基于超顺磁氧化铁纳米颗粒聚集体联合普鲁士蓝染色的免疫层析试纸条及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明公开了一种基于超顺磁氧化铁纳米颗粒聚集体联合普鲁士蓝染色的免疫层析试纸条及制备方法和应用，所述试纸条组成包括底板、吸水纸、硝酸纤维膜、结合垫、样品垫，所述底板上粘贴硝酸纤维膜，硝酸纤维膜的一端连接吸水纸、另一端粘贴结合垫，所述结合垫上搭接样品垫，硝酸纤维膜上设有质控线C线和检测线T线。与现有技术中的免疫层析试纸条不同，本发明采用表面带羧基的超顺磁性氧化铁纳米颗粒聚集体作为标记探针，创新性地用普鲁士蓝染液对Fe3O4进行染色，有效放大检测信号。试纸条检测操作简单，无需特殊仪器、特殊实验环境，无需专业人员即可进行样品的检测，且成本低，反应迅速，短时间内即可完成检测。
【专利说明】
基于超顺磁氧化铁纳米颗粒聚集体联合普鲁士蓝染色的免疫层析试纸条及其制备方法和应用
技术领域
[0001]本发明涉及一种免疫层析试纸条及其制备方法，特别涉及一种基于超顺磁氧化铁纳米颗粒聚集体联合普鲁士蓝染色的免疫层析试纸条及制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]免疫层析检测是一种廉价、快速的床旁测试方法。广泛应用于人体及动物医学、食品工程、制药、生物制剂、个人护理、环境监测、水质监测等。其在2010年市场规模达到了33.6亿美元，其中美国市场贡献了 16.8亿美元，约占50 %，欧洲市场为40 %，13.44亿美元，剩下不到10%为其他国家所有。在过去的30年里，侧向免疫层析技术得到了飞跃式的发展，到2010年，有超过100家的企业在制备生产试纸条。然而，尽管市场巨大，而且仍然不断增长，但是不到30家公司(主要为瑞士的罗氏、美国的艾美利尔、碧迪等)，持有94%的市场份额。其基本概念是将抗体抗原的免疫反应设置在多孔的硝酸纤维膜上。当加入待测样本后，在硝酸纤维膜一端的探针被释放，随着待测样本一同流向另一端。通过读取检测线上探针的信号，得到检测结果。现在市面上大多数的探针都是采用胶体金作为标记探针，通过肉眼或者光学仪器读取颜色信号。胶体金作为免疫层析用的探针其技术成熟稳定，但是对于某些灵敏度要求高的样本，检测线上标记物的颜色很淡，甚至有可能被背景噪声覆盖，导致低值样本和零浓度样本的值难以区分，因此检测的灵敏度受到了限制。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一种超顺磁氧化铁纳米颗粒聚集体联合普鲁士蓝染色的免疫层析试纸条，所述试纸条采用超顺磁氧化铁纳米颗粒聚集体替换了免疫层析中的胶体金，将超顺磁氧化铁纳米颗粒聚集体与单克隆捕获抗体成功结合，形成探针，将超顺磁氧化铁纳米颗粒聚集体的磁学性能和抗体、抗原特异免疫反应结合，建立了快速、特异、简便、灵敏的免疫层析试纸条。
[0004]本发明的另一目的还在于提供上述超顺磁氧化铁纳米颗粒聚集体联合普鲁士蓝染色的免疫层析试纸条的制备方法。
[0005]为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案:
[0006]—种基于超顺磁氧化铁纳米颗粒聚集体联合普鲁士蓝染色的免疫层析试纸条，所述试纸条包括底板、吸水纸、硝酸纤维膜、结合垫、样品垫，所述底板上粘贴硝酸纤维膜，硝酸纤维膜的一端连接吸水纸、另一端粘贴结合垫，所述结合垫上搭接样品垫，硝酸纤维膜上设有一条包被有羊抗鼠IgG抗体的质控线C线，其特征在于，所述硝酸纤维膜上还设有一条与所述质控线C线平行的包被有单克隆检测抗体的检测线T线，所述结合垫为固定有超顺磁性氧化铁纳米颗粒聚集体偶联单克隆捕获抗体免疫探针的玻璃纤维膜。
[0007]所述试纸条还设有一个上盖，所述上盖上设置有加样窗口和信号读取窗口，其中加样窗口与样品垫对应，信号读取窗口与质控线C线、检测线T线对应。
[0008]所述试纸条还可以与普鲁士蓝染液联合使用，样品加入后，将普鲁士蓝染液加入到检测窗口，检测线、质控线上的氧化铁颗粒形成强烈的深蓝色普鲁士蓝，用仪器读取结果O
[0009]所述的普鲁士蓝染液是含量为1-1Owt%的亚铁氰化钾水溶液和含量为5_20wt%的盐酸的等体积混合物。染色过程中盐酸透过小分子将表面一层颗粒溶解，形成的三价铁离子和亚铁氰化钾反应形成深蓝色普鲁士蓝；
[0010]所述超顺磁氧化铁纳米颗粒聚集体为表面带羧基的氧化铁纳米颗粒聚集体，所述纳米颗粒聚集体表面有柠檬酸三钠。
[0011]所述单克隆捕获抗体优选为抗hCG单克隆捕获抗体或心肌肌钙蛋白I捕获抗体;所述单克隆检测抗体优选为抗hCG单克隆检测抗体或心肌肌钙蛋白I检测抗体。
[0012]所述的底板为PVC硬塑底板，样品垫为玻璃纤维膜，吸水纸为硬纸板。
[0013]本发明还涉及上述基于超顺磁氧化铁纳米颗粒聚集体联合普鲁士蓝染色的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤:
[0014](I)以氯化高铁、柠檬酸三钠、乙酸钠为原料，乙二醇为溶剂，通过溶剂热法制备表面带有羧基的超顺磁氧化铁纳米颗粒聚集体；
[0015](2)将步骤(I)中制备的超顺磁氧化铁纳米颗粒聚集体表面羧基用EDC/NHS活化，再加单克隆捕获抗体进行偶联，最后加入BSA封闭，磁分离后重悬备用，制得免疫探针；
[0016](3)用喷膜划线设备将步骤(2)中制备的免疫探针固定在结合垫上，并预处理样品垫；
[0017](4)采用喷膜划线设备将单克隆检测抗体、羊抗鼠IgG抗体包被在硝酸纤维膜上；
[0018](5)在试纸条底板上粘贴硝酸纤维膜，硝酸纤维膜的一端连接吸水纸、另一端连接结合垫，样品垫搭在结合垫上，两端交错；
[0019]更具体和优化地，所述的方法包括以下步骤:
[0020](I)称取氯化高铁、柠檬酸三钠、乙酸钠溶于乙二醇中，其中氯化高铁、柠檬酸三钠、乙酸钠的质量比为0.6?3.0:1?4: 3?9，氯化高铁与乙二醇的质量体积比为0.6g?3.0g: 50mL?100mL，将上述溶液倒入聚四氟乙烯内衬的反应釜中，100?250 °C条件下，反应8?24h，然后分别用乙醇、纯水清洗，并保存在超纯水中，按照铁含量，定容到5mg/mL，4°C放置，制得表面带有羧基的超顺磁氧化铁纳米颗粒聚集体；
[0021](2)取步骤(I)制备的超顺磁氧化铁纳米颗粒聚集体加入超纯水中，其浓度按铁含量记为0.1?10mg/mL；再加入EDC/NHS，其中Fe:EDC:NHS质量比为1:0.1?10:0.1?10，混合溶液充分混匀后放入空气浴恒温摇床中控制温度为O?50 °C、转速为50?220rpm，反应1min?lh，磁分离，得到活化后的超顺磁氧化铁纳米颗粒聚集体;按照单克隆捕获抗体与活化后的超顺磁氧化铁纳米颗粒聚集体质量比0.01?0.500:1，将单克隆捕获抗体与活化后的超顺磁氧化铁纳米颗粒聚集体混合加入偶联缓冲液中，并将其置于空气浴恒温摇床中控制温度为O?50°C、转速为50?220rpm，反应30min?2h后，加入BSA，使混有单克隆捕获抗体与活化后的超顺磁氧化铁纳米颗粒聚集体的偶联缓冲液中BSA质量浓度为0.1?I %，继续在空气浴摇床中反应I?2h，然后磁分离，再用清洗缓冲液清洗三次，最后用重悬液重悬至Fe含量为I?4mg/mL，制得免疫探针；
[0022](3)将样品垫、结合垫浸泡在处理液中，0.5?2min后取出，然后在15?70°C烘箱中干燥待用;将步骤⑵制得的免疫探针以2?lOyL/cm的量，喷洒在结合垫上、干燥，制得固定有探针的结合垫以及经过处理的样品垫。
[0023](4)将硝酸纤维膜放置在湿度为25?65%的密闭箱中平衡lh，将单克隆检测抗体用pH为6.5?7.5的tris-盐酸缓冲液稀释至0.2?2mg/mL，羊抗鼠IgG抗体用磷酸盐缓冲液稀释至0.1?lmg/mL，将上述两种抗体在硝酸纤维膜上划线，划线量为0.2?2yL/cm，划线结束后，干燥备用；
[0024](5)在带有粘性的PVC底板中部粘贴步骤(4)制备的硝酸纤维膜，所述硝酸纤维膜一端粘贴吸水纸，二者重叠宽度为0.5?2cm;所述硝酸纤维膜另一端接结合垫，二者相互交错，重叠宽度为0.5?4cm;样品垫覆盖在结合垫上，将底板固定，最后裁切成免疫层析试纸条。
[0025]所述方法步骤(2)中，所述偶联缓冲液为缓冲基液，所述缓冲基液为浓度为0.002?0.2M、pH=6.0?9.0的碳酸缓冲液、磷酸缓冲液、硼酸缓冲液中的一种;所述清洗缓冲液为缓冲基液中加入占缓冲基液总质量0.05?0.^^%的吐温-20;所述重悬液为缓冲液基液中加入占缓冲基液总质量0.05?0.1wt %的吐温-20、I?5wt %的蔗糖以及0.1?Iwt %的海藻糖。
[0026]所述方法步骤(3)中，所述样品垫和结合垫为亲水或者疏水的玻璃纤维或聚酯纤维。
[0027]所述方法步骤(3)中，所述处理液为缓冲液与效应物的混合溶液，所述缓冲液为pH=4?9、浓度为0.002?0.2M的碳酸缓冲液、磷酸缓冲液、硼酸缓冲液中的一种，所述效应物为占处理液总质量0.01?Iwt %的分子量为400?20000的PEG、0.01?lwt%的叠氮钠、0.05?5wt%的酪蛋白、0.05?5wt%的胎牛血清蛋白、0.01?子量为1K?30K的聚乙烯P比略烧酮、0.01?Iwt%的吐温-20或Triton X_100、0.01?1界1:%的鹿糖或海藻糖中的其中任意一种或者任意几种。
[0028]所述方法步骤(4)中，所述硝酸纤维膜为跑水速度为75s、90s、135s或180s的硝酸纤维膜。
[0029]所述方法步骤(4)中，所述用于稀释羊抗鼠IgG抗体的缓冲液为pH=4?9、浓度为
0.005?0.5M的磷酸盐缓冲液，pH = 6?9、浓度为0.1?3M三羟基甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，PH=6?9、浓度为0.02?2M的硼酸盐缓冲液中的任意一种。
[0030]所述方法中，将待测样品加入样品垫15?20min后，将普鲁士蓝染液加入到所述检测窗口，检测线、质控线上的氧化铁颗粒形成强烈的深蓝色普鲁士蓝，用仪器读取结果。
[0031]所述单克隆捕获抗体优选为抗hCG单克隆捕获抗体和心肌肌钙蛋白I捕获抗体;所述单克隆检测抗体优选为抗hCG单克隆检测抗体和心肌肌钙蛋白I检测抗体。
[0032]本发明中利用双抗夹心法对待测样本进行可视化判读或灰度值定量检测。以hCG为例，将含有一定量或不含hCG血清样品滴加到样品垫中，10?15min中后，用视力判读定性结果，或者用灰度值读取仪器进行定量测量。为了进一步提高试纸条的灵敏度，在样品加入15?20min后，在检测窗口加入配好的普鲁士蓝染液5?100yL，染色时间为I?5min，再用目测或者灰度值读取仪器进行测量。
[0033]检测原理为:将含有待测物的样本滴加到样品垫后，样本被样品垫上已干燥的缓冲液成分改性，进入到结合垫后，结合垫上的免疫探针被释放，随着样本一同流向吸水纸一侦U。在流动过程中，待测物与免疫探针发生免疫反应，形成抗原探针复合物，该复合物在经过检测线时，被固定在检测线上的单克隆检测抗体截获，形成检测信号，部分没有捕获抗原的免疫探针继续流动到质控线上，形成质控信号。当加入普鲁士蓝染液后，盐酸将检测线和质控线上的Fe3O4变为Fe3+铁离子，亚铁氰跟离子，与三价铁形成复合物，显示出强烈的蓝色，从而进一步提高免疫层析试纸条的灵敏度。
[0034]有益效果:超顺磁氧化铁纳米颗粒聚集体表面带羧基，可以直接与捕获抗体上的氨基形成共价键，相对于胶体金、胶乳的静电吸附，这种连接方式更加稳定可靠;超顺磁氧化铁纳米颗粒聚集体作为一种超顺磁性质材料，只有在磁场中才能显示出磁性，因此磁性微球在溶液中不容易发生聚集沉淀，直接使用磁力架进行磁分离清洗，省去了繁琐的离心过程;采用普鲁士蓝染色，能够进一步提高灵敏度，实现定量检测。基于以上，本发明采用超顺磁氧化铁纳米颗粒聚集体成功替换了免疫层析中的胶体金，将超顺磁氧化铁纳米颗粒聚集体与单克隆捕获抗体成功结合，形成免疫探针，将超顺磁氧化铁纳米颗粒聚集体的磁学性能和抗体、抗原特异免疫反应结合，建立了快速、特异、简便、灵敏的免疫层析检测方法。通过用普鲁士蓝染色，能够进一步将检测灵敏度提高，实现定量检测。
[0035]下面结合具体实施例对本发明进行详细描述。本发明的保护范围并不以【具体实施方式】为限，而是由权利要求加以限定。
【附图说明】
[0036]图1(A)为一种基于超顺磁氧化铁纳米颗粒聚集体联合普鲁士蓝染色的免疫层析试纸条的俯视图；图10)为一种基于超顺磁氧化铁纳米颗粒聚集体联合普鲁士蓝染色的免疫层析试纸条的内部透视图。其中I为加样窗口，2为信号读取窗口，3为样品垫，4是结合垫，5是硝酸纤维膜，6是检测线，7是质控线，8是吸水纸，9为底板，10为上盖。
[0037]图2为一种基于超顺磁氧化铁纳米颗粒聚集体联合普鲁士蓝染色的免疫层析试纸条在普鲁士蓝染液加入前后检测T线上灰度值随hCG浓度的变化曲线。
[0038]图3(A)为本发明所述的免疫层析试纸条滴加待测样品ISmin后用普鲁士蓝染液染色前的颜色；图3(B)为本发明所述的免疫层析试纸条滴加待测样品ISmin后用普鲁士蓝染液染色后的颜色。
[0039]图4为超顺磁性氧化铁纳米颗粒聚集体扫描电镜图。
【具体实施方式】
[0040]下面通过具体实施例对本发明所述的技术方案给予进一步详细的说明，但有必要指出，以下实施例只用于对
【发明内容】
的描述，并不构成对本发明保护范围的限制。
[0041]实施例1-2中所述抗hCG单克隆捕获抗体购买于海肽生物科技(上海有限公司)，其克隆号为28A4;抗hCG单克隆检测抗体购买于海肽生物科技(上海有限公司)，其克隆号为27E8;心肌肌钙蛋白I捕获抗体购买于海肽生物科技(上海有限公司)，其克隆号为19C7;和心肌肌钙蛋白I检测抗体购买于海肽生物科技(上海有限公司)，其克隆号为820。
[0042]实施例1
[0043](I)称取氯化高铁3.0g，柠檬酸三钠4g，乙酸钠9g，溶于乙二醇100mL。待溶质完全溶解后，将得到的黄褐色混合物倒入聚四氟乙烯内衬的反应釜中，100条件下，反应24h，然后分别用乙醇、纯水清洗，并将得到的黑色产物保存在超纯水中，按照铁含量，定容到5mg/mL，4°C放置，制得表面带有羧基的超顺磁氧化铁纳米颗粒聚集体；
[0044](2)取步骤(I)制备的超顺磁氧化铁纳米颗粒聚集体5mg加入ImL超纯水中，放入空气浴恒温摇床中控制温度为25°C、转速为180rpm，反应40min，磁力架磁分离，得到活化后的超顺磁氧化铁纳米颗粒聚集体;按照抗hCG单克隆捕获抗体与活化后的超顺磁氧化铁纳米颗粒聚集体质量比0.500: I，将2.5mg抗hCG单克隆捕获抗体与活化后的超顺磁氧化铁纳米颗粒聚集体混合加入ImL偶联缓冲液中，并将其置于空气浴恒温摇床中控制温度为10°C、转速为220rpm，反应2h后，加入BSA，使混有抗hCG单克隆捕获抗体与活化后的超顺磁氧化铁纳米颗粒聚集体的偶联缓冲液中BSA浓度为lwt%，继续在空气浴摇床中反应2h，然后磁分离，再用清洗缓冲液清洗三次，最后用重悬液重悬至Fe含量为4mg/mL，制得抗hCG免疫抗体探针;所述偶联缓冲液为缓冲基液，所述缓冲基液为浓度为0.02M、pH=9.0的碳酸缓冲液;所述清洗缓冲液为缓冲基液中加入占缓冲基液总质量0.1wt%的吐温-20;所述重悬液为缓冲液基液中加入占缓冲基液总质量0.1wt %的吐温-20、5wt %的蔗糖以及Iwt %的海藻糖。
[0045](3)选用亲水的玻璃纤维为样品垫和结合垫，将样品垫、结合垫浸泡在10mL缓冲液与效应物的混合溶液中，2min后取出，然后在70°C烘箱中干燥待用;将步骤(2)制得的抗hCG免疫抗体探针以I OyL/cm的量，喷洒在结合垫上、干燥，制得固定有探针的结合垫以及经过处理的样品垫。所述缓冲液为pH=9、0.002M的磷酸缓冲液，所述效应物为占处理液总质量lwt%的分子量为400?20000的PEG、lwt%的叠氮钠、0.05wt%的酪蛋白、0.05wt%的胎牛血清蛋白、0.01wt%的海藻糖。
[0046](4)选用跑水速度为90s的硝酸纤维膜，将硝酸纤维膜放置在湿度为25?65%的密闭箱中平衡Ih，将120yg抗hCG单克隆检测抗体用pH为6.5的tr i s-盐酸缓冲液稀释至2mg/mL，60yg羊抗鼠IgG抗体用缓冲液稀释至lmg/mL，将上述两种抗体在硝酸纤维膜上划线，划线量为yL/cm，划线结束后，干燥备用;所述用于稀释羊抗鼠IgG抗体的缓冲液为pH=7.4、浓度为0.005M的磷酸盐缓冲液。
[0047](5)在带有粘性的PVC底板中部粘贴步骤(4)制备的硝酸纤维膜，所述硝酸纤维膜一端粘贴吸水纸，二者重叠宽度为2cm;所述硝酸纤维膜另一端接结合垫，二者相互交错，重叠宽度为4cm;样品垫覆盖在结合垫上，将底板固定，最后裁切成免疫层析试纸条。
[0048](6)利用双抗夹心法对待测样本进行可视化判读或灰度值定量检测。将含有一定量或不含hCG的血清样品加入样品垫20min后，用视力判读定性结果，或者用灰度值读取仪器进行定量测量。为了进一步提高试纸条的灵敏度，在样品加入20min后加入配好的普鲁士蓝染液lOOyL，染色时间为3min，再用目测或者灰度值读取仪器进行测量。将普鲁士蓝染液加入到所述检测窗口，检测线、质控线上的氧化铁颗粒形成强烈的深蓝色普鲁士蓝，用仪器读取结果。
[0049]实施例2
[0050](I)称取氯化高铁0.6g，柠檬酸三钠lg，乙酸钠3g，溶于乙二醇50mL。待溶质完全溶解后，将得到的黄褐色混合物倒入聚四氟乙烯内衬的反应釜中，250°C条件下，反应8h，然后分别用乙醇、纯水清洗，并将得到的黑色产物保存在超纯水中，按照铁含量，定容到5mg/mL，4°C放置，制得表面带有羧基的超顺磁氧化铁纳米颗粒聚集体；
[0051 ] (2)取步骤(I)制备的超顺磁氧化铁纳米颗粒聚集体5mg加入ImL超纯水中，放入空气浴恒温摇床中控制温度为50°C、转速为50rpm，反应60min，磁力架磁分离，得到活化后的超顺磁氧化铁纳米颗粒聚集体;按照心肌肌钙蛋白I捕获抗体与活化后的超顺磁氧化铁纳米颗粒聚集体质量比0.0l:1，将0.05mg心肌肌钙蛋白I捕获抗体与活化后的超顺磁氧化铁纳米颗粒聚集体混合加入ImL偶联缓冲液中，并将其置于空气浴恒温摇床中控制温度为50°C、转速为50rpm，反应30min后，加入BSA，使混有心肌肌钙蛋白I捕获抗体与活化后的超顺磁氧化铁纳米颗粒聚集体的偶联缓冲液中BSA浓度为0.lwt%，继续在空气浴摇床中反应2h，然后磁分离，再用清洗缓冲液清洗三次，最后用重悬液重悬至Fe含量为4mg/mL，制得抗心肌肌钙蛋白I免疫探针;所述偶联缓冲液为缓冲基液，所述缓冲基液为浓度为0.002M、pH= 9.0的碳酸缓冲液;所述清洗缓冲液为缓冲基液中加入占缓冲基液总质量0.1wt %的吐温-20;所述重悬液为缓冲液基液中加入占缓冲基液总质量0.1wt %的吐温-20、5wt %的蔗糖以及1?〖％的海藻糖。
[0052](3)选用疏水的聚酯纤维为样品垫和结合垫，将样品垫、结合垫浸泡在10mL缓冲液与效应物的混合溶液中，0.5min后取出，然后在15°C烘箱中干燥待用;将步骤(2)制得的抗心肌肌钙蛋白I免疫探针以2yL/cm的量，喷洒在结合垫上、干燥，制得固定有探针的结合垫以及经过处理的样品垫。所述缓冲液为pH = 9、浓度为0.002M的磷酸缓冲液，所述效应物为占处理液总质量Iwt %的分子量为20000的PEG、Iwt %的叠氮钠、0.05wt%的酪蛋白、
0.05界1:%的胎牛血清蛋白、0.01界1:%的海藻糖。
[0053](4)选用跑水速度为180s的硝酸纤维膜，将硝酸纤维膜放置在湿度为65%的密闭箱中平衡Ih，将60yg心肌肌I丐蛋白I检测抗体用pH为7.2的tris-盐酸缓冲液稀释至2mg/mL，30yg羊抗鼠IgG抗体用缓冲液稀释至2mg/mL，将上述两种抗体在硝酸纤维膜上划线，划线量为lyL/cm，划线结束后，干燥备用;所述用于稀释羊抗鼠IgG抗体的缓冲液为pH=9、浓度为0.005M的磷酸盐缓冲液。
[0054](5)在带有粘性的PVC底板中部粘贴步骤(4)制备的硝酸纤维膜，所述硝酸纤维膜一端粘贴吸水纸，二者重叠宽度为2cm;所述硝酸纤维膜另一端接结合垫，二者相互交错，重叠宽度为4cm;样品垫覆盖在结合垫上，将底板固定，最后裁切成免疫层析试纸条。
[0055](6)利用双抗夹心法对待测样本进行可视化判读或灰度值定量检测。将含有一定量或不含心肌肌钙蛋白I的血清样品加入样品垫20min后，用视力判读定性结果，或者用灰度值读取仪器进行定量测量。为了进一步提高试纸条的灵敏度，在样品加入20min后加入配好的普鲁士蓝染液lOOyL，染色时间为3min，再用目测或者灰度值读取仪器进行测量。将普鲁士蓝染液加入到所述检测窗口，检测线、质控线上的氧化铁颗粒形成强烈的深蓝色普鲁士蓝，用仪器读取结果。
【主权项】
1.一种基于超顺磁氧化铁纳米颗粒聚集体联合普鲁士蓝染色的免疫层析试纸条，所述试纸条组成包括底板、吸水纸、硝酸纤维膜、结合垫、样品垫，所述底板上粘贴硝酸纤维膜，硝酸纤维膜的一端连接吸水纸、另一端粘贴结合垫，所述结合垫上搭接样品垫，硝酸纤维膜上设有一条包被有羊抗鼠IgG抗体的质控线C线，其特征在于，所述硝酸纤维膜上还设有一条与所述质控线C线平行的包被有单克隆检测抗体的检测线T线，所述结合垫为固定有超顺磁性氧化铁纳米颗粒聚集体偶联单克隆捕获抗体免疫探针的玻璃纤维膜。2.根据权利要求1所述的一种基于超顺磁氧化铁纳米颗粒聚集体联合普鲁士蓝染色的免疫层析试纸条，其特征在于，所述试纸条还可以与普鲁士蓝染液联合使用，样品加入后，将普鲁士蓝染液加入到质控线C线、检测线T线上；所述的普鲁士蓝染液是质量浓度为1-10%的亚铁氰化钾水溶液和5-20 %的盐酸的等体积混合物。3.根据权利要求1所述的一种基于超顺磁氧化铁纳米颗粒聚集体联合普鲁士蓝染色的免疫层析试纸条，其特征在于，所述超顺磁氧化铁纳米颗粒聚集体为表面带羧基的氧化铁纳米颗粒聚集体，所述纳米颗粒聚集体表面有柠檬酸三钠。4.根据权利要求1所述的一种基于超顺磁氧化铁纳米颗粒聚集体联合普鲁士蓝染色的免疫层析试纸条，其特征在于，所述单克隆捕获抗体为抗hCG单克隆捕获抗体或心肌肌钙蛋白I捕获抗体;所述单克隆检测抗体为抗hCG单克隆检测抗体或心肌肌钙蛋白I检测抗体。5.—种基于超顺磁氧化铁纳米颗粒聚集体联合普鲁士蓝染色的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: (1)以氯化高铁、柠檬酸三钠、乙酸钠为原料，乙二醇为溶剂，通过溶剂热法制备表面带有羧基的超顺磁氧化铁纳米颗粒聚集体； (2)将步骤(I)中制备的超顺磁氧化铁纳米颗粒聚集体表面羧基用碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺活化，再与单克隆捕获抗体进行偶联，最后加入BSA封闭，磁分离后重悬备用，制得免疫探针； (3)用喷膜划线设备将步骤(2)中制备的免疫探针固定在结合垫上，并预处理样品垫； (4)采用喷膜划线设备将单克隆检测抗体、羊抗鼠IgG抗体包被在硝酸纤维膜上； (5)在试纸条底板上粘贴硝酸纤维膜，硝酸纤维膜的一端连接吸水纸、另一端连接结合垫，样品垫搭在结合垫上，两端交错。6.根据权利要求6所述的一种基于超顺磁氧化铁纳米颗粒聚集体联合普鲁士蓝染色的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: (1)称取氯化高铁、柠檬酸三钠、乙酸钠溶于乙二醇中，其中氯化高铁、柠檬酸三钠、乙酸钠的质量比为0.6?3.0:1?4: 3?9，氯化高铁与乙二醇的质量体积比为0.6g?3.0g:50mL?lOOmL，将上述溶液倒入聚四氟乙烯内衬的反应釜中，100?250°C条件下，反应8?24h，然后分别用乙醇、纯水清洗，并保存在超纯水中，按照铁含量，定容到5mg/mL，4°C放置，制得表面带有羧基的超顺磁氧化铁纳米颗粒聚集体； (2)取步骤(I)制备的超顺磁氧化铁纳米颗粒聚集体加入超纯水中，其浓度按铁含量记为0.I?I Omg/mL ；再加入EDC/NHS，其中Fe: EDC: NHS质量比为1: 0.I?10:0.I?1，混合溶液放入空气浴恒温摇床中控制温度为O?50 °C、转速为50?220rpm，反应1min?Ih，磁分离，得到活化后的超顺磁氧化铁纳米颗粒聚集体;按照单克隆捕获抗体与活化后的超顺磁氧化铁纳米颗粒聚集体质量比0.01?0.500:1，将单克隆捕获抗体与活化后的超顺磁氧化铁纳米颗粒聚集体混合加入偶联缓冲液中，并将其置于空气浴恒温摇床中控制温度为O?50°C、转速为50?220rpm，反应30min?2h后，加入BSA，使混有单克隆捕获抗体与活化后的超顺磁氧化铁纳米颗粒聚集体的偶联缓冲液中BSA质量浓度为0.1?1%，继续在空气浴摇床中反应I?2h，然后磁分离，再用清洗缓冲液清洗三次，重悬液重悬至Fe含量为I?4mg/mL，制得免疫探针； (3)将样品垫、结合垫浸泡在处理液中，0.5?2min后取出，然后在15?70°C烘箱中干燥待用;将步骤(2)制得的免疫探针以2?lOyL/cm的量，喷洒在结合垫上、干燥，制得固定有探针的结合垫以及经过处理的样品垫； (4)将硝酸纤维膜放置在湿度为25?65%的密闭箱中平衡lh，将单克隆检测抗体用pH为6.5?7.5的Tris-盐酸缓冲液稀释至0.2?2mg/mL，羊抗鼠IgG抗体用缓冲液稀释至0.1?lmg/mL，将上述两种抗体在硝酸纤维膜上划线，划线量为0.2?2yL/cm，划线结束后，干燥备用； (5)在带有粘性的PVC底板中部粘贴步骤(4)制备的硝酸纤维膜，所述硝酸纤维膜一端粘贴吸水纸，二者重叠宽度为0.5?2cm;所述硝酸纤维膜另一端接结合垫，二者相互交错，重叠宽度为0.5?4cm;样品垫覆盖在结合垫上，将底板固定，最后裁切成免疫层析试纸条； 所述方法步骤(2)中，所述偶联缓冲液为缓冲基液，所述缓冲基液为浓度为0.002?0.2M、pH=6.0?9.0的碳酸缓冲液、磷酸缓冲液、硼酸缓冲液中的一种;所述清洗缓冲液为缓冲基液中加入占缓冲基液总质量0.05?0.lwt%的吐温-20;所述重悬液为缓冲液基液中加入占缓冲基液总质量0.05?0.1wt %的吐温-20、I?5wt%的鹿糖以及0.1?Iwt %的海藻糖。7.根据权利要求6所述的一种基于超顺磁氧化铁纳米颗粒聚集体联合普鲁士蓝染色的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述方法步骤(3)中，所述样品垫和结合垫为亲水或者疏水的玻璃纤维或聚酯纤维;所述处理液为缓冲液与效应物的混合溶液，所述缓冲液为pH=4?9、浓度为0.002?0.2M的碳酸缓冲液、磷酸缓冲液、硼酸缓冲液中的一种，所述效应物为占处理液总质量0.01?Iwt %的分子量为400?20000的PEG、0.01?Iwt %的叠氮钠、0.05?5wt%的酪蛋白、0.05?5wt%的胎牛血清蛋白、0.01?lwt%*子量为1K?30K的聚乙稀卩比略烧酮、0.01?Iwt%的吐温-20或Triton X_100、0.01?]^1:%的鹿糖或海藻糖中的其中任意一种或者任意几种。8.根据权利要求6所述的一种基于超顺磁氧化铁纳米颗粒聚集体联合普鲁士蓝染色的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述方法步骤(4)中，所述硝酸纤维膜为跑水速度为75s、90s、135s或180s的硝酸纤维膜;所述用于稀释羊抗鼠IgG抗体的缓冲液为pH=4?9、浓度为0.005?0.5M的磷酸盐缓冲液，pH=6?9、浓度为0.I?3M三羟基甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，PH=6?9、浓度为0.02?2M的硼酸盐缓冲液中的任意一种。9.根据权利要求6所述的一种基于超顺磁氧化铁纳米颗粒聚集体联合普鲁士蓝染色的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述方法中，将待测样品加入样品垫15?20min后，将普鲁士蓝染液加入到所述质控线C线、检测线T线上，用仪器读取结果。10.根据权利要求6所述的一种基于超顺磁氧化铁纳米颗粒聚集体联合普鲁士蓝染色的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述单克隆捕获抗体为抗hCG单克隆捕获抗体和心肌肌钙蛋白I捕获抗体;所述单克隆检测抗体为抗hCG单克隆检测抗体和心肌肌钙蛋白I检测抗体。
【文档编号】G01N33/577GK105866417SQ201610355291
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年5月24日
【发明人】张宇, 陈艳华, 娄豆豆, 蔡奕康, 韩国志, 王建国
【申请人】南京东纳生物科技有限公司