用于检测d-二聚体(dd)的胶体金免疫比色法试剂盒及其制备方法
【专利摘要】一种检测D-二聚体(DD)的胶体金免疫比色法试剂盒及其制备方法，本发明属于体外诊断试剂领域，用于判断个体急性肾损伤的情况是否出现。本方法是以胶体金颗粒为载体，将D-二聚体(以下均简称为DD)抗体与胶体金颗粒进行偶联，在相应的检测装置内，使样品中的DD蛋白与偶联后的金颗粒接触，形成抗原-抗体-金复合物，造成金颗粒在检测波长下吸光度的改变，并且吸光度的改变量与DD蛋白浓度程正相关，进而达到检测样本中DD蛋白的目的。本试剂盒并且具备较高的分析灵敏度。
【专利说明】用于检测D-二聚体（DD)的胶体金免疫比色法试剂盒及其 制备方法 发明领域
[0001] 本发明属于体外诊断试剂领域，具体涉及用于检测D-二聚体（DD)的胶体金免疫 比色法试剂盒 技术背景
[0002] 纤维蛋白溶解系统（fibrinolysis system)是人体最重要的抗凝系统，由4种 主要部分组成：纤溶酶原（plasmingen)、纤溶酶原激活剂（plasmingen activator，如 t_PA，u_PA)、纤溶酶（plasmin)、纤溶酶抑制物（plasmin activator inhibitor，PAI-1， antiplasmin)。当纤维蛋白凝结块（fibrin clot)形成时，在tPA的存在下，纤溶酶原激活 转化为纤溶酶，纤维蛋白溶解过程开始，纤溶酶降解纤维蛋白凝结块形成各种可溶片段，形 成纤维蛋白产物（FDP)，FDP由下列物质：X-寡聚体（X-oligomer)、D-二聚体（D-Dimer)、 中间片段（Intermediate fragments)、片段E (Fragment E)组成。其中，X-寡聚体和D-聚 体均含D-二聚体单位。
[0003] 人体纤溶系统，它对保持血管壁的正常通透性，维持血液的流动状态和组织修复 起着重要作用。D-二聚体血浆中水平增高说明存在继发性纤溶过程，而先生成凝血酶，后又 有纤溶系统活化；并且也反映在血栓形成的局部纤溶酶活性或浓度超过血浆2%。-抗纤溶 酶活性或浓度。溶栓治疗是指用药物来活化纤维蛋白溶解系统。一般为投入一种纤溶酶原 活化物如尿液酶、链激酶或组织型纤溶酶原活化物（tpA)，使大量纤溶酶生成，从而加速已 形成血栓的溶解。FDP或D-二聚体生成，则表明达到溶栓效果。
[0004] 纤溶蛋白降解产物中，唯D-二聚体交联碎片可反映血栓形成后的溶栓活性。因 此，理论上，D-二聚体的定量检测可定量反映药物的溶栓效果、及可用于诊断、筛选新形成 的血栓。
[0005] 不仅如此，大量的临床实践证明，作为继发性纤溶亢进的标志性物质，D-二聚体在 弥漫性血管内凝血（DIC)的诊断和病程监测上具有良好的应用价值。DIC是一种复杂的病 理生理过程和严重的获得性、全身性血栓-出血综合征。其特点是体内凝血和抗凝机制失 衡导致弥漫性小血管内血栓形成和继发性纤溶亢进。在DIC形成早期即有D-二聚体升高， 比FDP更灵敏，而且随病程的发展，D- -二聚体可持续升高达10倍以上。因此，D-二聚体 可作为DIC早期诊断和病程监测的主要指标。
[0006] 此外在心脑血管疾病（如心肌梗塞、心绞痛、高血压、冠心病、脑梗塞、脑出血等）， 恶性肿瘤，手术或创伤后，妊高症、先兆子痫，严重感染，肝脏疾病，肾脏疾病，口服避孕药， 绝经后激素替代治疗等许多疾病的发生和发展过程中，也都有可能引起D-二聚体的升高， 结合临床表现和其他检查，选择恰当时机动态监测D-二聚体的变化，可为临床预防血栓形 成，病情转归评估等提供有价值的信息。
【发明内容】
[0007] 本发明所要解决的问题是进一步提高检测人体液样本中DD蛋白含量的分析灵敏 度，提供一种特异性好，灵敏度高的分析DD蛋白的胶体金匀相免疫比色试剂盒，可以用于 精确测定体液样本中0_30ng/L的DD蛋白含量。另外本发明还在于提供一种关于DD蛋白 检测试剂盒的制备方法。
[0008] 为了解决上述问题，本发明采用胶体金匀相免疫反应法，检测体液样本中的DD蛋 白含量。标记DD抗体的胶体金颗粒在540nm处有最大吸收峰，当环境中存在DD蛋白时，会 形成抗原-抗体-金复合物，而此时540nm处的最大吸收峰将随着样本浓度的升高而减弱， 且660nm处的最大吸收峰将随之增加。通过检测并计算540nm吸光度的减少和660nm吸光 度的增加，与已知浓度的样本相联系，进而形成校准曲线，从而即可达到定量测量体液样本 中DD蛋白的含量。
[0009] 本发明提供以下技术方案：
[0010] 一种关于DD检测胶体金匀相免疫检测试剂盒，其主要的目的是用于检测人个体 体液样本中DD蛋白的含量，本发明试剂盒中主要由用于形成校准曲线的已知DD蛋白的校 准品（DD校准品），反应缓冲液试剂（试剂1)，胶体金标记物试剂（试剂2)三部分组成。其 中DD校准品是由校准品稀释液和DD蛋白按照一定比例配制成不同浓度梯度，其浓度范围 为0ng/L-30ng/L，反应缓冲液试剂是由磷酸盐和牛血清白蛋白配制而成的能够提供本发明 所需要的免疫学反应的且具有pH缓冲能力的溶液，胶体金标记物试剂是由金标记的抗人 源DD蛋白的抗体和悬浮标记物的缓冲液组成。
[0011] 首先，根据试剂盒检测需要制备主吸收峰为450nm± 10nm的胶体金颗粒。
[0012] 其次配制试剂1，其主要组成应为50mM PBS pH8. 0溶液，其中溶解有 PEG6000-20000,聚蔗糖400和牛血清白蛋白等多聚物或生物大分子中的一种物质或两种 及其以上，并且控制pH值应在7. 0-9. 0之间。
[0013] 第三，配制试剂2为，其主要组成应为50mM PBS pH8. 0溶液，其中溶解有 PEG6000-20000,聚蔗糖400,吐温20,牛血清白蛋白和Triton X-100等多聚物或生物大分 子中的一种物质或两种及其以上，并且控制pH值应在7. 0-9. 0之间。将标记DD抗体后的金 颗粒浓缩，并用此步骤配制的溶液复悬。用去离子水或超纯水稀释复悬后胶体金标记物试 剂（试剂2) 50倍后，并以去离子水或超纯水做空白，在540nm± 10nm处的检测吸光度，若吸 光度在0. 2000Abs-0. 3000Abs的范围内，则认为试剂2中标记DD抗体的金颗粒浓度合格， 若不符合上述要求，则进一步调整试剂2中金颗粒浓度，直至符合要求。
[0014] 最终使用时，将DD校准品（或样本），试剂1和试剂2按照一定的比例和次序混 合，检测吸光度的变化，即可反应出样本中待检测的DD含量。
[0015] 使用本发明方法，具有高灵敏度特性，可以分析DD含量在30ng/L以下的样本。本 发明可以同时用于检测不同基质的体液样本，如血清，血浆，尿液中DD蛋白的含量，不需要 对样本或试剂做其它技术处理，包括增加或减少测试样本量，增大或降低试剂1和试剂2的 比例，具备高灵敏度，高特异性，高准确度和良好的重复性等优点，适合于全自动生化仪，半 自动生化仪和紫外-可见光分光光度计使用。
[0016] 本发明主要目的在于提高对于人体液样本中DD蛋白含量检测的特异性和分析灵 敏度，在本发明中通过控制标记物的反应条件和金颗粒的大小，以及合适的测量条件，从而 达到上述目的。
[0017] 具体而言，本发明可以提供一种高分析灵敏度的DD检测试剂盒，其主要特性在于 在0ng/L-5ng/L的范围内具备高分析灵敏度，在0ng/L-30ng/L的范围内具备较好的线性， 对于临床诊断而言具有较好的指导意义。其中试剂盒内包含的试剂1、试剂2和校准品，以 体积计算，校准品用量（或待测样本用量）为2uL-10uL，试剂1用量为200uL-250uL，试剂 2 用量为 50uL-100uL。
[0018] 本发明中所述的金颗粒大小应以最大吸收峰和吸收峰峰宽控制，通过调整氯金酸 与还原剂的比例，使制的胶体金颗粒的最大吸收峰在540nm±20nm范围内，优化条件使得 颗粒大小进一步得到控制，制的的胶体金颗粒的最大吸收峰在540nm± 10nm范围内，进一 步对实验条件优化，制的胶体金颗粒的最大吸收峰在540nm±5nm的范围内，此时胶体金颗 粒大小最为合适。
[0019] 本发明中所阐述的胶体金匀相试剂1和试剂2中，其缓冲液选用PBS缓冲液，pH 值控制在7. 0-9. 0间，进一步通过实验优化缓冲条件，pH值控制在7. 5-8. 5间，DD蛋白 与标记的抗体反应较为合适，再进一步优化实验条件发现，pH控制在8. 0±0. 2时，DD蛋 白与标记的抗体反应最为合适。并且在试剂1中所述的多聚物和生物大分子主要包括 PEG6000-20000,聚蔗糖400和牛血清白蛋白，并在其中加入含量约为0. 1% (质量体积比） 的叠氮钠。试剂2中所述的多聚物和生物大分子PEG6000-20000,聚蔗糖400,吐温20,牛血 清白蛋白和Triton X-100,并在其中加入含量约为0.1% (质量体积比）的叠氮钠。在试 剂2中，标记后的抗体在试剂2中的含量以吸光度的方式进行控制，即将含有标记物的试剂 2用去离子水或超纯水稀释50倍以后，以去离子水或超纯水做空白（参比），检测540nm下 的吸光度应在〇. 20Abs-0. 25Abs范围内。试剂2中DD抗体与胶体金的标记依靠金颗粒表 面带电对DD抗体的吸附而完成。
[0020] 本发明中所叙述的用于检测或监测体液样本中DD蛋白含量的试剂盒，其中包括 DD蛋白校准品和校准品稀释液两部分组成。校准品稀释液由PBS缓冲液、牛血清白蛋白和 叠氮钠组成，其中PBS缓冲液控制pH值在7. 0-9. 0之间，优化后的pH控制在8. 0±0. 5,添 加牛血清白蛋白和叠氮钠的量为0. 1% -0. 5% (质量体积比）。校准品由校准品稀释液稀 释 DD 蛋白纯品制成，含量为 Ong/L，1. 875ng/L，3. 75ng/L，7. 5ng/L，15ng/L，30ng/L。
[0021] 本发明中采用胶体金匀相免疫比色法测定样本中的DD蛋白的含量。标记有颗粒 均一，大小合适金颗粒的DD抗体，与样本中的DD蛋白，在缓冲液中形成DD蛋白-抗体-金 具有三维结构的复合物，从而使原本金颗粒在540nm的吸光度减弱，并且在660nm处的吸光 度加强，通过将这种改变与校准品中已知的DD蛋白浓度相对应，进而形成检测系统的校准 曲线，当未知DD蛋白浓度的体液样本以同样的反应模式与标记物反应时，通过计算上述吸 光度的改变，对应校准曲线从而达到定量测量的目的。
【附图说明】
[0022] 图1本发明试剂与对照试剂线性验证结果，以稀释度为横坐标，以检测结果为纵 坐标作图，本发明试剂具有优于同类检测项目试剂盒线性的特点。
[0023] 图2本发明试剂与对照试剂校准曲线实验结果，样本中DD蛋白含量每变化一个浓 度单位，本发明试剂的吸光度信号变化为对照试剂的约3. 8倍，本发明灵敏度明显优于对 照试剂。
[0024] 图3标记物沉降检测实验结果，本发明试剂标记物在40天内未发生明显沉降。
【具体实施方式】
[0025] 实施例
[0026] 本发明中若不做特殊说明，则表述含量的百分比浓度均表示质量体积比，即 g/100mL
[0027] 实施例1
[0028] DD校准品的制备
[0029] 用重组人DD蛋白（市售）溶于校准品稀释液（牛血清白蛋白0.5%，叠氮钠 0. 1%，PBS缓冲液pH 8.0)制备出不同浓度梯度的校准品，采用九强DD胶乳免疫比色试剂 盒检测配制校准品，每个浓度梯度检测3次，取检测结果的平均值，定值为Ong/L (校准品稀 释液，未添加 DD 蛋白），1. 875ng/L，3. 75ng/L，7. 5ng/L，15ng/L，30ng/L。
[0030] 反应缓冲试剂（试剂1)的制备
[0031] 取 80mL 50mM PBS pH8. 0 的缓冲液中加入 PEG6000-200005g，聚蔗糖-4001g，牛血 清白蛋白〇. 5g，叠氮钠0. lg，最终用相应的缓冲液定容至100mL，并用0. 22um微孔滤膜过 滤，即制成反应缓冲试剂（试剂1)，其中PEG6000-200005 %，聚蔗糖-4001 %，牛血清白蛋白 0. 5%，叠氮钠 0. 1%。
[0032] 胶体金标记物试剂（试剂2)的制备
[0033] 胶体金标记物试剂（试剂2)的制备过程主要分为三部分，即标记物制备，空白缓 冲液的制备，标记物的复悬三个步骤。
[0034] 标记物的制备
[0035] 将市售的氯金酸和柠檬酸三钠溶解，并分别配制成1 %的水溶液，将1L的去离子 水或超纯水煮沸，接着加入10mL的氯金酸溶液保持沸腾约lmin后，加入10mL的柠檬酸三 钠溶液，随着时间的变化溶液再次沸腾，溶液颜色随之由明黄色转变为紫黑色，接着短时间 转为酒红色，之后保持沸腾lOmin后，冷却备用。
[0036] 将制备好的的胶体金溶液用浓度为20 % 1(20)3溶液调整pH值至8. 0后，按比例加 如一定体积的DD抗体（市售），充分搅拌lh，即完成抗体的标记过程。
[0037] 抗体标记完成以后，可用10% NaCl溶液检查标记量是否合适，当按照1 : 10的体 积比例加入NaCl溶液后，当不出现黑色沉淀时的抗体最小用量，为最佳标记量。
[0038] 标记物空白缓冲液的制备
[0039] 取 80mL 50mM PBS pH8. 0 的缓冲液中加入 PEG6000-2000020g，聚蔗糖-400 5g，牛血清白蛋白0. 5g，叠氮钠0. lg，吐温20 lg，Triton X-100 lg，最终用相应的缓 冲液定容至100mL，并用0. 22um微孔滤膜过滤，即制成反应缓冲试剂（试剂1)，其中 PEG6000-2000020 %，聚蔗糖-4005 %，牛血清白蛋白0? 5 %，叠氮钠0? 1 %，吐温20 1 %， Triton X-100 1%〇
[0040] 标记物复悬
[0041] 将标记好的胶体金颗粒在6000rpm下离心40min，收集沉淀，之后用上述标记物空 白缓冲液复悬收集的沉淀，并将浓度按照本发明的权利要求（4)将标记物调整至合适的浓 度即可。
[0042] 线性验证
[0043] 1、取一例具有急性肾损伤表象的临床病人血清样本约2mL，向其中加入人源的DD 蛋白纯品，制得一线性高值样本。
[0044] 2、选用市场上技术较为成熟的DD蛋白胶乳微球比浊法试剂盒做对照试剂，在东 芝120FR全自动生化仪上录入胶乳比浊法对照试剂盒参数，并用其试剂盒配套校准品校准 其试剂，检测上述高值样本三次，已三次检测结果的均值27. 8ng/L为最终定值结果。
[0045] 3、在东芝120FR全自动生化仪上，录入本发明的实验参数，并用已经校正的校准 品经行试剂校准。
[0046] 4、将上述的线性高值样本用生理盐水做倍比稀释，稀释比例为1/2,1/4,1/8， 1/16,1/32,1/64,与原线性高值样本组成一个梯度样本组。
[0047] 5、用上述对照试剂和本发明的试剂分别检测上述样本，每个试剂每个样本检测三 次，以三次结果均值最终的检测结果，然后比较本发明和再对照试剂的线性，结果表1和图 1所示。
[0048] 表1线性验证结果
[0050] 表1为线性实验结果数据统计，在本发明和对照试剂盒的检测范围内，将高值样 本倍比6次稀释，用对照试剂和本发明试剂分别检测
[0051] 分析灵敏度验证
[0052] 1、选用市场上技术较为成熟的DD蛋白胶乳微球比浊法试剂盒做对照试剂，在东 芝120FR全自动生化仪上录入胶乳比浊法对照试剂盒参数，并用其试剂盒配套校准品校准 其试剂。
[0053] 2、在东芝120FR全自动生化仪上，录入本发明的实验参数，并用已经校正的校准 品经行试剂校准。
[0054] 3、比较两个试剂在5ng/L以下浓度的校准点吸光度的变化，结果如表2和图2所 示。注：由于对照试剂与本发明试剂的检测原理不相同，所以在绘制图2时将对照试剂吸光 度变化做相反数处理。
[0055] 表2分析灵敏度实验结果
[0056]
[0057] 表2为分析灵敏度实验结果数据统计，实验样分析本发明试剂和对照试剂分析灵 敏度，
[0058] 标记物沉降监测
[0059] 由于标记物溶液为胶体溶液，所以在长时间静止放置后应验证其是否发生颗粒沉 降现象。本例目的在于验证本发明是否会存在标记物沉降现象。
[0060] 1、取两只50mL烧杯，用酸性重铬酸钾浸泡24小时后，用去离子水清洗干净，100°C 烘干处理4h。
[0061] 2、将对照试剂盒中的标记物试剂倒入其中一只烧杯中，将本发明试剂标记物倒入 另一只烧杯中，两只烧杯同时搅拌lh。
[0062] 3、用微量移液器在溶液表面2-5mm处分别吸取对照试剂和本发明试剂各60uL，并 用去离子水稀释只至3mL，震荡混合均匀。
[0063] 4、以去离子水作为参比，在540nm处检测两试剂标记物稀释后的吸光度，每个试 剂检测三次，以三次结果的均值，作为最终检测结果。
[0064] 5、将上述两只烧杯封口，2_8°C下静置每隔10天检测一次，重复上述步骤3和步骤 4,对比静置前后吸光度变化，实验结果如表3和图3所示。
[0065] 表3标记物沉降监测实验结果
[0066]
[0067] 标记物对反应杯污染实验
[0068] 由于标记物溶液为金颗粒胶体溶液，所以会在反应杯表面存在吸附现象。本例在 于验证本发明试剂是否会出现吸附污染现象。
[0069] 取三只洁净的石英比色杯，以空气为参比，分别记录其在540nm处杯空白吸光度。
[0070] 1、用本发明试剂标记物装填比色杯至其3/5高度处，浸泡lh。
[0071] 2、取出标记物后，每只比色杯用去离子水反复清洗10次
[0072] 3、在每只比色杯中装填去离子水至比色杯4/5高度处，每隔lh换水一次，共换水 三次。
[0073] 4、自然晾干比色杯中的水分，以空气为参比，检测每只比色杯在540nm处吸光度。
[0074] 5、对于对照试剂标记物重复上述步骤1至步骤5操作，比较两试剂标记物是否会 对比色杯造成吸附污染，实验结果如表4所示。
[0075] 表4标记物对比色杯污染实验数据
[0076]
[0077] 根据实验结果分析，对照试剂标记物长时间放置于比色杯中会吸附至比色杯表 面，本发明试剂标记物在相同时间内未对比色杯有明显的吸附现象。
【主权项】
1. 一种DD检测胶体金匀相免疫检测试剂盒，包括DD校准品，反应缓冲液试剂，胶体金 标记物试剂，其特征在于一种匀相定量检测检体中DD含量的基于胶体金比色法的体外诊 断试剂。2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于DD校准品是由校准品稀释液和DD蛋白 按照比例配制成不同浓度梯度，其浓度范围为0ng/L-30ng/L，反应缓冲液试剂是由磷酸盐 与牛血清白蛋白配制而成具有pH缓冲能力的溶液，胶体金标记物试剂是由金标记的抗人 源DD蛋白的抗体和悬浮标记物的缓冲液组成。3. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于胶体金颗粒的主吸收峰为450nm± 10nm。4. 根据权利要求1-3所述的试剂盒，其特征在于反应缓冲液试剂是反应条件的控制性 溶液，包括50mM PBS pH8. 0溶液，PEG6000-20000,聚蔗糖400和牛血清白蛋白等多聚物或 生物大分子中的一种物质或两种及其以上，并且控制反应缓冲液试剂的PH值为7. 0-9. 0。5. 根据权利要求1-3所述的试剂盒，其特征在于胶体金标记物试剂是反应条件的控制 性溶液，包括50mM PBS pH8. 0溶液，PEG6000-20000,聚蔗糖400,吐温20,牛血清白蛋白和 Triton X-100等多聚物或生物大分子中的一种物质或两种及其以上，将标记DD抗体后的 金颗粒悬浮于此溶液中，并且控制pH值应在7. 0-9. 0之间，组成胶体金标记物试剂。6. 根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于中标记DD抗体的金颗粒浓度合格的依 据为离子水或超纯水稀释胶体金标记物试剂50倍后，以去离子水或超纯水做空白，其在 540nm± IOnm 处的吸光度的范围为 0. 2000Abs-0. 3000Abs。7. 根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于反应体系溶液组成为校准液或样本、反 应缓冲液试剂和胶体金标记物试剂，其中样本量范围为2uL-20uL，反应缓冲液试剂的体积 应控制在2-10倍于胶体金标记物试剂的体积。8. 制备权利要求1. 7任意一项所述的试剂盒，其特征是DD蛋白胶体金匀相检测试剂盒 的制备方法，包括以下几个步骤： 1) 将多聚物或生物大分子用去离子水或超纯水溶解，配制成反应缓冲液试剂。 2) 将氯金酸与还原剂按照一定比例混合，随之用去离子水或超纯水加热煮沸，制的主 吸收峰为450nm±10nm的胶体金颗粒。 3) 将待标记的DD抗体与金颗粒相混合制成标记DD抗体-金标记物。 4) 将制成的标记物与不含有金颗粒的胶体金标记物试剂按照一定比例混合，制成检测 试剂盒所需要的胶体金标记物试剂 5) 将市售的人源DD蛋白按照所需浓度梯度，用校准品稀释液配制成浓度在Ong/ L-30ng/L L范围内的校准品，用于在仪器上配合反应缓冲液试剂和胶体金标记物试剂形成 校准曲线，以达到定量检测的目的。
【文档编号】G01N33/68GK105891505SQ201510144169
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2015年3月31日
【发明人】郭成志, 王志新
【申请人】北京科美生物技术有限公司