一种动态示踪监测动物体内烟碱及其代谢物的分析方法
【专利摘要】一种动态示踪监测动物体内烟碱及其代谢物的分析方法，其特征在于：使用吡啶环2H标记的烟碱（[2H4]?(±)?Nicotine）与未标记的烟碱等比例混合后暴露动物，利用微透析系统分别收集血、脑透析液样品于微量离心管中，加入分析内标短时低速离心后，直接上样超高效液相色谱?轨道阱高分辨质谱分析检测微透析样品中的烟碱代谢物及其吡啶环2H标记物，根据试验结果鉴定烟碱代谢物并绘制相应的时间?浓度曲线进行动态监测分析。本发明的优点在于：能准确示踪鉴定出动物体内的多种烟碱代谢物，极大地简化了样品前处理步骤，实现了动物体内不同系统中烟碱代谢物变化的准确分析与同步比较，开创了一种新的用于动物体内烟碱代谢研究的方法。
【专利说明】
一种动态示踪监测动物体内烟碱及其代谢物的分析方法
技术领域
[0001] 本发明涉及动物体内烟碱代谢分析的方法。本方法采用稳定同位素示踪烟碱代谢 过程，通过微透析技术同步收集大鼠脑组织和血液样品，利用超高效液相色谱-轨道阱高分 辨率质谱对样品中烟碱代谢物进行示踪检测分析，从而全面地揭示烟碱在动物体内的代谢 特征。
【背景技术】
[0002] 烟碱(Nicotine，Nic)是烟草的重要特征成分，烟碱依赖的发生与个体对烟碱的 代谢能力密切相关。尽管摄入体内的烟碱会迅速透过血脑屏障进入脑组织，但是机体对烟 碱的代谢大部分是在肝脏完成的。烟碱的转化代谢过程主要包括氧化，N-去甲基化，羟基化 以及与葡苷核酸的加合过程，可分为几个阶段:第一阶段，70-80%的烟碱通过C-氧化转化为 可替宁（Cotinine，Cot);第二阶段，一少部分的烟碱和可替宁通过/V-氧化、去甲基化和葡 苷核酸化分别转化为烟碱氮氧化物(nicotine-〗V'_oxide，NN0)，降烟碱(nornicotine， NorNic),烟喊糖苷（nicotine-^V - glucuronide, Nic-Gluc)和可替宁氮氧化物 (cotinine-/V-oxide, CN0),降可替宁（norcotinine, NorCot),可替宁糖苷（cotinine-A^glucuronide, Cot-Glue)。此外，可替宁还可通过羟基化转化为生成反-3'羟基可替宁 Umns-3 '-hydroxycotinine，0H-Cot)，并进一步通过糖苷化作用最终形成少量的反-3 ' 羟基可替宁糖苷（/mns- 3'-hydroxycotinine-〇- glucuronide, OH-Cot-Gluc)。另外，研 究者还证明小部分的烟碱在吸烟者体内还可转化形成为吡啶基羟基酸（4-〇1〇-4-(3-pyridyl)- butanoic acid，0xPyBut)和P比啶基丁酮酸（4_hydroxy-4- (3-pyridyl)-butanoic acid，HyPyBut)。实际上，据报道烟碱在体内可转化为20余种代谢产物，但是绝大 部分的研究将烟碱代谢产物的测定分析限于10种左右或以内，因为同时测定这些较为常见 的代谢产物可以覆盖推算摄入体内90%以上的烟碱。烟碱及其代谢产物尤其是可替宁作为 衡量人体烟气暴露程度和区分吸烟者和非吸烟者的生物标志物，已经受到研究者的广泛关 注。
[0003] 目前关于烟碱代谢研究采用的分析方法有酶联免疫法、气相色谱-质谱(GC-MS) 法、高效液相色谱(HPLC)法、液相色谱-质谱(LC-MS)法、高压放射色谱法等，关于样品的采 集方式有血液、尿液、唾液、脑组织等离体样品和结合微透析技术的活体采样等。然而，这些 研究都存在着一定的不足或局限性。首先是对于烟碱在体内尤其是脑组织内的代谢产物未 能给出明确而完整的信息，使得研究者至今不十分清楚脑内的烟碱代谢产物是否一样多而 复杂 。Paula等[参考文南犬 1 :Paula L. Vieira-Brock, Eleanor I. Miller, Shannon M. Nielsen, et al. Simultaneous quantification of nicotine and metabolites in rat brain by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography B, 2011, 879: 3465-3474.]利用固相萃取/液质联用法建立了同时测定 大鼠脑组织内烟碱代谢物的方法，但仅给出了大鼠脑组织内烟碱、Cot和NorNic的含量信 息;早先的研究利用放射性同位素标记的[ 14C-AHnethyl]烟碱结合高压放射色谱法在小鼠 脑内鉴定出了 [14c]可替宁和[14c]烟碱氮氧化物，但是烟碱的〗V-去甲基化代谢产物（如 NorNic和NorCot)则因为代谢过程中元素放射性的丢失而未检测出；Omar等[参考文献2: Omar A. Ghosheh， Linda. P. Dwoskin, Dennis. K. Miller, Peter. A. Crooks. Metabolites of nicotine in rat brain after peripheral nicotine administration [J]. Drug Metabolism and Disposition，1997，25(1): 47-54.]研究了皮下注射[2， -14C ]烟碱后小鼠脑内的代谢产物，发现大鼠脑内Cot、NorNi c和NorCot的含量在ng/mL级，而 且脑内尚存在其它未能鉴定的代谢物;毛健等人[参考文献3:毛健，卢剑清，徐妍等.微透 析-UPLC-MS/MS法同时测定活体大鼠脑内烟碱及其代谢物[J].烟草科技，2014，（5): 37-41.]最近的研究表明大鼠脑内存在Cot、NorNic、NorCot、NN0和OH-Cot五种代谢物。其次，大 多数的研究仅注重于静态测定单一系统内的烟碱代谢产物，鲜有进行血、脑多系统内的动 态测定及同步比较分析。尽管Chang等人[参考文献3:Yuh_Lih Chang, Pi-Lo Tsai, Yueh-Ching Chou, et al? Simultaneous determination of nicotine and its metabolite, cotinine， in rat blood and brain tissue using microdialysis coupled with liquid chromatography: pharmacokinetic app1ication[J]. Journal of Chromatography A，2005，1088: 152-157.]和公开发明专利（动物血、脑样品中痕量烟 碱及其主要代谢物的同步分析方法.专利申请号201410257438. 8.)报道了利用微透析技 术结合液相色谱或质谱的方法对大鼠血、脑内烟碱进行动态测定和同步分析，但是仅限于 给出烟碱及可替宁的变化特征信息。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是针对目前烟碱代谢研究方法的不足，而专门开发的一种动态示踪 监测动物体内烟碱及其代谢物的分析方法。本方法采用吡啶环 2H标记的烟碱（[2H4]-( ± )-Nicotine)示踪烟碱代谢转化过程，结合高分辨率质谱手段不仅灵敏度高、能获得准确的代 谢物分子质量信息，还可利用吡啶环 2H标记的同位素峰与未标记的烟碱代谢物峰成对出现 的特征进一步确证烟碱在体内尤其是脑组织内的代谢产物信息，克服了放射性同位素标记 法检测时灵敏度不高、放射性信号易丢失等缺点；另外，本方法还利用微透析采样技术，实 现了样品的直接进样分析和对烟碱在活体大鼠血、脑两系统内代谢的同步、动态分析。
[0005] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种动态示踪监测动物体内烟碱及 其代谢物的分析方法，采用烟碱与其吡啶环同位素标记物溶液同时暴露动物，利用微透析 系统同步收集动物血透析液及脑组织透析液样品于不同的微型离心管中，加入分析内标溶 液混匀离心后，采用超高效液相色谱-轨道阱高分辨质谱分析检测微透析样品中的烟碱代 谢物及其吡啶环 2H标记物，根据试验结果鉴定烟碱代谢物并绘制相应的时间-浓度曲线进 行动态监测分析。
[0006] 该方法具体步骤如下： a.烟碱暴露:采用等比例混合的烟碱与吡啶环2H标记的烟碱溶液以外周注射方式暴 露动物。
[0007] b.微透析样品收集：同步且分别收集动物摄入烟碱后的血液微透析样品和脑微 透析样品于不同的微型离心管中（该微型管既能与微透析样品收集系统配套使用又能与色 谱进样瓶配套使用），使得每管中样品为30yL。
[0008] C.分析内标溶液配制：以稳定同位素Nic-d3作为分析内标物，准确称取lOmg置于 100mL容量瓶中，用甲醇/水(体积比50/50，下同）溶液稀释至刻度，摇匀，得浓度为100yg/mL 的内标储存溶液;再采用逐级稀释法配制浓度为20ng/mL的内标工作溶液。
[0009] d.混合标准溶液配制：分别称取附(3、(：(^川(^附(3、顺0、011-(：(^川(^(：〇扒0勵、附(3-Gluc、Cot-Gluc、OH-Cot_Gluc、OxPyBut和HyPyBut各标准品，配制具有浓度梯度的系列混合 标准溶液，并加入内标工作溶液，使内标物的浓度为5ng/mL。具体方式为:准确称取标准品 各l〇mg，分别置于100mL容量瓶中，用甲醇/水溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，得浓度各为100 yg/mL的标准储备溶液;分别移取10.0 mL的标准储备溶液，置于同一支100mL容量瓶中，用甲 醇/水稀释至刻度，摇匀，得一级混合标准溶液;移取l.OmL的一级混合标准溶液，置于另一 100mL容量瓶中，用甲醇/水稀释至刻度，摇匀，得浓度为100ng/mL二级混合标准溶液;准确 移取0 ? 05、0 ? 10、0 ? 50、1 ? 00、5 ? 00、10 ? 0和50 ? OmL二级混合标准溶液，分别置于不同的100mL 容量瓶中，各加入25. OmL内标工作溶液，用滤过的林格氏液稀释至刻度，摇匀，得到浓度均 为0 ? 05、0 ? 10、0 ? 50、1 ? 00、5 ? 00、10 ? 0和50 ? 0ng/mL的系列混合标准溶液。
[0010] e.标准曲线绘制:将系列混合标准溶液按由低到高的浓度顺序进行超高效液相 色谱-轨道阱高分辨率质谱分析，以各目标分析物的色谱峰面积与内标峰面积之比CF)对其 相应的浓度(X)进行线性回归，得到标准曲线回归方程。
[0011] f.样品检测及数据处理:将10此浓度为20ng/mL的内标工作溶液分别加入到血、脑 透析液样品中，混匀后l〇〇〇r/min低速离心10s后上样分析。利用准确分子量[M]峰与同位素 [M+4]峰匹配出现的特征鉴定样品中目标物，根据标准曲线法计算透析液样品中各目标物 的含量，依据结果分别绘制烟碱注射后各时间点血、脑内代谢物的浓度_时间变化曲线，并 进行药代动力学分析，揭示烟碱在大鼠体内的代谢规律。
[0012] 本发明一方面利用吡啶环氘代标记的烟碱暴露动物，能够示踪监测烟碱在动物体内的 代谢变化过程，另一方面还利用轨道阱高分辨率质谱，不仅能准确地测定目标物的分子量 从而实现烟碱代谢物类别的鉴定，同时还具有灵敏度高、定量分析结果准确的特点。利用本 发明的技术方案不仅鉴定出动物脑内存在8种烟碱代谢物，取得了明显进步，还实现了外周 及中枢神经系统内烟碱代谢过程的同步、动态监测，与现有技术相比具有灵敏准确，结果可 靠等特点，开创了一种新的用于动物体内烟碱代谢监测的方法。
[0013]
【附图说明】
[0014] 图1为实施例中的大鼠血、脑内Ni c的浓度随时间变化趋势图。
[0015] 图2为实施例中的大鼠血、脑内Cot的浓度随时间变化趋势图。
[0016] 图3为实施例中的大鼠血、脑内NorNic的浓度随时间变化趋势图。
[0017 ]图4为实施例中的大鼠血、脑内NN0的浓度随时间变化趋势图。
[0018]图5为实施例中的大鼠血、脑内NorCot的浓度随时间变化趋势图。
[0 0 19 ]图6为实施例中的大鼠血、脑内0 H- C 〇 t的浓度随时间变化趋势图。
[0020]图7为实施例中的大鼠血、脑内CN0的浓度随时间变化趋势图。
[0021 ]图8为实施例中的大鼠血液内Nic-Gluc的浓度随时间变化趋势图。
[0022]图9为实施例中的大鼠血液内Cot-Glue的浓度随时间变化趋势图。
[0023]图10为实施例中的大鼠血液内OH-Cot-Gluc的浓度随时间变化趋势图。
[0024]图11为实施例中的大鼠血液内OxPyBut的浓度随时间变化趋势图。
[0025]图12为实施例中的大鼠血液内HyPy But的浓度随时间变化趋势图。
[0026]
【具体实施方式】
[0027]本发明结合以下实施例做进一步描述，但并不限制本发明。
[0028] 实施例1 雄性成年SD正常大鼠，10周龄，体重(200 ± 20)g，采用独立隔离饲养笼具饲养，自由 进水，标准颗粒进食。大鼠以1%戊巴比妥，按50 mg/kg剂量腹腔注射麻醉。借助立体定位仪 定位，于大鼠脑纹状体内埋入探针套管。24 h后，在大鼠清醒自由活动状态下插入微透析探 针（CMA/12)。对于血液微透析样品收集，需将微透析探针（CMA/20)植入大鼠右心房颈静 脉。采用滤过的林格氏液(复方氯化钠注射液）以1.5 iiL/min的速度灌流，平衡120 min后开 始收集样品于微型离心管(既能与微透析样品收集系统配套使用又能与色谱进样瓶配套使 用）中，4°C下每20 min各同步收集1管脑、血透析液。于第4管收集结束时，腹腔注射烟碱及 [%]-烟碱混合溶液(采用林格氏液配制，烟碱及[ 2H4]_烟碱浓度均为0.5mg/mL，注射剂量 均为1 mg/kg)，继续在4°C下按每20 min收集透析液。收集好的每管透析液样品加入lOyL浓 度为20ng/mL的内标工作溶液，1000r/min低速离心10s后直接上样UPLC-Q Exactive检测。 [0029] 色谱条件 色谱柱：Waters Atlantis HILIC Silica (3 X100 mm, i. d. , 3 ym)〇 [0030] 柱温:30 °C;流动相:A:10 mmol/L乙酸铵水溶液(含0.1%甲酸，），B:乙腈(含0.1% 甲酸）;流速:0.6 mL/min;梯度洗脱条件见表1;进样量:10 yL;柱平衡时间为2 min。
[0031]表1梯度洗脱条件
质谱条件 离子源：加热型电喷雾（HESI);离子源温度：300 °C ;正离子模式下电喷雾电压：3.5 kV;鞘气：206.85 kPa;辅助气流速：3.33 L/min;传输毛细管温度：320 °C;扫描模式:FS/ ddMS2(全扫描/数据依赖二级扫描），一级全扫描（分辨率/?=70000,扫描质量范围50~400 m/z)，二级扫描分辨率/?=17500。
[0032] 标准曲线的建立 将系列混合标准溶液按由低到高的浓度顺序进行UPLC-MS/MS分析，以各目标物的色谱 峰面积与分析内标峰面积之比CF)对其相应的浓度(X)进行线性回归，得到标准曲线回归方 程。
[0033]测定结果 采用高分辨率质谱对大鼠透析液样品中烟碱代谢物及其对应的吡啶环2H标记代谢物 进行定性检测，由表2可见依据轨道阱高分辨率质谱提供的精确分子量可对样品中的目标 物进行准确的测定。根据目标物及其吡啶环 2H标记物的配对出峰结果可以看出，大鼠外周 血系统中可检测出全部的11种目标代谢物，而脑组织中除糖苷类代谢物外可鉴定出8种代 谢产物，结果如表3所示。
[0034]表2目标物及其吡啶环2H标记代谢物的质子化离子质量
表3大鼠透析液中烟碱代谢物及吡啶环2H标记代谢物的鉴定结果
注："+"表示两者均可检测到，表示两者均未出现信号响应。
[0035] 将血、脑透析样品测定的目标物峰面积与分析内标峰面积比，与相应的工作曲线回归 方程进行拟合计算测定含量，再通过透析回收率计算出各目标物在大鼠体内的含量，并绘 制浓度随时间的变化趋势曲线，进行药代动力学分析。
【主权项】
1. 一种动态示踪监测动物体内烟碱及其代谢物的分析方法，其特征在于:采用烟碱与 其吡啶环 2H同位素标记物溶液同时暴露动物，利用微透析系统同步收集动物血透析液及脑 组织透析液样品于不同的微型离心管中，加入分析内标后，采用超高效液相色谱-轨道阱高 分辨质谱分析检测样品中的烟碱代谢物及其吡啶环 2H标记物，根据试验结果鉴定烟碱代谢 物并绘制相应的时间-浓度曲线进行动态监测分析;具体包括以下步骤： a. 采用等比例混合的烟碱与吡啶环2H标记的烟碱溶液以外周注射方式暴露动物； b. 同步且分别收集动物摄入烟碱后的血液微透析样品和脑微透析样品于不同的微型 离心管中，该离心管既能与微透析样品收集系统配套使用又能与色谱进样瓶配套使用； c. 分析内标溶液配制：以稳定同位素 Nic-Cl3作为分析内标物，配制浓度为20ng/mL的内 标工作溶液； d ·混合标准溶液配制：分别准确称取附。、(：(^川(^附(3、顺0、0!1-(：〇丨、1*^(：〇丨、0勵、附(3-Gluc、Cot-Gluc、OH-Cot_Gluc、OxPyBut和HyPyBut标准品，配制浓度梯度的系列混合标准溶 液，并各加入内标工作溶液，使内标物的浓度为5ng/mL，混合标准溶液的浓度为0.05、0.10、 0.50、1.00、5.00、10.(^P50.0ng/mL; e. 标准曲线绘制:将系列混合标准溶液按由低到高的浓度顺序进行分析，以各目标分 析物的色谱峰面积与内标峰面积之比CF)对其相应的浓度(X)进行线性回归，得到标准曲线 回归方程； f. 样品检测及数据处理:将步骤b收集的微型离心管置于色谱进样瓶内，加入IOyL浓度 为20ng/mL的混合内标工作溶液，短时低速离心后上样分析;利用准确分子量[M]峰与同位 素[M+4]峰匹配出现的特征鉴定样品中目标物，根据标准曲线法计算透析液样品中各目标 物的含量，依据结果分别绘制血、脑内各代谢物的浓度-时间变化曲线，并进行药代动力学 分析，揭示烟碱在大鼠体内的代谢规律。2. 根据权利要求1所述的一种动态示踪监测动物体内烟碱及其代谢物的分析方法，其 特征在于:色谱条件、质谱条件具体如下： 色谱柱:Waters Atlantis HILIC Silica，规格3 X100 mm, i. d.，3 μπι; 柱温:30 °C;流动相:Α:10 mmol/L乙酸铵水溶液，该水溶液中含0.1%甲酸，Β:含0.1% 甲酸的乙腈;流速:0.6 mL/min;梯度洗脱;进样量:10 yL;柱平衡时间为2 min; 质谱条件 离子源：加热型电喷雾（HESI);离子源温度：300 °C ;正离子模式下电喷雾电压：3.5 1^;鞘气：206.85 1^&;辅助气流速:3.33 171^11;传输毛细管温度:320 °(：;扫描模式:全扫 描/数据依赖二级扫描FS/ddMS2，一级全扫描分辨率治70000，二级扫描分辨率治17500。3. 根据权利要求2所述的一种动态示踪监测动物体内烟碱及其代谢物的分析方法，其 特征在于:梯度洗脱条件见表1; 表1梯度洗脱条件 __ 时间(min) I流动相A(%) I流动相B(%) _0__5__95_ _2__15__85_ _5__25__75_ 5.5__5__95_ 8 I 5 I 95 ο4.根据权利要求1所述的一种动态示踪监测动物体内烟碱及其代谢物的分析方法，其 特征在于:f步骤中的短时低速离心具体为l〇〇〇r/min离心10s。
【文档编号】G01N27/62GK105891357SQ201610203370
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年4月5日
【发明人】毛健, 李鹏, 卢斌斌, 孙世豪, 刘俊辉, 王丁众, 张文娟, 柴国璧, 张启东, 曾世通, 张建勋
【申请人】中国烟草总公司郑州烟草研究院