一种单组份tmb显色液及其制备方法
【专利摘要】本发明公开一种单组份TMB显色液，所述单组份TMB显色液包含TMB和L?甲硫氨酸。本发明所述单组份TMB显色液添加了L?甲硫氨酸作为抗氧化剂，可防止TMB的氧化，使本发明中的TMB能稳定保存24个月，同时，在终止反应后能稳定放置3小时以上，与现有TMB需在终止反应后30min内读数更加方便，更具灵活性。同时，本发明还公开了所述单组份TMB显色液的制备方法。
【专利说明】
一种单组份TMB显色液及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种生物体外诊断试剂及其制备方法，尤其是一种TMB显色液及其制 备方法。
【背景技术】
[0002] TMB(3,3'，5,5'_四甲基联苯胺）是一种新型安全的色原试剂，作为过氧化物酶的 新底物，在酶联免疫吸附检测(ELISA)中获得了广泛应用。底物产生一种可溶性淡蓝色的末 端产物，可在370或630nm在分光光度计上读取。其适用于酶联免疫反应中的显色阶段的定 量和定性分析。其检验的原理是：当标记在抗体或抗原上的酶与显色液中的TMB、双氧水等 反应，加入终止液后溶液由无色变成黄色，黄色深浅反应ELISA体系中抗原抗体结合的多 少，从而判断某种抗原或抗体的多少。在通过酶标仪测度吸光值，判断免疫反应的程度。
[0003] 现有市售的酶联免疫试剂盒所采用TMB显色剂液分为两种，一种为双组份，分A液 和B液，使用之前需要先混匀，由于在使用上易造成操作不方便，且混合后保存时间短等缺 点，逐渐被第二种取代;第二种即为单组份TMB，操作方便，但目前市面上所使用的单组份 TMB稳定性差，保存时间短，大部分的保存时间在3-6个月，且显色背景高，均一性不好。TMB 为脂溶性化合物，难溶于水，且容易在空气环境中被氧化。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种TMB溶解度高、TMB溶 液稳定性强、反应终止后结果能稳定保存一段时间、读数更加方便的单组份TMB显色液；同 时，本发明还提供了所述单组份TMB显色液的制备方法。
[0005] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案为:一种单组份TMB显色液，包含TMB，所 述TMB显色液还包含L-甲硫氨酸。
[0006] TMB在显色反应中为供氢体，反应中除了在相关酶的催化下进行显色反应，容易被 空气或溶液中存在的O2IPOiT氧化。本申请发明人在此基础上选择使用抗氧化剂阻止TMB的 非酶氧化，在众多的抗氧化剂中，经过大量研究及试验发现，当选择L-甲硫氨酸作为TMB的 抗氧化剂，不仅能够防止TMB被O 2IPOiT氧化，而且能够提高TMB溶液的稳定性及检测的灵敏 度。
[0007] 作为本发明所述单组份TMB显色液的优选实施方式，所述L-甲硫氨酸在TMB显色液 中的质量浓度为0.02~lg/L。作为本发明所述单组份TMB显色液的更优选实施方式，所述L-甲硫氨酸在TMB显色液中的质量浓度为0.1~0.3g/L。
[0008] 作为本发明所述单组份TMB显色液的优选实施方式，所述单组份TMB显色液还包含 吐温80和羟丙基-β-环糊精。
[0009] 本发明的单组份TMB显色液，通过引入吐温-80和羟丙基-β-环糊精助溶TMB，使本 发明的单组份TMB显色液形成稳定的水溶液体系，同时羟丙基-β-环糊精有1个"内疏水、外 亲水"的特殊立体环状结构，能够对脂溶性的TMB进行包合，从而提高TMB分子的水溶性、稳 定性和抗氧化、抗光解能力，配合其它组分可使本发明在2-8°C下，能保存24个月。同时羟丙 基-β-环糊精作为稳定剂，能使TMB显色液在强酸终止反应后，信号稳定时间更长。
[0010] 作为本发明所述单组份TMB显色液的优选实施方式，所述吐温-80在TMB显色液中 的质量浓度为1~15g/L;所述羟丙基-β-环糊精在TMB显色液中的质量浓度为2~9g/L。作为 本发明所述单组份TMB显色液的更优选实施方式，所述吐温-80在TMB显色液中的质量浓度 为4~10g/L;所述羟丙基-β-环糊精在TMB显色液中的质量浓度为2.5~5g/L。
[0011] 作为本发明所述单组份TMB显色液的优选实施方式，所述单组份TMB显色液还包含 DMS0、磷酸氢二钠、柠檬酸和过氧化氢;所述DMSO在TMB显色液中的体积浓度为5~40ml/L; 所述磷酸氢二钠在TMB显色液中的摩尔浓度为0.05-0. lmol/L;所述柠檬酸在TMB显色液中 的摩尔浓度为0.03-0.05mol/L;所述过氧化氢在TMB显色液中的体积浓度为1-1.25ml/L;所 述TMB在所述TMB显色液中的质量浓度为0.1-lg/L。
[0012] 二甲基亚砜(DMSO)是一种含硫有机化合物，常温下为无色无臭的透明液体，是一 种吸湿性的可燃液体。具有高极性、高沸点、热稳定性好、非质子、与水混溶的特性，能溶于 乙醇、丙醇、苯和氯仿等大多数有机物，被誉为"万能溶剂"。采用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液 作为基础溶液，来溶解各物质成分。TMB在过氧化氢的存在下，被氧化成最终产物。
[0013] 作为本发明所述单组份TMB显色液的更优选实施方式，所述DMSO在TMB显色液中的 体积浓度为I〇~20ml/L;所述TMB在所述TMB显色液中的质量浓度为0.1-0.4g/L。本发明人 经过大量实验研究发现，各物质在此含量范围内，TMB显色液的各项性能达到最优。
[0014] 作为本发明所述单组份TMB显色液的优选实施方式，所述TMB显色液的pH为2.5-4.8。作为本发明所述单组份TMB显色液的更优选实施方式，所述TMB显色液的pH为3.8-4.2。 [0015]同时，本发明还提供一种如上所述单组份TMB显色液的制备方法，所述方法包括以 下步骤：
[0016] (1)配制磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液:称取磷酸氢二钠、柠檬酸溶于去离子水中，用 HCl调节pH至2.5~3.0，即得磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液；
[0017] ⑵称取吐温-80、羟丙基-β-环糊精和L-甲硫氨酸，边搅拌边将其加入到步骤（1) 所得的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，将其溶解直到溶液不再含有微小颗粒；
[0018] (3)称取TMB，加入DMSO，使之充分溶解；
[0019] ⑷将步骤⑶所得的溶液加入步骤⑵所得的溶液中，充分搅拌，直到溶液不再含 有微小颗粒；
[0020] (5)在步骤(4)所得溶液的上液中加入过氧化氢，边加入边搅拌，使之充分溶解；
[0021] (6)用稀盐酸调节pH至2 · 0-4 · 8，加纯水定容；
[0022] (7)过滤获得均一的溶液，即为单组份TMB显色液。
[0023]作为本发明所述单组份TMB显色液的制备方法的优选实施方式，所述步骤(6)中用 稀盐酸调节pH至3.8~4.2，然后再加纯水定容。
[0024] 本发明所述单组份TMB显色液，通过抗氧化剂L-甲硫氨酸的使用，可防止TMB的氧 化，使本发明中的TMB能稳定保存24个月，同时，在终止反应后能稳定放置3小时以上，与现 有TMB需在终止反应后30min内读数更加方便，更具灵活性。本发明所述单组份TMB显色液的 制备方法，操作方便，能够快速高效制备得到本发明的单组份TMB显色液。
【具体实施方式】
[0025] 为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明 作进一步说明。
[0026] 实施例1
[0027] 本发明单组份TMB显色液的一种实施例，本实施例所述单组份TMB显色液包含以下 成分:TMB、吐温80、羟丙基-β-环糊精、L-甲硫氨酸、DMSO、磷酸氢二钠、柠檬酸、过氧化氢;其 中，所述TMB在所述单组份TMB显色液中的质量浓度为0. lg/L，所述吐温80在所述单组份TMB 显色液中的质量浓度为4g/L，所述羟丙基-β-环糊精在所述单组份TMB显色液中的质量浓度 为2.5g/L，所述L-甲硫氨酸在所述单组份TMB显色液中的质量浓度为0.3g/L，所述DMSO在所 述单组份TMB显色液中的体积浓度为20ml/L，所述磷酸氢二钠在所述单组份TMB显色液中的 摩尔浓度为〇.lmol/L，所述柠檬酸在所述单组份TMB显色液中的摩尔浓度为0.05mol/L，所 述过氧化氢在所述单组份TMB显色液中的体积浓度为lml/L。
[0028] 本实施例所述单组份TMB显色液采用以下方法制备而成：
[0029] (1)配制磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液:将称量好的磷酸氢二钠、柠檬酸溶于去离子 水中，用HCl调节pH至2.5~3.0，即得磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液；
[0030] (2)将称量好的吐温-80、羟丙基-β-环糊精和L-甲硫氨酸，边搅拌边将其加入到步 骤(1)所得的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，将其溶解直到溶液不再含有微小颗粒；
[0031] (3)将称量好的ΤΜΒ，加入到量取好的DMSO中，使之充分溶解；
[0032] (4)将步骤(3)所得的溶液加入步骤(2)所得的溶液中，充分搅拌，直到溶液不再含 有微小颗粒；
[0033] (5)在步骤(4)所得溶液的上液中加入量取好的过氧化氢，边加入边搅拌，使之充 分溶解；
[0034] (6)用稀盐酸调节pH至2.0-4.8，加纯水定容至1000 ml;
[0035] (7)过滤获得均一的溶液，即为本实施例所述一种单组份TMB显色液。
[0036] 实施例2
[0037] 本发明单组份TMB显色液的一种实施例，本实施例所述单组份TMB显色液包含以下 成分:TMB、吐温80、羟丙基-β-环糊精、L-甲硫氨酸、DMSO、磷酸氢二钠、柠檬酸、过氧化氢;其 中，所述TMB在所述单组份TMB显色液中的质量浓度为0.2g/L，所述吐温80在所述单组份TMB 显色液中的质量浓度为6g/L，所述羟丙基-β-环糊精在所述单组份TMB显色液中的质量浓度 为4g/L，所述L-甲硫氨酸在所述单组份TMB显色液中的质量浓度为0.2g/L，所述DMSO在所述 单组份TMB显色液中的体积浓度为15ml/L，所述磷酸氢二钠在所述单组份TMB显色液中的摩 尔浓度为〇.〇8mol/L，所述柠檬酸在所述单组份TMB显色液中的摩尔浓度为0.04mol/L，所述 过氧化氢在所述单组份TMB显色液中的体积浓度为I. lml/L。
[0038]本实施例所述单组份TMB显色液采用如实施例1所述方法制备而成。
[0039] 实施例3
[0040] 本发明单组份TMB显色液的一种实施例，本实施例所述单组份TMB显色液包含以下 成分:TMB、吐温80、羟丙基-β-环糊精、L-甲硫氨酸、DMSO、磷酸氢二钠、柠檬酸、过氧化氢;其 中，所述TMB在所述单组份TMB显色液中的质量浓度为0.4g/L，所述吐温80在所述单组份TMB 显色液中的质量浓度为l〇g/L，所述羟丙基-β-环糊精在所述单组份TMB显色液中的质量浓 度为5g/L，所述L-甲硫氨酸在所述单组份TMB显色液中的质量浓度为0. lg/L，所述DMSO在所 述单组份TMB显色液中的体积浓度为10ml/L，所述磷酸氢二钠在所述单组份TMB显色液中的 摩尔浓度为〇.〇5mol/L，所述柠檬酸在所述单组份TMB显色液中的摩尔浓度为0.03mol/L，所 述过氧化氢在所述单组份TMB显色液中的体积浓度为1.2ml/L。
[0041 ]本实施例所述单组份TMB显色液采用如实施例1所述方法制备而成。
[0042] 实施例4
[0043] 本发明单组份TMB显色液的一种实施例，本实施例所述单组份TMB显色液包含以下 成分:TMB、吐温80、羟丙基-β-环糊精、L-甲硫氨酸、DMSO、磷酸氢二钠、柠檬酸、过氧化氢;其 中，所述TMB在所述单组份TMB显色液中的质量浓度为0.6g/L，所述吐温80在所述单组份TMB 显色液中的质量浓度为lg/L，所述羟丙基-β-环糊精在所述单组份TMB显色液中的质量浓度 为2g/L，所述L-甲硫氨酸在所述单组份TMB显色液中的质量浓度为I g/L，所述DMSO在所述单 组份TMB显色液中的体积浓度为40ml/L，所述磷酸氢二钠在所述单组份TMB显色液中的摩尔 浓度为O.lmol/L，所述柠檬酸在所述单组份TMB显色液中的摩尔浓度为0.03mol/L，所述过 氧化氢在所述单组份TMB显色液中的体积浓度为1.25ml/L。
[0044] 本实施例所述单组份TMB显色液采用如实施例1所述方法制备而成。
[0045] 实施例5
[0046] 本发明单组份TMB显色液的一种实施例，本实施例所述单组份TMB显色液包含以下 成分:TMB、吐温80、羟丙基-β-环糊精、L-甲硫氨酸、DMSO、磷酸氢二钠、柠檬酸、过氧化氢;其 中，所述TMB在所述单组份TMB显色液中的质量浓度为0.8g/L，所述吐温80在所述单组份TMB 显色液中的质量浓度为8g/L，所述羟丙基-β-环糊精在所述单组份TMB显色液中的质量浓度 为6g/L，所述L-甲硫氨酸在所述单组份TMB显色液中的质量浓度为0.5g/L，所述DMSO在所述 单组份TMB显色液中的体积浓度为30ml/L，所述磷酸氢二钠在所述单组份TMB显色液中的摩 尔浓度为〇.〇5mol/L，所述柠檬酸在所述单组份TMB显色液中的摩尔浓度为0.04mol/L，所述 过氧化氢在所述单组份TMB显色液中的体积浓度为1.15ml/L。
[0047] 本实施例所述单组份TMB显色液采用如实施例1所述方法制备而成。
[0048] 实施例6
[0049] 本发明单组份TMB显色液的一种实施例，本实施例所述单组份TMB显色液包含以下 成分:TMB、吐温80、羟丙基-β-环糊精、L-甲硫氨酸、DMSO、磷酸氢二钠、柠檬酸、过氧化氢;其 中，所述TMB在所述单组份TMB显色液中的质量浓度为I g/L，所述吐温80在所述单组份TMB显 色液中的质量浓度为15g/L，所述羟丙基-β-环糊精在所述单组份TMB显色液中的质量浓度 为9g/L，所述L-甲硫氨酸在所述单组份TMB显色液中的质量浓度为0.02g/L，所述DMSO在所 述单组份TMB显色液中的体积浓度为5ml/L，所述磷酸氢二钠在所述单组份TMB显色液中的 摩尔浓度为〇.〇8mol/L，所述柠檬酸在所述单组份TMB显色液中的摩尔浓度为0.05mol/L，所 述过氧化氢在所述单组份TMB显色液中的体积浓度为1.05ml/L。
[0050]本实施例所述单组份TMB显色液采用如实施例1所述方法制备而成。
[0051 ] 实施例7
[0052] 本发明所述单组份TMB显色液和商品化TMB显色液的显色效果对比测试
[0053] 本实施例分别设置对照组1~2、试验组1~6,所述对照组的TMB显色液采用商品化 的TMB显色液，直接购买于市场(对照组1的TMB显色液购买自杭州联科生物技术股份有限公 司，Substrate TMB;对照组2的TMB显色液购买自深圳欣博盛生物科技有限公司，显色底物 (TMB))。所述试验组1~6的TMB显色液分别采用实施例1~6制备而成的TMB显色液。
[0054] 采用如下具体实验方法进行本发明所述TMB显色液和对照组TMB显色液的显色效 果对比测试：
[0055] (1)于空白测试板中加入IOOyL商品化的HRP(用0.OlM PBS稀释成一定的浓度梯 度），同时设置未含HRP的空白对照组；
[0056] (2)各孔分别加入IOOyL对照组1~2、试验组1~6的TMB显色液，室温避光静置 15min；
[0057] (3)各孔加入50yL终止液，轻微平行振荡30秒；
[0058] (4)于450nm波长处读取各孔OD值，结果如表1所示。
[0059] 表1本发明所述TMB显色液和商品化TMB显色液各组的OD值
[0061 ] 从以上结果可以看出，当HRP稀释比例相同时，对照组1~2和试验组1~6中各孔的 OD值相当，由此可以看出，本发明所述的TMB显色液与商品化的TMB显色液的显色效果相当。 [0062] 实施例8
[0063] 本发明TMB显色液的稳定性试验
[0064] 试验设置对照组1~3和试验组1~6,试验组1~6分别采用实施例1~6制备得到的 TMB显色液，对照组1~3的显色液配方分别如下：
[0065]对照组1的TMB显色液除不含L-甲硫氨酸外，其余成分及含量均与本发明相同； [0066]对照组2的TMB显色液除不含吐温80外，其余成分及含量均与本发明相同；
[0067]对照组3的TMB显色液除不含羟丙基-β-环糊精外，其余成分及含量均与本发明相 同。
[0068]对照组1~3的TMB显色液均采用本发明的方法制备而成。
[0069] 分别将对照组1~3和试验组1~6的TMB显色液在常温下放置1个月，然后观察各组 TMB显色液的澄明度和颜色，结果如表2所示。
[0070] 表2各组TMB显色液放置1个月后的澄明度和颜色
[0072]由表2可看出，L-甲硫氨酸的加入可有效防止TMB的非酶氧化，提高TMB溶液的稳定 性。而只含有吐温80和羟丙基-β-环糊精中一种的对照组2和3,放置一个月后会有结晶析 出，即对照组2和3的TMB显色液放置1个月后有TMB析出，而同时含有吐温80和羟丙基-β-环 糊精的试验组和对照组1，放置1个月后液体仍然澄清无结晶，由此可证明，吐温80和羟丙 基-β-环糊精的加入具有相互作用的协同作用，能够显著提高TMB的水溶性。
[0073] 实施例9
[0074] 本发明所述TMB显色液的显色信号稳定性测试。
[0075] 试验设置对照组1~3和试验组1~6，对照组1~3和试验组1~6同实施例8。
[0076]测试方法为：
[0077] (1)于空白测试板中加入IOOyL商品化的HRP(用0.OlM PBS稀释成一定的浓度梯 度），同时设置未含HRP的空白对照组；
[0078] (2)各孔分别加入IOOyL对照组1~2、试验组1~6的TMB显色液，室温避光静置 15min；
[0079] (3)各孔加入50yL终止液终止反应后，于Oh、0.5h、Ih、2h、3h进行0D450检测，各孔 每次的OD值如下表所示。
[0080] 表3各组反应终止后随着放置时间的不同各组OD值的变化情况对比
[0083] 由以上结果可知，对照组1~3的TMB显色液在反应终止后3h内OD值的变化率为 50 %~70 %，试验组1~6的TMB显色液在反应终止后3h内OD值的变化率最大不超过7.50 %， 由此可以得出，本发明所述的单组份TMB显色液可以在反应后稳定保存3h，与现有TMB需要 在反应终止后30min内读数更加方便，更具灵活性。
[0084] 实施例10
[0085]本发明所述TMB显色液的稳定性测试。
[0086] 本试验分为试验组1~6，六组试验组中的TMB显色液分别为实施例1~6中所述的 TMB显色液。试验方法为将实施例1~6中所述的TMB显色液分别放置于2-8°C环境下，保存至 O个月、6个月、12个月、18个月、24个月，然后按照实施例7中所述的方法进行试验。其中空白 对照组为不含HRP的PBS为样本。各组的OD值测试结果表4所示。
[0087] 表4本发明所述TMB显色液的稳定性测试
[0090] 由以上结果可以看出，本发明所述的单组份TMB显色液放置至0个月、6个月、12个 月、18个月、24个月后其数值变化率最大不超过7.0%，表明本发明所述的TMB显色液稳定性 良好，可以在2_8°C下稳定保存24个月。
[0091] 最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保 护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当 理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质 和范围。
【主权项】
1. 一种单组份TMB显色液，包含TMB，其特征在于，所述单组份TMB显色液还包含L-甲硫 氨酸。2. 如权利要求1所述的单组份TMB显色液，其特征在于，所述L-甲硫氨酸在TMB显色液中 的质量浓度为0.02~lg/L。3. 如权利要求2所述的单组份TMB显色液，其特征在于，所述L-甲硫氨酸在TMB显色液中 的质量浓度为0.1~〇.3g/L。4. 如权利要求1~3任一项所述的单组份TMB显色液，其特征在于，所述单组份TMB显色 液还包含吐温80和羟丙基-β-环糊精。5. 如权利要求4所述的单组份TMB显色液，其特征在于，所述吐温-80在TMB显色液中的 质量浓度为1~15g/L;所述羟丙基-β-环糊精在TMB显色液中的质量浓度为2~9g/L。6. 如权利要求5所述的单组份TMB显色液，其特征在于，所述吐温-80在TMB显色液中的 质量浓度为4~10g/L;所述羟丙基-β-环糊精在TMB显色液中的质量浓度为2.5~5g/L。7. 如权利要求1-6任一项所述的单组份TMB显色液，其特征在于，所述TMB显色液还包含 DMS0、磷酸氢二钠、柠檬酸和过氧化氢;所述DMSO在TMB显色液中的体积浓度为5~40ml/L; 所述磷酸氢二钠在TMB显色液中的摩尔浓度为0.05-0. lmol/L;所述柠檬酸在TMB显色液中 的摩尔浓度为0.03-0.05mol/L;所述过氧化氢在TMB显色液中的体积浓度为1-1.25ml/L;所 述TMB在所述TMB显色液中的质量浓度为0.1-lg/L。8. 如权利要求7所述的单组份TMB显色液，其特征在于，所述DMSO在TMB显色液中的体积 浓度为10~20ml/L;所述TMB在所述TMB显色液中的质量浓度为0.1-0.4g/L。9. 如权利要求1~8任一项所述的单组份TMB显色液，其特征在于，所述TMB显色液的pH 为2·5-4·8〇10. -种如权利要求1~9所述单组份TMB显色液的制备方法，其特征在于，所述方法包 括以下步骤： (1) 配制磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液:称取磷酸氢二钠、柠檬酸溶于去离子水中，用HCl 调节pH至2.5~3.0，即得磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液； (2) 称取吐温-80、羟丙基-β-环糊精和L-甲硫氨酸，边搅拌边将其加入到步骤（1)所得 的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，将其溶解直到溶液不再含有微小颗粒； (3) 称取TMB，加入DMSO，使之充分溶解； (4) 将步骤(3)所得的溶液加入步骤(2)所得的溶液中，充分搅拌，直到溶液不再含有微 小颗粒； (5) 在步骤(4)所得溶液的上液中加入过氧化氢，边加入边搅拌，使之充分溶解； (6) 用稀盐酸调节pH至2.0-4.8，加纯水定容； (7) 过滤获得均一的溶液，即为单组份TMB显色液。
【文档编号】G01N33/531GK105891202SQ201610391284
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年6月3日
【发明人】李民友, 张玲, 李妙红, 蓝媛, 齐宗献
【申请人】广州市进德生物科技有限公司