一种同时测定再造烟叶中8种防腐剂的检测方法
【专利摘要】本发明提供了一种同时测定再造烟叶中8种防腐剂的检测方法，该方法包括：以甲醇?甲酸?水溶液作为萃取液，再造烟叶样品经超声萃取后，提取液经有机滤膜过滤，采用高效液相色谱?串联质谱联用法测定脱氢乙酸、山梨酸、苯甲酸、水杨酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯8种防腐剂。本发明采用同位素稀释内标法定量避免了复杂混合物体系定量分离、纯化的困难；以甲醇?甲酸?水溶液为样品萃取溶剂，在保证提取效率的同时，还能够减小样品中有机杂质进入色谱柱中的量，并有效保护色谱柱；本方法分析速度快，重复性和回收率好，适用于工业中大批量样品的分析。
【专利说明】
一种同时测定再造烟叶中8种防腐剂的检测方法
技术领域
[0001] 本发明属于理化检验技术领域，具体涉及再造烟叶中8种防腐剂含量的测定方法。
【背景技术】
[0002] 近年来，随着食品工业的发展，食品添加剂产业发展迅速，防腐剂因具有杀死某些 微生物或抑制其生长的作用，可以防止食品霉变、腐烂，延长保质期，因此被广泛使用。脱氢 乙酸、山梨酸、苯甲酸、水杨酸、对羟基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯均属于防腐剂，长期过 量摄入会影响人体新陈代谢的平衡，对人体健康造成一定的损害。《GB 2760-2014食品添加 剂使用标准》中对这几种防腐剂在食品中的最大使用量都进行了限定，并出台了相关的检 测标准进行监控。
[0003] 再造烟叶在使用的过程中为了防止霉变，减少损失，也可能在其中加入了上述的 防腐剂，并通过卷烟燃吸过程进入人体，对人体产生危害。但目前以再造烟叶为研究对象的 检测方法未见公开报道，为保证卷烟的吸食安全性，建立再造烟叶中这8种防腐剂的分析方 法意义重大。
【发明内容】
[0004] 本发明弥补了现有分析技术的不足，提供一种再造烟叶中8种防腐剂含量的测定 方法。
[0005] 本发明提供的同时测定再造烟叶中8种防腐剂的检测方法包括：以甲醇-甲酸-水 溶液作为萃取液，再造烟叶样品经超声萃取后，提取液经有机滤膜过滤，采用高效液相色 谱-串联质谱联用法测定脱氢乙酸、山梨酸、苯甲酸、水杨酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯 甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯8种防腐剂。
[0006] 本发明提供的一种再造烟叶中8种防腐剂含量的测定方法的优选技术方案为：
[0007] ①配制甲醇-甲酸-水溶液作为萃取液；
[0008] ②配制内标溶液:称取一定量水杨酸-d4，用甲醇-甲酸-水溶液配制浓度为8-2〇y g/mL的内标溶液；
[0009 ]③配制混合标准溶液:称取一定量脱氢乙酸、山梨酸、苯甲酸、水杨酸、对羟基苯甲 酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯，用甲醇-甲酸-水溶液 配制浓度为〇. 5-1.5yg/mL的混合标准溶液；
[0010] ④样品前处理:称取再造烟叶样品于三角瓶中，依次加入内标溶液和甲醇-甲酸-水溶液，超声萃取，取上层清液经有机滤膜过滤后，供高效液相色谱-串联质谱联用法测定；
[0011] ⑤标准曲线的绘制:取混合标准溶液0.05ml、0. lmL、0.5mL、lmL、2mL、4mL、10mL，各 加入内标溶液30-80yL，用甲醇-甲酸-水溶液定容至50-100mL，摇匀，得7级工作标准溶液； 对上述系列标准溶液进行LC-MS/MS分析，以目标物与内标的峰面积比值对二者相应的浓度 比值进行线性回归分析，求得8种防腐剂的标准曲线；
[0012] ⑥数据处理与检测：由组分峰面积与内标峰面积之比进行内标法定量。
[0013] 本发明提供的一种再造烟叶中8种防腐剂含量的测定方法的更优选技术方案为：
[0014] ①配制甲醇-甲酸-水溶液作为萃取液；
[0015] ②配制内标溶液:称取一定量水杨酸-d4,用甲醇-甲酸-水溶液配制浓度为12. g/mL的内标溶液；
[0016]③配制混合标准溶液:称取一定量脱氢乙酸、山梨酸、苯甲酸、水杨酸、对羟基苯甲 酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯，用甲醇-甲酸-水溶液 配制浓度为1. 〇yg/mL的混合标准溶液；
[0017] ④样品前处理:称取再造烟叶样品于三角瓶中，依次加入内标溶液和甲醇-甲酸-水溶液，超声萃取，取上层清液经有机滤膜过滤后，供高效液相色谱-串联质谱联用法测定；
[0018] ⑤标准曲线的绘制:取混合标准溶液0.05ml、0. lmL、0.5mL、lmL、2mL、4mL、10mL，各 加入内标溶液50yL，用甲醇-甲酸-水溶液定容至50mL，摇匀，得7级工作标准溶液;对上述系 列标准溶液进行LC-MS/MS分析，以目标物与内标的峰面积比值对二者相应的浓度比值进行 线性回归分析，求得8种防腐剂的标准曲线；
[0019] ⑥数据处理与检测：由组分峰面积与内标峰面积之比进行内标法定量。
[0020] 进一步地，所述甲醇-甲酸-水溶液的体积比为50-100:0.1-1.0:10-25，优选80: 0 ? 1:19?9 〇
[0021] 进一步地，在步骤④中，称取的再造烟叶样品量为0.5-5g，优选l.Og。
[0022]进一步地，在步骤④中，内标溶液和甲醇-甲酸-水溶液的加入量分别为30-100此 和 25-100mL;优选 50yL 和 50mL。
[0023] 进一步地，在步骤④中，超声萃取的时间为10-60min，功率为100-500W;优选超声 萃取的时间为30min，功率为300W。
[0024] 进一步地，在步骤④中，有机滤膜为1 ? 2-0 ? 22mi尼龙滤膜;优选0 ? 22mi。
[0025] 更进一步地，在步骤④和⑤中，高效液相色谱条件为:色谱柱为Athena C1-WP色谱 柱（150mm X 4.6mm，粒径5mi);进样量5yL;柱温为40°C ;流速为1. OmL/min，梯度洗脱程序为：
[0027]更进一步地，在步骤④和⑤中，质谱条件为：质谱检测采用ESI离子源，在正、负离 子同时检测方式下，选择MRM工作模式进行二级质谱分析，优化后的主要质谱条件为:雾化 气50psi，辅助加热气50psi，气帘气lOpsi，干燥温度600°C;各化合物的特征离子及参数分 析别为：
[0029] 本发明的有益效果是：
[0030] 本发明使用的仪器和设备均为实验室常规分析设备，发明方法易于推广，检测成 本低；
[0031] 本发明采用同位素稀释内标法定量避免了复杂混合物体系定量分离、纯化的困 难；
[0032] 本发明以甲醇-甲酸-水溶液为样品萃取溶剂，在保证提取效率的同时，还能够减 小样品中有机杂质进入色谱柱中的量，并有效保护色谱柱；
[0033] 本发明首次提出了采用高效液相色谱-串联质谱联用仪测定再造烟叶中8种防腐 剂的分析方法，方法分析速度快，重复性和回收率好，适用于工业中大批量样品的分析。
【附图说明】
[0034] 图1是苯甲酸的提取离子流图；
[0035] 图2是脱氢乙酸的提取离子流图；
[0036] 图3是水杨酸的提取离子流图；
[0037] 图4是对羟基苯甲酸甲酯的提取离子流图；
[0038] 图5是对羟基苯甲酸乙酯的提取离子流图；
[0039] 图6是对羟基苯甲酸丙酯的提取离子流图；
[0040] 图7是对羟基苯甲酸丁酯的提取离子流图；
[0041] 图8是山梨酸的提取离子流图；
[0042] 图9是内标的提取离子流图。
【具体实施方式】
[0043] 为便于更好的理解本发明，本发明结合具体的实施例进一步说明：
[0044] 实施例1
[0045] 仪器与试剂、材料：美国AB SCIEX 5500LC-MS/MS;美国Agilent 1290HPLC;Athena C1-WP色谱柱（150mmX 4.6mm，粒径5wn)，0.22WI1微孔过滤膜，超声清洗器;超纯水（18M Q )， 甲醇(色谱纯，百灵威化学试剂公司）.
[0046] 萃取液的制备:配制甲醇-甲酸-水体的积比为80:0.1:19.9的溶液作为萃取液。
[0047]内标溶液的配制：称取一定量水杨酸_d4,用甲醇-甲酸-水溶液配制浓度为12.5y g/mL的内标溶液；
[0048] 混合标准溶液的配制:称取一定量脱氢乙酸、山梨酸、苯甲酸、水杨酸、对羟基苯甲 酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯，用甲醇-甲酸-水溶液 配制浓度为1. 〇yg/mL的混合标准溶液；
[0049] 样品前处理:称取1.0g(精确至O.lmg)再造烟叶样品于100mL具塞锥形瓶中，准确 加入50mL萃取液和50yL内标溶液，超声萃取30min，静置2min，取适量萃取液经0.22_有机 相滤膜过滤，滤液置于色谱瓶中待测。
[0050]液相色谱分离条件和质谱参数 [0051 ]液相色谱条件
[0052] --色谱柱:Athena C1-WP色谱柱（150mmX4.6mm，粒径5ym);
[0053] --流速：1 .OmL/min;
[0054] --柱温：40°C;
[0055] --进样量：5yL;
[0056] 一一流动相A: 0.1 %甲酸水溶液(体积分数）；流动相B:甲醇；
[0057] 一一梯度洗脱条件如表1所示。
[0058]表1梯度洗脱条件
[0060]质谱条件
[0061 ] --扫描方式:正、负离子扫描；
[0062] 一一离子源：电喷雾电离源(ESI);
[0063] --检测方式:多反应监测(MRM);
[0064] --电喷雾电压：5500V(ESI+)、4500V(ESI-);
[0065] 一一离子源温度：600 r;
[0066] --离子对的驻留监测时间（dwell time) :50ms;
[0067] --气帘气压力：25Psi;
[0068] --雾化气压力：60Psi;
[0069] --辅助气压力：60Psi;
[0070] 一一分析物及内标的定量离子对、定性离子对等质谱参数见表2。
[0071]表2 8种化合物及内标质谱参数表
[0073] 标准曲线的绘制：取混合标准溶液0.05ml、0. lmL、0.5mL、lmL、2mL、4mL、lOmL，各加 入内标溶液50yL，用甲醇-甲酸-水溶液定容至50mL，摇匀，得7级工作标准溶液;对上述系列 标准溶液进行LC-MS/MS分析，以目标物与内标的峰面积比值对二者相应的浓度比值进行线 性回归分析，求得8种防腐剂的标准曲线;8种化合物的线性回归方程、相关系数、检出限和 定量限如表3所示。
[0074] 表3 8种化合物的线性回归方程、相关系数、检出限和定量限
[0076]精密度:为了考察方法的精密度，以某再造烟叶样品进行5次日内重复实验，测定 结果表明8种化合物日内测定结果的相对标准偏差在0.82%~5.23%之间，表明方法的日 内精密度良好。同时，对样品进行了 5天日间重复实验，测定结果表明8种化合物日间测定结 果的相对标准偏差在1.90 %~8.60 %之间，结果表明该方法的日间重复性良好。
[0077] 回收率:采用样品加标法对再造烟叶样品在高、中、低三个含量水平上进行了回收 率的测定，结果表明，8种化合物的平均回收率的结果在89.1 %-103.8 %之间，回收率较高， 满足分析要求。
[0078] 实际样品的测定:采用本发明建立的方法测定了 6个再造烟叶样品中的8种防腐剂 (表4)。结果表明，6个样品中均检出脱氢乙酸、山梨酸、水杨酸、苯甲酸和对羟基苯甲酸乙 酯，2个样品检出对羟基苯甲酸甲酯，2个样品检出对羟基苯甲酸丙酯，含量范围为0.05_ 18?15mg/kg〇
[0079] 表4再造烟叶样品的检测结果(mg/kg)
【主权项】
1. 一种同时测定再造烟叶中8种防腐剂的检测方法，其特征在于： 以甲醇-甲酸-水溶液作为萃取液，再造烟叶样品经超声萃取后，提取液经有机滤膜过 滤，采用高效液相色谱-串联质谱联用法测定脱氢乙酸、山梨酸、苯甲酸、水杨酸、对羟基苯 甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯8种防腐剂。2. 根据权利要求1所述的再造烟叶中8种防腐剂的检测方法，其特征在于该方法包括以 下步骤： ① 配制甲醇-甲酸-水溶液作为萃取液； ② 配制内标溶液:称取一定量水杨酸_d4，用甲醇-甲酸-水溶液配制浓度为8-20yg/mL的 内标溶液； ③ 配制混合标准溶液:称取一定量脱氢乙酸、山梨酸、苯甲酸、水杨酸、对羟基苯甲酸甲 酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯，用甲醇-甲酸-水溶液配制 浓度为〇. 5-1.5yg/mL的混合标准溶液； ④ 样品前处理:称取再造烟叶样品于三角瓶中，依次加入内标溶液和甲醇-甲酸-水溶 液，超声萃取，取上层清液经有机滤膜过滤后，供高效液相色谱-串联质谱联用法测定； ⑤ 标准曲线的绘制：取混合标准溶液0.05ml、O. ImL、0.5mL、ImL、2mL、4mL、IOmL，各加入 内标溶液30_80yL，用甲醇-甲酸-水溶液定容至50-100mL，摇匀，得7级工作标准溶液;对上 述系列标准溶液进行LC-MS/MS分析，以目标物与内标的峰面积比值对二者相应的浓度比值 进行线性回归分析，求得8种防腐剂的标准曲线； ⑥ 数据处理与检测：由组分峰面积与内标峰面积之比进行内标法定量。3. 根据权利要求2所述的再造烟叶中8种防腐剂的检测方法，其特征在于该方法包括以 下步骤： ① 配制甲醇-甲酸-水溶液作为萃取液； ② 配制内标溶液:称取一定量水杨酸_d4，用萃取液配制浓度为12.5yg/mL的内标溶液； ③ 配制混合标准溶液:称取一定量脱氢乙酸、山梨酸、苯甲酸、水杨酸、对羟基苯甲酸甲 酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯，用萃取液配制浓度为1.〇μ g/mL的混合标准溶液； ④ 样品前处理:称取再造烟叶样品于三角瓶中，依次加入内标溶液和萃取液溶液，超声 萃取，取上层清液经有机滤膜过滤后，供高效液相色谱-串联质谱联用法测定； ⑤ 标准曲线的绘制：取混合标准溶液0.05ml、0.1 mL、0.5mL、ImL、2mL、4mL、IOmL，各加入 内标溶液50yL，用萃取液定容至50mL，摇匀，得7级工作标准溶液;对上述系列标准溶液进行 LC-MS/MS分析，以目标物与内标的峰面积比值对二者相应的浓度比值进行线性回归分析， 求得8种防腐剂的标准曲线； ⑥ 数据处理与检测：由组分峰面积与内标峰面积之比进行内标法定量。4. 根据权利要求3所述的再造烟叶中8种防腐剂的检测方法，其特征在于所述甲醇-甲 酸-水溶液的体积比为50-100:0.1-1.0:10-25。5. 根据权利要求4所述的再造烟叶中8种防腐剂的检测方法，其特征在于所述甲醇-甲 酸-水溶液的体积比为80:0.1:19.9。6. 根据权利要求3所述的再造烟叶中8种防腐剂的检测方法，其特征在于:在步骤④中， 称取的再造烟叶样品量为〇.5-5g。7. 根据权利要求6所述的再造烟叶中8种防腐剂的检测方法，其特征在于:在步骤④中， 称取的再造烟叶样品量为l.Og。8. 根据权利要求3所述的再造烟叶中8种防腐剂的检测方法，其特征在于:在步骤④中， 内标溶液和甲醇-甲酸-水溶液的加入量分别为30-100yL和25-100mL。9. 根据权利要求8所述的再造烟叶中8种防腐剂的检测方法，其特征在于:在步骤④中， 内标溶液和萃取液的加入量分别为50yL和50mL。10. 根据权利要求3所述的再造烟叶中8种防腐剂的检测方法，其特征在于：在步骤④ 中，超声萃取的时间为10-60min，功率为100-500W。11. 根据权利要求10所述的再造烟叶中8种防腐剂的检测方法，其特征在于:超声萃取 的时间为30min，功率为300W。12. 根据权利要求3所述的再造烟叶中8种防腐剂的检测方法，其特征在于：在步骤④ 中，有机滤膜为1.2-0.22μπι尼龙滤膜。13. 根据权利要求12所述的再造烟叶中8种防腐剂的检测方法，其特征在于:在步骤④ 中，有机滤膜为〇. 22μπι尼龙滤膜。14. 根据权利要求1-13中任一所述的再造烟叶中8种防腐剂的检测方法，其特征在于： 高效液相色谱条件为:色谱柱为Athena Cl-WP色谱柱，柱参数为150mmX 4.6_ X 5μπι;进样 量5yL;柱温为40°C ;流速为1.0 mL/min，梯度洗脱程序为：15. 根据权利要求14所述的再造烟叶中8种防腐剂的检测方法，其特征在于：质谱条件 为:质谱检测采用ESI离子源，在正、负离子同时检测方式下，选择MRM工作模式进行二级质 谱分析，优化后的主要质谱条件为:雾化气50psi，辅助加热气50psi，气帘气lOpsi，干燥温 度600°C ;各化合物的特征离子及参数分析别为：16.根据权利要求2所述的再造烟叶中8种防腐剂的检测方法，其特征在于该方法包括 以下步骤： ① 配制甲醇-甲酸-水溶液作为萃取液； ② 配制内标溶液:称取一定量水杨酸_d4，用萃取液配制浓度为12.5yg/mL的内标溶液； ③ 配制混合标准溶液:称取一定量脱氢乙酸、山梨酸、苯甲酸、水杨酸、对羟基苯甲酸甲 酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯，用萃取液配制浓度为1.〇μ g/mL的混合标准溶液； ④ 样品前处理:称取再造烟叶样品于三角瓶中，依次加入内标溶液和萃取液溶液，超声 萃取，取上层清液经有机滤膜过滤后，供高效液相色谱-串联质谱联用法测定； ⑤ 标准曲线的绘制：取混合标准溶液0.05ml、O. ImL、0.5mL、ImL、2mL、4mL、IOmL，各加入 内标溶液50yL，用萃取液定容至50mL，摇匀，得7级工作标准溶液;对上述系列标准溶液进行 LC-MS/MS分析，以目标物与内标的峰面积比值对二者相应的浓度比值进行线性回归分析， 求得8种防腐剂的标准曲线； ⑥ 数据处理与检测：由组分峰面积与内标峰面积之比进行内标法定量； 在步骤④中，称取的再造烟叶样品量为I.Og;所述甲醇-甲酸-水溶液的体积比为80: 0.1:19.9;内标溶液和甲醇-甲酸-水溶液的加入量分别为50yL和50mL;超声萃取的时间为 30min，功率为300W;有机滤膜为0.22μπι尼龙滤膜； 所述高效液相色谱条件为:色谱柱为Athena Cl-WP色谱柱，柱参数为150_X 4.6_ X 5 μπι;进样量5yL;柱温为40°C ;流速为1.0 mL/min，梯度洗脱程序为： 所述质谱条件为：质谱检测采用ESI离子源，在正、负离子同时检测方式下，选择MRM工
【文档编号】G01N30/02GK105891374SQ201610410467
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年6月13日
【发明人】范忠, 刘鸿, 李小兰, 陈志燕, 周芸, 潘玉灵, 曾德芬, 唐桂芳, 韦入丹, 陈瑶, 王清波
【申请人】广西中烟工业有限责任公司