0007] 作为本发明的胶体金速测试纸的改进：
[0008] 鼠抗(特异性鼠抗)gl〇-epsps单克隆抗体为通过用gio-epsps重组蛋白免疫BALB/ c小鼠，然后通过细胞融合、克隆化筛选制备得到单克隆抗体细胞株，接着制备小鼠腹水，经 过纯化得到。
[0009]作为本发明的胶体金速测试纸的改进:gio-epsps为将G1中的gio-epsps基因经过 优化后构建入大肠杆菌表达体系，重组表达纯化得到。
[00?0]作为本发明的胶体金速测试纸的进一步改进:胶体金标记的鼠抗gio-epsps单克 隆抗体的制备法包括以下步骤：
[0011] 1)、制备2〇~3〇nm(较佳为25nm)的胶体金；
[0012] 2)、抗体标记：
[0013] 取lml的胶体金，调节pH到8 · 0，加入80yg的gio-epsps鼠单克隆抗体（鼠抗gio- epsps 单克隆抗体 ） ， 混合均勾 ，室温反应 30 ~ 50min; 加入 BSA 至终浓度为0 · 1 % (即， 100ml 中 含有〇.lg的BSA)，静置20~40min;
[0014]然后进行标记抗体纯化，得胶体金标记的鼠抗gl〇-epsps单克隆抗体。
[0015]本发明的转基因蛋白glO-epsps的手持式胶体金速测试纸的制备方法包括以下步 骤：
[0016] 1)在底板板上从加样区开始依次为并排粘贴的玻璃纤维膜（即样品垫)和固定有 胶体金标记抗体的金标垫、硝酸纤维素膜和吸样垫。
[0017] 2)金标垫上鼠抗gio-epsps单克隆抗体的涂覆量为5ng-50ng，硝酸纤维素膜上鼠 抗gl〇-epsps单克隆抗体的量为0 · 4yg-l · 2yg。
[0018] 3)试纸条干燥温度为37°C，时间为30min。
[0019] 本发明还同时提供了上述胶体金速测试纸的使用方法:将速测试纸垂直插入待测 样品中；
[0020] 8~10min后，进行观测；只出现C线，判断样品为阴性；同时出现T线和C线，判定样 品为阳性。
[0021] 备注说明:检测线(T线），质控线(C线）。
[0022]本发明的转基因蛋白glO-epsps的手持式胶体金速测试纸的具体检测步骤及原理 如下：
[0023]首先将速测试纸垂直插入检测样品中，不超过图5中的箭头位置;样品溶液沿样品 垫渗透至涂覆有胶体金标记的鼠抗gl〇-epsps单克隆抗体的标记垫（金标垫），如果样品溶 液中含转基因蛋白gl〇-epsps，那么gl〇-epsps蛋白将与标记垫上的鼠抗gl〇-epsps单克隆 抗体结合，继续上行，并与NC膜上的鼠抗gl〇-epsps单克隆抗体结合，其余未结合的胶体金 标记抗体与NC膜上的羊抗鼠IgG二抗结合，8-10min后，可于观察区中观察到检测区（即，检 测线）的颜色变化，即出现阳性条带；如果样品溶液中不含转基因蛋白glO-epsps，那么检测 区则观察不到阳性条带。而无论样品溶液中是否含转基因蛋白glO-epsps，当样品溶液到达 硝酸纤维素膜时，金标试纸条上的鼠抗gl〇-epsps单克隆抗体均可与控制区包被的抗鼠IgG 二抗结合，从而使硝酸纤维素膜上的C线显色。否则的话，需要重新进行实验(此属于公知常 识)。
[0024]因此，本发明转基因蛋白glO-epsps的手持式胶体金速测试纸的结果判断规则为： [0025]阴性结果(_)，只出现1条C线；
[0026]阳性结果( + ):同时出现T线和C线。
[0027]本发明的转基因蛋白glO-epsps的手持式胶体金速测试纸的对叶片、种子和散粮 等复杂基质具有较好的抗干扰效果，可广泛应用于转基因蛋白glO-epsps的快速检测，具有 以下特有优势。
[0028] (1)操作简单，不需要专门的仪器设备，可方便的于田间等现场直接进行检测。
[0029] (2)检测时间短(5-8min);结果判定标准统一，即阴性结果(-)，只出现1条C线；阳 性( + ):同时出现T线和C线。
[0030] 本发明的检测转基因蛋白gio-epsps的手持式胶体金速测试纸可针对叶片、种子 和散粮等样品中转基因蛋白glO-epsps进行快速、现场和灵敏的检测。
【附图说明】
[0031] 下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0032] 图1是SDS-PAGE检测gl〇-epsps蛋白的表达；
[0033] 1:诱导前；2:诱导后（约45KD)。
[0034] 图2是SDS-PAGE检测gl〇-epsps蛋白的表达形式；
[0035] 1:上清;2:包涵体;3、全菌。
[0036] 图3是SDS-PAGE检测gl〇-epsps蛋白的纯化效果；
[0037] 1:250mM咪唑洗脱液;2:150mM咪唑洗脱液；
[0038] 3: lOOmM咪唑洗脱液;4:50mM咪唑洗脱液。
[0039]图4是SDS-PAGE检测glO-epsps蛋白的透析效果；
[0040] 1:50mM咪唑洗脱液。
[0041]图5是本发明的转基因蛋白glO-epsps手持式胶体金速测试纸的结构示意图；
[0042]其中：
[0043]图A为测试纸的主视示意图；
[0044] 图B为图A的俯视不意图；
[0045] 图C为产品化的测试纸的结构示意图；
[0046] 图D为图C的侧视不意图。
【具体实施方式】
[0047] 下面结合附图并通过【具体实施方式】来进一步说明本发明专利的技术方案。
[0048] 实施例1、EPSPS蛋白的表达纯化
[0049] (1)蛋白的小试表达
[0050] 1、载体构建
[00511根据蛋白序列（glO-epsps)，合成基因序列，并构建入载体pET30a，得到pET30a-EPSPS阳性质粒。
[0052] 2、菌种活化：利用EMD Biosciences公司出售的商用的ET表达载体骨架，构建了 glO-epsps-E阳性质粒，转化BL21(DE3)，涂布LB固体培养基(卡那浓度50yg/mL)。次日，挑取 单克隆菌落接入5mL LB液体培养基(卡那浓度50yg/mL)，37°C培养12h-14h。
[0053] 3、小试表达:次日，菌种以l:50(v:v)接入5mL LB液体培养基（卡那浓度50yg/mL)， 37°C培养至0D = 0.4-0.6，吸取lmL菌液离心处理后作为诱导前对照。4mL菌液加入浓度为 0.8mM的IPTG，25°C诱导表达6h后菌液8000rpm、4°C离心lmin，收集菌体。SDS-PAGE鉴定蛋白 的形式，结果显示（图1)有明显目的蛋白的表达。
[0054] 4、蛋白表达形式的鉴定:上述表达的菌体（即，上述步骤所收集的菌体)加入lmL破 碎液进行超声波裂解。裂解条件:温度冰浴、功率240W、超声2s、间隔2s、时间30min。将得到 的全菌离心，12000rpm、4°C离心lmin，收集上清和包涵体。SDS-PAGE鉴定蛋白表达形式，结 果显示（图2)目的蛋白主要以可溶形式表达。
[0055] 图2中的"2:包涵体"即指上文中的沉淀；"3:全菌"即指上文中的离心前的破碎产 物。
[0056] (2)蛋白的大量表达和纯化
[0057] 1、菌种活化：固体平板上挑取pET30a-EPSPS单克隆菌落接入5mL LB液体培养基 (卡那浓度50yg/mL)，37°C培养 12h-14h。
[0058] 2、小试表达：次日，菌种以1: 50(v: v)接入800mLLB液体培养基（卡那浓度50yg/ mL)，37°C培养至0D = 0.4-0.6，加入浓度为0.8mM的IPTG，25°C诱导表达6h后菌液8000rpm、4 °C离心15min，收集菌体。
[0059] 3、菌种裂解:加100mL破碎液进行超声波裂解。裂解条件:温度冰浴、功率240W、超 声2s、间隔2s、时间lSmirul^OOOrpnKfC离心15min，收集上清。
[0060] 4、上清纯化:收集的上清利用高亲和性NI树脂（即，Ni-NTA亲和层析树脂(镍柱）） 进行纯化，分别以50mM、100mM、150mM、200mM咪唑进行洗脱；
[00611 收集流穿液、洗脱液。SDS-PAGE检测纯化效果，结果显示（图3) 50mM咪唑洗脱时蛋 白纯度最佳。用50mM，pH = 8.0的Tris-HCl缓冲液将洗脱液中的咪唑透析去除，SDS-PAGE检 测透析效果，结果显示（图4)蛋白透析后纯度和浓度均可行。经检测，最终目的蛋白纯度大 于90%，浓度2mg/mL，蛋白量10mg。
[0062] ⑶结果
[0063] pET30a-EPSPS蛋白诱导表达条件为：IPTG浓度0.8mM，诱导温度25°C，诱导时间6h。 蛋白主要在上清表达，上清经NI柱纯化、透析去除咪唑，最终所得gl〇-epsps蛋白：浓度2mg/ mL、纯度大于90%、蛋白10mg。
[0064]实施例2、抗体制备 [0065] (D单抗制备：
[0066] 1、免疫原制备:将表达纯化的蛋白与等体积的弗氏佐剂、Y0UL0NG佐剂混合乳化均 匀，成油包水状态，以备免疫小鼠。
[0067] 2、免疫策略:将蛋白免疫4只Balb/c小鼠，皮下免疫3次，间隔4周，最后经ELISA检 测，抗血清效价如下：
[0069] 3、细胞融合:最后一次免疫后两周，腹腔注射抗原（具体为gl〇-epsps蛋白表达纯 化的蛋白）进行加强免疫，三天后进行细胞融合。将小鼠断颈处死，70%乙醇浸泡30min消 毒，在超净台剪开腹腔，取出脾脏，磨碎，过80目筛网，得到脾细胞，加入SP2/0骨髓瘤细胞， 在PEG4000的作用下进行细胞融合。
[0070] 4、融合筛选:将融合好的细胞铺进96孔板，用HAT培养液进行培养，三天后换液，改 用HT培养液培养。10天后，取细胞培养上清进行检测。使用间接ELISA方法进行筛选，0D值〉 阴性对照孔2.1倍的孔判断为阳性孔。
[0071] 间接ELISA方法主要包括以下步骤：
[0072] 1)、用0.1Μ，ρΗ = 9.6的碳酸盐缓冲液稀释表达纯化的蛋白至lug/ml，加入96孔酶 标板，每孔l〇〇ul，37°C反应3h或者4°C静置过夜；
[0073] 2)、甩去板孔中液体，加入250ul洗涤缓冲液，静置30s，甩去板中液体，重复3次；
[0074] 3)、加入检测样本，每孔lOOul，同时加入阳性对照（2中所取阳性小鼠血清）、阴性 对照(免疫前小鼠血清)和空白对照(不加小鼠血清)37°C反应45min;
[0075] 4)、重复步骤2);
[0076] 5)、加入HRP标记的羊抗鼠酶标二抗，每孔100ul，37°C反应45min。
[0077] 5、克隆化与建株:使用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，10天后检测，将阳性克隆 继续有限稀释法进行克隆化，直到得到的克隆都为阳性，可建立阳性细胞株。最终获得阳性 细胞株5株。
[0078] 6、扩大培养:将建株的单克隆细胞扩大培养，并冻存于液氮中。
[0079] (2)腹水制备与纯化
[0080] 1、腹水制备:提前一周在小鼠腹腔注射矿物油，将一定数量(约106)的细胞注射入 小鼠腹腔，1 〇天左右收集腹水，4000rpm离心，得上清即为单克隆抗体腹水。
[0081 ] 2、单克隆抗体纯化:腹水离心15min(4000rpm，室温），取上清10ml，在4°C搅拌下逐 滴缓慢加入饱和硫酸铵至半饱和，继续搅拌30min，离心30min( 13000rpm，4°C )，弃上清;沉 淀溶于约1 OmlPBS (0.01M，pH7.4);在4 °C搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵至33 %，继续搅拌 30min，离心30min( 13000rpm，4°C)，弃上清;沉淀溶于适量10mlPBS(0 · 01M，pH7.4)，4°C透析 过夜，测定抗体含量，_20°C冻存备用。硫酸铵沉淀后继续采用Protein G小柱进行纯化，新 柱子先用5ml超纯水过柱，再用5ml 0.4M PB缓冲液(pH 7.0)平衡纯化小柱;抗体过柱，过程 中要求缓慢过柱，以求抗体蛋白更好的结合在结合位点上;继续l〇ml 0.4M PB缓冲液(pH 7.0)平衡纯化小柱;5ml 0.1M甘氨酸-盐酸缓冲液(pH 2.7)洗脱结合位点上的抗体，并在洗 脱液中加入lMTris-HCl(pH 8.0)0.5ml中和甘氨酸，使pH保持为适合抗体保存的中性。 [0082]从而得鼠抗gio-epsps单克隆抗体。
[0083]实施例3、胶体金标记的鼠抗gl〇-epsps单克隆抗体的制备法，具体包括以下步骤： [0084] 1. 25nm胶体金的制备：
[0085] 1.1准备：将500ml烧杯、20ml小烧杯、转子、棕色瓶、玻璃棒等洗净后放入酸缸中 (重铬酸钾:浓硫酸:超纯水= 120g: 200ml :1000ml)浸泡24小时。取出先用自来水冲洗3-4 次，再用超纯水冲洗3-4次，置于37 °C烘箱中烘干备用。
[0086] 1.2 1%HAuC14水溶液的配置:用塑料称量匙称取lg氯金酸粉末于棕色瓶中，加入 99ml超纯水充分溶解，4 °C避光保存。
[0087]注：氯金酸粉末极易潮解，称取的时候要快速，剩余氯金酸粉末用铝箱袋密封保 存。
[0088] 1.3 1%柠檬酸三钠水溶液的配置：称取lg柠檬酸三钠溶解于99ml超纯水中，混 匀。
[0089] 1.4 25nm胶体金的制备:量取99ml超纯水于烧杯中，加入lml 1%HAuC14水溶液， 置于恒温磁力搅拌器上搅拌混匀，开启加热至溶液沸腾，迅速加入2.5ml新制备的1%柠檬 酸三钠水溶液，继续搅拌加热，溶液逐渐变为蓝黑色，然后紫黑，再加热出现红色，继续沸煮 出现透明的橙红色，继续沸煮7-10min，自然冷却至室温，加超纯水使溶液至100ml。加入一 定的PEG20000至其终浓度为0.02 % -0.05 %。倒入棕色瓶，4°C避光保存。
[0090] 2.抗体标记：
[0091] 2.1抗体的标记:取lml制取好的胶体金，用1 %的K2C03调节PH到8.0，加入80yg上 述纯化得到的gl〇-epsps鼠单克隆抗体，混合均勾，室温反应40min。加入BSA至终浓度为 0.1%，静置30min。
[0092] 2.2标记抗体纯化:先用低速（1500r/min)离心15分钟，弃去由凝聚的金胶粒形成 的沉淀。然后用l〇〇〇〇r/min离心30分钟。仔细吸出上清，沉淀物用0.1ml含1%BSA的0.1M roS(PH7.4)复溶，加入5%叠氮钠至终浓度为0.05%，4°C保存。得胶体金标记的鼠抗gl0-epsps单克隆抗体。
[0093]实施例4、转基因蛋白glO-epsps免疫检测卡的制作
[0094]在底板7上按照常规方式并排粘贴样品垫1和固定有胶体金标记的特异性单克隆 抗体的金标垫2、醋酸纤维素膜3以及吸样垫4。在金标垫2上固定40ng鼠抗gl〇-epsps单克隆 抗体，在醋酸纤维素膜3上的检测区固定0.8yg鼠抗gl〇-epsps单克隆抗体以及在控制区固 定抗鼠IgG二抗0.4yg(分别作为检测线5和质控线6)。然后置于37°C真空干燥30min。
[0095] 实施例5、转基因蛋白glO-epsps免疫检测卡检测实际标准品的效果评价 [0096] ①样品杯中加入200yL空白样品液(pH 7.4,0.2mol/L PBS:8g氯化钠、3.35g十二 水合磷酸氢二钠，〇. 2g磷酸二氢钾，0.2g氯化钾，双蒸水溶解定容至1L)，将速测试纸插入样 品杯，在室温条件下反应8分钟后在结果观察区中观察显色结果。结果表明，观察区中T线不 显色，C线显色。
[0097] ②样品杯中加入100yL 0· lμg/ml的gio-epsps标准品（采用同上的PBS溶液稀释配 成），按照与空白样品同样的操作步骤。结果表明，观察区中C线、T线同时显色。
[0098] gio-epsps标准品的获取方法为：
[0099] 大肠杆菌E.coli中原核表达并通过亲和纯化的His-EPSPS(实施例2所得），N端带 有6个His标签，其母液浓度为3mg/ml，用稀释液稀释到900ng/ml，3mL棕色玻璃瓶加入100yL 900ng/ml标准品，冷冻干燥机过夜抽干得到标准品冻干粉，即为gl〇-epsps标准品。
[0?00]实施例6、转基因蛋白gl〇-epsps免疫检测卡检测实际叶片样本的效果评价
[0101] ①样品杯中加入200yL阴性叶片样本提取液，按照与标准品同样的操作步骤。结果 表明，观察区中只有控制线C线显色，检测线T线不显色。
[0102] ②样品杯中加入200yL阳性叶片样本提取液，按照与阴性样品同样的操作步骤。结 果表明，观察区中控制线C线和检测线T线均显色。
[0103] 备注说明：
[0104] 1、叶片样本提取液为0.1M PBS缓冲液，叶片依据本行业常规的方法进行提取。
[0105] 2、上述阴性叶片样本经RT-PCR方法确认，gio-epsps含量无法检测到;而阳性叶片 样本中gl〇-epsps经RT-PCR检测为阳性。
[0106]实施例7、转基因蛋白gio-epsps免疫检测卡检测实际种子样本的效果评价
[0107] ①样品杯中加入200yL阴性种子样本提取液，按照与标品同样的操作步骤。结果表 明，观察区中只有控制线C线显色，检测线T线不显色。
[0108] ②样品杯中加入200yL阳性种子样本提取液，按照与阴性样品同样的操作步骤。结 果表明，观察区中控制线C线和检测线T线均显色。
[0109] 备注说明：
[0110] 1、种子样本提取液为0.1M PBS缓冲液。种子依据本行业常规的方法进行提取。
[0111] 2、上述阴性种子样本经RT-PCR法和ELISA方法法确认，gio-epsps含量无法检测 到;而阳性种子样本中gl〇-epsps经RT-PCR检测为阳性，经ELISA方法检测含量在100-500μ g/ml〇
[0112]实施例8、转基因蛋白gl〇-epsps免疫检测卡检测实际散粮样本的效果评价
[0113] ①样品杯中加入200yL阴性散粮样本提取液，按照与标品同样的操作步骤。结果表 明，观察区中只有控制线C线显色，检测线T线不显色。
[0114] ②阴性散粮样本中加入0.2%阳性种子样本，得到阳性散粮样本，将该样本进行提 取，样品杯中加入200yL阳性散粮样本提取液，按照与阴性样品同样的操作步骤。结果表明， 观察区中控制线C线和检测线T线均显色。
[0115] 备注说明：
[0116] 1、种子样本提取液为0.1M PBS缓冲液。种子依据本行业常规的方法进行提取。
[0117] 2、上述阴性散粮样本经RT-PCR方法（目前已有的检测法)确认，glO-epsps表达量 无法检测到;而阳性散粮样本中gl〇-epsps含量为经RT-PCR检测为阳性。
[0118] 最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发 明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容 直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
【主权项】
1. 检测转基因蛋白R1-EPSPS的胶体金速测试纸，包括设置在底板上的样品垫、金标垫、 包被质控线和检测线的硝酸纤维素膜、吸样垫;其特征在于:所述金标垫上涂覆有胶体金标 记的鼠抗gl〇-epsps单克隆抗体，所述检测线为包被有鼠抗gl〇-epsps单克隆抗体，所述质 控线为包被有抗鼠 IgG二抗。2. 根据权利要求1所述的胶体金速测试纸，其特征在于： 鼠抗gl〇-epsps单克隆抗体为通过用gl〇-epsps重组蛋白免疫BALB/c小鼠，然后通过细 胞融合、克隆化筛选制备得到单克隆抗体细胞株，接着制备小鼠腹水，经过纯化得到。3. 根据权利要求2所述的胶体金速测试纸，其特征在于：gl〇-epsps为将G1中的gl〇-印sps基因经过优化后构建入大肠杆菌表达体系，重组表达纯化得到。4. 根据权利要求1、2或3所述的胶体金速测试纸，其特征在于:胶体金标记的鼠抗gl〇-epsps单克隆抗体的制备法包括以下步骤： 1) 、制备20~30nm的胶体金； 2) 、抗体标记： 取lml的胶体金，调节pH到8.0,加入80yg的gl〇-epsps鼠单克隆抗体，混合均勾，室温反 应30~50min;加入BSA至终浓度为0 · 1 %，静置20~40min; 然后进行标记抗体纯化，得胶体金标记的鼠抗gl〇-epsps单克隆抗体。5. 如权利要求1~4任一所述的胶体金速测试纸的使用方法，其特征在于： 将速测试纸垂直插入待测样品中； 8~lOmin后，进行观测；只出现C线，判断样品为阴性；同时出现T线和C线，判定样品为 阳性。
【文档编号】G01N33/558GK105866413SQ201610109563
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年2月28日
【发明人】寿惠霞, 杜娟, 李林, 陆玲鸿, 武爱波, 徐伟
【申请人】浙江大学, 无锡福阳生物科技有限公司